Method Article

蛍光標識マクロピノソームの定量のための自動イメージングおよび分析

DOI:

10.3791/62828

⸱

August 24th, 2021

 ,  ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, NCI-designated Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マルチウェルマイクロプレートを用いた自動アッセイは、単一の実験で多数の条件の評価を可能にすることによって経路調節因子を同定するための有利なアプローチである。ここでは、十分に確立されたマクロピノソームイメージングおよび定量プロトコルを96ウェルマイクロプレート形式に適合させ、マルチモードプレートリーダーを使用した自動化の包括的な概要を提供します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マクロピノサイトーシスは、バルクエンドサイトーシスを介して、細胞がタンパク質、病原体、および細胞破片などの大きな細胞外貨物を内在化させることを可能にする非特異的な液相取り込み経路である。この経路は、免疫応答および癌細胞代謝の調節を含む様々な細胞プロセスにおいて不可欠な役割を果たす。生物学的機能におけるこの重要性を考えると、細胞培養条件を調べることは、この経路の調節因子を特定し、新規治療アプローチの発見に使用される条件を最適化することによって、貴重な情報を提供することができる。この研究は、接着細胞における大ピノサイト指数の迅速な定量化のための標準的な実験装置および細胞イメージングマルチモードプレートリーダーを使用した自動イメージングおよび分析技術について記述している。この自動化方法は、高分子量蛍光デキストランの取り込みに基づいており、96ウェルマイクロプレートに適用して、1回の実験で複数の条件の評価を容易にするか、ガラスカバースリップに取り付けられた固定サンプルを容易にすることができます。このアプローチは、再現性を最大化し、実験の変動を低減しながら、時間を節約し、費用対効果を高めることを目的としています。

Introduction

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マクロピノサイトーシスの非特異的なエンドサイトーシス経路は、細胞外液およびその構成成分のバルク取り込みを通じて、細胞が栄養素、タンパク質、抗原、病原体を含む様々な細胞外成分をインターナライズすることを可能にする1。多くの細胞型の生物学にとって重要であるが、マクロピノサイトーシス経路は、マクロピノサイトーシスの取り込みを通じて、腫瘍細胞が栄養枯渇した微小環境の存在下で生存し増殖することができる腫瘍生物学において不可欠な役割を果たすことがますます説明されている2,3。アルブミンおよび細胞外マトリックス、ならびに壊死性細胞破片を含む細胞外巨大分子の取り込みは、マクロピノソームおよびリソソーム融合媒介貨物異化作用を介してアミノ酸、糖、脂質およびヌクレオチドを生成することによってバイオマス生産のための代替栄養源を提供する4,5,6,7,8。

マクロピノサイトーシスの誘導および調節は複雑であり、細胞の状況に応じて変化し得る。これまでに、マクロピノサイトーシスのいくつかの誘導物質が同定されており、リガンド、例えば上皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、ガレクチン-3、およびWnt3A9、10、11、12、13が含まれる。さらに、腫瘍微小環境を模倣する培養条件は、経路の活性化を誘発し得る。膵管腺癌(PDAC)腫瘍は、特にアミノ酸グルタミンのために栄養を奪われており、癌細胞と癌関連線維芽細胞(CAF)の両方が生存のためにマクロピノサイトーシスに依存する原因となります7,13,14,15。さらに、低酸素症や酸化ストレスなどの腫瘍ストレスは、この消去経路を活性化することができます16。マクロピノサイトーシスを誘導することができる多数の外因性インフルエンサーに加えて、様々な細胞内経路がマクロピノソーム形成を制御する。発癌性Ras媒介形質転換は、マクロピノシー機構を開始するのに十分であり、複数の癌型は発癌性Ras駆動構成的マクロピノサイトーシスを示す4,5,9,17。あるいは、野生型Ras活性化およびRas非依存性経路は、癌細胞およびCAFs10、11、15、18におけるマクロピノサイトーシスを活性化することが同定されている。インヒビター治療と組み合わせた様々なインビトロモデルの使用により、ナトリウム - 水素交換体、小型GTPase Rac1、ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)、p21活性化キナーゼ(Pak)、およびAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)を含むいくつかのマクロピノサイトーシスモジュレーターの同定がもたらされました4,13,15.しかし、マクロピノサイトーシスを調節する多数の記載された因子および条件を考えると、さらに多くのモジュレーターおよび刺激が未発見のままであると考えられる。新規モジュレーターおよび刺激の同定は、単一の実験における多数の条件の自動評価によって促進され得る。この方法論は、マクロピノソーム形成に関与する因子に光を当てることができ、この経路を標的とする新規小分子または生物製剤の発見を可能にする可能性がある。

