方法論記事

バキュロウイルス昆虫細胞培養システムを用いたアデノ関連ウイルス(AAV)2ベクターの製造と精製のためのプロセス開発

DOI：

10.3791/62829

⸱

2022年1月13日

 ,  ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、AAV2ベクターは、バキュロ ウイルス (BV)-AAV2-緑色蛍光タンパク質(GFP)または治療遺伝子およびBV-AAV2-Rep-cap感染したSf9細胞を懸濁培養中にSf9細胞と共培養することによって産生される。AAV粒子は、洗浄剤を使用して細胞から放出され、精製され、親和性カラムクロマトグラフィーによって精製され、接線流ろ過によって濃縮される。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アデノ関連ウイルス(AAV)は、遺伝子治療用途に有望なベクターです。ここで、AAV2ベクターは、BV-AAV2-GFP(または治療遺伝子)とBV-AAV2-rep-capを無血清懸濁液培養においてBf9細胞に感染させたSf9細胞を有する スポドプテラ・フルギペルダ (Sf9)細胞の共培養によって産生される。細胞は、軌道シェーカーまたはウェーブバイオリアクター内のフラスコで培養される。AAV粒子を放出するために、生産者細胞は、後に低速遠心分離および濾過によって明らかにされる洗剤を含む緩衝液中に取り込まれる。AAV粒子は、AAV粒子を結合するAVBセファローズカラムクロマトグラフィーを使用して細胞溶解物から精製される。結合粒子をPBSで洗浄し、pH3.0でクエン酸ナトリウムバッファーを使用して汚染物質を除去し、樹脂から溶出する。酸性溶出物はアルカリ性Tris-HCl緩衝液(pH-8.0)で中和し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、さらに接線流ろ過(TFF)で濃縮する。このプロトコルは、ヒト遺伝子治療用途向けの大規模臨床グレードのAAV製造に対するスケールアップと互換性のある小規模な前臨床ベクター産生を記述する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アデノ関連ウイルス(AAV)は、4.6kbの一本鎖DNAを含む非エンベロープヒトパルボウイルスである。AAVベクターは、遺伝子治療アプリケーション1、2、3、4に対する他のウイルスベクターに対していくつかの利点があります。AAV は自然にレプリケーションを行う必要がなっており、それにより、レプリケーションにはヘルパー ウイルスとホストマシンが必要になります。AAVは、感染した宿主3,5において疾患を引き起こせず、免疫原性が低い。AAVは静止細胞と積極的に分裂する細胞の両方に感染し、宿主細胞のゲノムに統合することなくエピソームとして持続する(AAVはめったに宿主ゲノムに統合しない)1,3。これらの特徴はAAVを遺伝子治療の適用のための望ましい用具にした。

AAV遺伝子導入ベクターを生成するために、治療用遺伝子を含むトランスジーンカセットは、2つの内部末端反復(ITR)の間でクローニングされ、こ....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコルの概要を示す図については、 図 1 を参照してください。

1. バキュロウイルスに感染したTIPS細胞の生成

  1. Sf9細胞のバイアルを1本解凍し、50mLの昆虫細胞培地にすぐに播種します。Sf9細胞を軌道シェーカーインキュベーターで125 rpmで成長させ、丸底フラスコでは28°C、空気8,9の交換用に緩く取り付けられたキャップを持つ。200 mLの培地を含む1Lフラスコで細胞を伝播し、TIPS細胞産生に十分な細胞を得る。
  2. 2つのフラスコに2 x 106 細胞/mLのSf9細胞の50 mLを加える:BV-AAV2-GFP(または治療遺伝子)の0.5 mLとBV-AAV2-rep-capの他のフラスコを有するSf9細胞の1フラスコに感染させる。
    注:AAVベクタープラスミドは、ロバート・M・コティン博士(NIH)によって寛大に提供されました。バキュロウイルスのバキュロウイルスの生産はバクミドDNA(Bac-to-Bacシステム)から8,9.通過中のバキュロウイルスの安定性は、rAAVのスケールアップ生産にとって重....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで、Sf9昆虫細胞系を用いたAAVベクターの製造および精製のためのプロセス開発の代表的な結果を示す。この方法は、Bf9細胞とバキュロウイルス感染したTIPS細胞の共培養、増殖培地を細胞に供給し、AAV粒子を放出する産生細胞の収穫および溶解、ヌクレアーゼ処理による細胞溶解物の明確化、遠心分離および濾過、AVBセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いたAAVの精製、および図1(図1)を有する濃度を含む。