ここでは、インビトロで癌細胞におけるマクロピノサイトーシスの程度を決定するための以前に確立されたプロトコルを96ウェルマイクロプレート形式に適合させ、自動化されたイメージングおよび定量化19,20。このプロトコールは蛍光顕微鏡法に基づいており、これはインビトロおよびインビボでマクロピノサイトーシスを決定する分野で標準となっている4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、18、 19,20,21,22。マクロピノソームは、高分子量デキストラン(すなわち、70kDa)2、3、4、20、21、22、23などの大きな巨大分子をインターナライズする能力を介して、他のエンドサイトーシス経路と区別することができる。したがって、マクロピノソームは、細胞外投与されたフルオロフォア標識70kDaデキストランの取り込みによって定義することができる。その結果、大ピノサイト小胞は、0.2〜5μmの大きさの蛍光穿刺の細胞内クラスターとして現れる。これらの穿刺を顕微鏡で画像化し、続いて定量化して、細胞内のマクロピノサイトーシスの程度(「マクロピノサイト指数」)を決定することができる。

このプロトコルでは、標準的な実験装置を使用して、96ウェルマイクロプレートおよびカバースリップ上に接着細胞中のマクロピノソームをインビトロで視覚化するための重要な手順が説明されています(図1)。加えて、細胞イメージングマルチモードプレートリーダーを用いたマクロピノサイト指数の画像取得および定量化を自動化するための指示が提供される。この自動化により、前述のプロトコルと比較して、時間、コスト、労力が削減されます19,20。さらに、意図せずに偏った画像の取得と分析を回避し、再現性と信頼性を向上させます。この方法は、異なる細胞型またはプレートリーダーに容易に適合させることができ、またはサイズ、数、および位置などの代替マクロピノソーム特徴を決定するために利用することができる。本明細書に記載の方法は、マクロピノサイトーシスを誘導する細胞培養条件のスクリーニング、新規モジュレーターの同定、または既知の阻害剤の薬物濃度の最適化に特に適している。

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図1:接着細胞における「大ピノサイト指数」を決定するための自動アッセイの概略図。バイオレンダーを使用して作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Protocol

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1. 材料の準備

  1. FITCまたはテトラメチルローダミン(TMR)で標識した70kDaデキストランをPBSに溶解し、20mg/mL溶液を得る。アリコートを-20°Cで保管する。
  2. DAPIをddH2Oに溶解し、1mg/mLの溶液を得る。アリコートを-20°Cで保管する。
    注意: DAPI は発がん性物質の可能性があるため、取り扱いには注意が必要です。








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Results

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上述のプロトコールのステップおよび調整がそれに応じて行われるとき、最終的な実験結果は、研究された細胞培養条件または阻害剤が、目的の細胞株におけるマクロピノサイトーシスを誘導または減少させるかどうかについての情報を提供するべきである。これらの知見の妥当性を強化するために、対照条件を含めることで、実験が正常に完了したかどうかを判断するために結果を精査することができる。マクロピノサイトーシス誘導対照は、マクロピノサイトーシスの相対レベルに関する情報を提供する。この目的のために、配位子EGFが最も一般的に使用される13。AsPC-1 PDAC細胞では、デキストランを添加する前にEGFを100ng/mLで5分間添加すると、マクロピノサイトーシスが活性化されます(図5A)。さらに、マクロピノサイトーシスのオートクリンEGF活性化は、16〜24時間にわたって細胞からグルタミンを奪うことによって誘導され得る(図5A)。あるいは、他の誘導物質は、細胞型および利用可能な文献に応じて組み込まれ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