TIPS細胞は、BV-AAV2-GFPまたは治療用遺伝子およびBV-AAV2-rep-capをSf9細胞に別々に感染させることによって生成される。Sf9細胞のほとんどは、複数の感染に起因する3〜4日間でバキュロウイルスに感染し、バキュロウイルス糖タンパク質gp64発現(図2)および細胞が直径の増加を示す(図3)。TIPS細胞は、感染後3〜4日採取され、凍結保存される。Sf9細胞は、ナイーブSf9.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAVベクターの製造、精製、および濃度のプロセス開発のためにこのプロトコルで使用されるパラメータは、遺伝子治療用途のためのAAVベクターの小規模および大規模な製造の両方に適用することができます。アップストリームおよびダウンストリームプロセス全体は、現在のグッドマニュファクチャリングプラクティス(cGMP)と互換性のある閉じたシステムで実行できます。Sf9-baculoウイルスシステムの主な利点は、手頃なコストで大規模なGMPグレードのAAV生産のためのスケーラビリティです。このシステムは、HEK293細胞を使用したAAVの製造に必要な高価なプラスミドおよびトランスフェクション試薬を必要としません。HEK293細胞とSf9細胞の両方が類似の品質AAVベクターを生成することが報告されている(エリックD.ホロウィッツ、ASGCT 2018、アブストラクト#100)。大きな課題は、このシステムは、かなりの時間と労力を必要とするバキュロウイルスとTIPS細胞の生成を必要とすることです。

このプロトコルでは、AAV遺伝子導入カセットを用いたバキュロウイルスを含むTIPS細胞とAAV-rep-c.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ロバート・M・コティン博士(NIH国立心臓・血液・肺研究所)がAAVプラスミドとダニエル・スティールとレベッカ・エルンスト(シンシナティ小児病院)に技術支援を提供してくれたことに感謝します。この作品は、シンシナティ児童研究財団からM.N.へのスタートアップ基金によって支援されています。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 N 水酸化ナトリウムSigma-Aldrich1.09137Akta Avant クリーニング用
2 L フラスコサーモフィッシャー サイエンティフィック431281懸濁培養用フラスコ
50 ml コニカルチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック14-959-49A上清の収集用
24 ウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック07-200-80接着細胞培養プレート
250 mLフラスコThermoFisher Scientific238071懸濁培養用フラスコ
Akta Avant 150 with Unicorn SoftwareCytiva28976337クロマトグラフィーシステム
AVB セファロース 高性能Cytiva28411210クロマトグラフィー培地
バキュロウイルス-AAV-2 GFP社内ノンカタログAAV転写ベクター
Baculovirus-AAV-2 rep-cap社内非カタログAAV包装ベクター
NucleaseSigma-AldrichE1014DNAおよびRNAを分解する酵素
ブロッキングバッファーSanta Cruz Biotechnologies516214細胞への非特異的抗体結合を防ぐブロッキング
細胞溶解バッファー社内カタログ外品20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、150 mM NaCl、0.5 % TitronX-100
セルバッグ 2 L および 10 LCytiva28937662バイオリアクターバッグ
クリーニングバッファー社内カタログ外品100 mM クエン酸 (pH 2.1) 
クライオバイアルトーマス・サイエンティフィック1222C24凍結保存用
DMEMSigma-AldrichD6429細胞株用増殖培地
溶出バッファー社内カタログ外品50 mM クエン酸ナトリウムバッファー (pH 3.0)
エタノールSigma-AldrichE7073クロマトグラフィーの消毒と保管用
ろ過ユニット ポールコーポレーション12941メンブレン
フィルターHT1080細胞株ATCCCCL-121線維芽細胞株
HyClone™SFX-昆虫培養培地CytivaSH30278.02無血清昆虫細胞増殖培地
ペリスタルティックポンプポールコーポレーションカタログ非カタログ品TFFポンプ
MaxQ 8000 オービタルシェーカーインキュベーター サーモフィッシャーサイエンティフィックカタログ外品懸濁培養用シェーカー
顕微鏡ニコンカタログ外品細胞モニタリング 
マウス抗バキュロウイルス gp64 PE 抗体Santa Cruz Biotechnologies65498 PESf9細胞におけるバキュロウイルス感染のモニタリング
酸素タンクPraxairカタログ外品40% Sf9細胞の増殖には酸素供給が必要
PBSサーモフィッシャーサイエンティフィック20012027ウォッシュバッファー
シルバー染色キットサーモフィッシャーサイエンティフィックLC6100染色 AAVカプシドタンパク質
Sf9細胞サーモフィッシャーサイエンティフィック11496-015昆虫細胞
ステイルウォーター社内カタログ外品Akta Avantクリーニング用
テーブルトップ遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック75253839/433607バキュロウイルス上清の清澄化用
タンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)カートリッジポールコーポレーションOA100C12AAV
Tris-HCl、pH 8.0ThermoFisher15568025アルカリ緩衝液
WAVEバイオリアクターシステム 20/50Cytiva28-9378-00バイオリアクター
バッファー を濃縮するTFFカートリッジ 溶出したAAV

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

AAV ProductionBaculovirus Insect SystemSf9 CellsAAV PurificationAVB Sepharose ChromatographyTangential Flow FiltrationCell Lysis BufferFlow CytometryGene Therapy VectorSuspension Cell Culture

関連記事