実験とデータ収集の品質は、試薬の品質、設定の最適化、カバースリップとマイクロプレートの清浄度に大きく依存します。最終結果は、反復間の変動が最小限に抑えられるはずです。しかし、生物学的変異は自然に起こるか、そうでなければ多くの要因によって引き起こされる可能性があります。細胞密度は、細胞がマクロピノサイトーシス誘導剤または阻害剤に多かれ少なかれ応答する原因となり得る。したがって、プロトコルで提案されている80%のコンフルエンシーを遵守することが重要です。あるいは、96ウェルマイクロプレートで培地蒸発が起こることは、マイクロプレートメーカーによって十分に文書化されています。ここで、外側のウェルは内側のウェルに対してより多くの蒸発を受け、それによってマクロピノサイトーシスに影響を与え得る。したがって、分析に外側のウェルを含めず、代わりにこれらのウェルをPBSで満たして、内側のウェルを広範な蒸発から保護するための「バッファー壁」を構築するという選択を行うことができます。

各条件の画像を視覚的に検査して、集録が正常に完了したかどうかを判断することを強くお勧めします。これは、適用された設定が実際...

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Disclosures

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C.C.は、「マクロピノサイトーシスに関連する癌診断、治療薬、および創薬」と題する発行済み特許の発明者であり、特許第9,983,194号。

Acknowledgements

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この研究は、TRDRPポスドクフェローシップ賞(T30FT0952)の受賞者であるC.C. KMO.G.へのNIH/NCI助成金(R01CA207189、R21CA243701)によって支援されました。BioTek Cytation 5は、NCI Cancer Center Support Grant(P30 CA030199)から財政的支援を受けているSanford Burnham Prebys Cell Imaging Coreの一部です。図 1 ~ 3 は、BioRender を使用して作成されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% トリプシンコーニング25053CI0.1% EDTA HBSS w/o カルシウム、マグネシウム、重炭酸ナトリウム
1.5 mL マイクロ遠心チューブフィッシャーブランド05-408-129
10 cm 組織培養皿グライナー バイオワン664160CELLSTAR
15 mL 遠心分離チューブフィッシャーブランド07-200-886
2 L ビーカーフィッシャーブランド02-591-33
24ウェル組織培養プレートGreiner Bio-One662160CELLSTAR
25 mL 試薬リザーバージェネシー・サイエンティフィック・コーポレーション28-121
500 mL ビーカーフィッシャーブランド02-591-30
6cm 組織培養皿Greiner Bio-One628160CELLSTAR
8チャンネル吸引アダプターインテグラBiosciences155503
標準チップ用 8チャンネル吸引アダプターIntegra Biosciences159024
95% EthanolDecon Laboratories Inc4355226
アンモニアフリーガラスクリーナースパークルFUN20500CT
ブラック 96ウェル ハイコンテント スクリーニング マイクロプレートPerkinElmer6055300CellCarrier-96 Ultra
コットンチップアプリケーターFisherbrand23-400-101
カバースリップFisherbrand12-545-80直径12 mm
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBiotekCYT5FW
DAPIMillipore Sigma5.08741
Dextran 70 kDa - FITCLife TechnologiesD1822リジン固定可能
デキストラン 70 kDa - TMRLife TechnologiesD1819
DMSOミリポア シグマD1435
DPBSコーニング21031CVカルシウムとマグネシウム
の鉗子ファイン サイエンス ツール11251-20デュモン #5
ホルムアルデヒド、37%リッカ ケミカルRSOF0010-250AACS 試薬グレード
グリセロールフィッシャーBioReagentsBP229-1
硬化蛍光封入剤Agilent TechS302380-2DAKO
Hoechst 33342ミリポアシグマB2261
塩酸 (HCl)フィッシャーケミカルA144-212ACS Plus認証、36.5%–38.0%
リントフリーワイプキンバリークラーク34155Kimwipes
ミスクロスコープスライドフィッシャーブランド12-544-1プレミアムプレーンガラス
マルチチャンネルピペットギルソンFA100138チャンネル、0.5–10 µL
マルチチャンネルピペットGilsonFA10012 12チャンネル、20–200 µL
マルチチャンネルピペットギルソンFA100118チャンネル、20–200 µL
Parafilm MPechineyPM996
ラップカークランド シグネチャ208733ストレッチ タイト
シリコン アイソレーターGrace Bio Labs Inc664107直径 13 mm X 深さ 0.8 mm 内径 25 mm X 25 mm
スライド アダプターBiotek1220548
ウォッシュ ボトルフィッシャーブランドFB0340922C
なし ー

References

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