方法論記事

ラオデルファクス・ストリアテルス・サリヴァコレクション用2層膜サンドイッチ法

DOI：

10.3791/62831

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2021年8月27日

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

この記事について

サマリー

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本プロトコルは、人工培地を用いて穿刺吸引昆虫から十分な唾液を採取する方法を説明する。昆虫の唾液を採取し、昆虫の摂食行動やベクター媒介ウイルス感染に関する唾液機能を研究する便利な方法です。

要約

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東アジアの農業の著しい経済的損失を引き起こす米の縞(RSV)は、宿主米間の効果的な伝染のために昆虫ベクターに完全に依存している。 ラオデルファックスストリアテルス (小さな茶色の植物ホッパー、SBPH)は、フロエムから樹液を吸い込みながらRSVを水平に伝達する主要な昆虫ベクターです。唾液は昆虫の摂食行動に重要な役割を果たしている。ここでは、ピアス吸引の摂食行動を用いた昆虫の唾液の研究に役立つ便利な方法を説明します。この方法では、昆虫を2つの伸伸されたパラフィンフィルム層の間に挟まれた人工食を食べさせた。唾液を含む食事を毎日採取し、濾過し、さらに分析するために濃縮した。最後に、採取した唾液の質をタンパク質染色および免疫ブロット法で調べた。この方法は、SBPHの唾液中にRSVおよびムチン様タンパク質の存在を検出することによって例示した。これらの人工給餌および唾液採取法は、摂食行動およびウイルス感染に関連する昆虫唾液の要因に関するさらなる研究のための基礎となる。

概要

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テヌイウイルス属のネガ鎖RNAウイルスである米縞ウイルス(RSV)は、東アジア1、2、3における米生産において重篤な疾患を引き起こす。感染した稲植物から健康な稲植物へのRSVの伝染は、RSVを持続的に伝播させるラオデルファックスストリアテルスを中心に昆虫ベクターに依存する。SBPHは、RSV感染した植物に餌を与えた後、ウイルスを取得します。昆虫の中に入ると、RSVは摂食の翌日に中腸上皮細胞に感染し、中間腸の障壁を通過してヘモリンフを貫通する。その後、RSVは、ヘモリンパを介して異なる組織に広がり、その後伝播する。取得後約10〜14日の潜伏期間の後、唾液腺内のウイルスは分泌唾液を介して健康な宿主植物に伝染し、SBPHはフロエム4、5、6、7、8、9、10から樹液を吸い込む

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プロトコル

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1. SBPH メンテナンス

  1. 実験室でガラス室あたりの5-6米(オリザサティバ cv.日本ベア)の苗を持つガラスインキュベーター(65 x 200ミリメートル)で、ビールフェロスとRSVフリーのSBPH個体を飼育します。16時間光/8時間暗光周期で25°Cで稲を育てます。
    注:ウイルスとRSVフリーのSBPHの個人は、当初、中国の江蘇省で捕まえられました。
  2. SBPHのRSVを、RSVリボヌクレオタンパク質(RnPs)に対して発生させたウサギのRSV特異的ポリクローナル抗体( 材料表を参照)を用いて、ドット酵素結合免疫吸着測定法(ドット-ELISA)により検出します。
    注:高い子孫感染効率を確保するために、女性は別々に維持され、子孫の15%がRSV感染について無作為に試験された。ドットELISAの詳細は、ステップ1.3-1.7で説明されています。
  3. コーティングバッファーの 20 μL でシングル SBPH を均質化します (0.05 M Na2CO3-NaHCO3、 pH 9.5)。ナイロン膜に3μLを入れ( 材料表を参照)、室温(RT)で膜を乾燥させます。
  4. 15 mLのブロッキングバッファー(PBS + 3%スキムミルク)を室温で30分間インキュベートします。
  5. PBSの1....

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結果

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人工給餌設備と唾液採取の概略図
図1A は、唾液を回収するための給餌室として使用されるガラスシリンダー(15cm x 2.5cm)を示しています。まず、SBPH幼虫は、回収効率を向上させるために数時間飢えさせ、5分間冷却して固定化した。昆虫がガラスシリンダーに移された後、チャンバーの両方の開いた端部は伸びたパラフィン膜で覆われていた。一方の端で、200 μLの 5%スクロースを、元の面積の約2倍に広げたパラフィン膜の2層に挟んだ(図1B)。部屋はホイルで覆われていましたが、人工食で終わりは光にさらされました。SBPHは光性の挙動を示すため、最後に集まった飢えた昆虫は光にさらされ、伸ばされた内パラフィン膜を通して人工食事溶液に供給された。それに基づいて、唾液は毎日採取された人工食事に放出される可能性があります。パラフィルムダイエットデバイスは、毎日新しいものに置き換えられました。このようにして、人工食を5日間から2週間採取し、その後、サンプル全体を10KD遠心フィルターを用いて最終.......

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ディスカッション

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人工食餌上の昆虫の飼育に成功したのは、1962年にミットラーとダッドが人工食29,30を保持するパラフィン膜技術を説明した時に最初に報告された。そして、この方法は、昆虫の生物学や行動の多くの側面で探求されている,例えば栄養補助食品, dsRNAの摂食, ウイルス獲得.唾液分析の要件に基づいて、5%スクロースは、この研究でSBPHの唾液を収集するための一般的な人工食事として使用されます。唾液の収集を成功させるためには、いくつかの重要なステップがここで注目に値します。まず、実験用昆虫をチャンバーに導入する前に飢えさせ、唾液採取の効率を確保する必要がある。第二に、スイート環境を模倣するために、2層パラフィンサンドイッチが作られる。SBPHが人工食を食べる場合、食餌に直面して内側に唾液鞘が形成され、その後水性唾液が分泌される。第三に、人工培地を収集し、収集したサンプル中の微生物汚染を低減するために時間内に交換する必要があります。最後に、人工食生活を変えながら昆虫の損失を避けるためには、4°Cで5分間の昆虫を麻酔することが不可欠で.......

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開示事項

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著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

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この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFC1200503)、中国国立科学財団(32072385第32072385)、青少年イノベーション促進協会CAS(2021084)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10-KD遠心フィルターメルクミリポアR5PA83496濃縮用
10x タンパク質転写バッファー(ウェット)macGENEMP008ウェスタンブロッティング用転写バッファー
10x TBST バッファーCoolaberSL1328-500mL ×10ウェスタンブロッティング用ウォッシュバッファー
Azure c600 biosystemsAzure BiosystemsAzure c600ウェスタンブロッティングおよび銀染色用イメージングシステム
カラー 染色済みタンパク質ラダーGenStarM221-01ウェスタンブロッティング用タンパク質マーカー
ECL ウェスタンブロッティング検出試薬GE HealthcareRPN2209ウェスタンブロッティング検出
エンチャンシャルHRP-DAB 発色キットTIANGEN発色反応
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体シグマ401393-2MLウェスタンブロッティング用ポリクローナル二次抗体
イモビビロン(R)-P ポリフッ化ビニリデンメルクミリポアIPVH00010ウェスタンブロッティング用トランスファーメンブレン
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR)
キット,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891逆転写 PCR (RT-PCR)
Millex-GP フィルター, 0.22 & micro;mMerck MilliporeSLGP033RBろ過用
Mini-PROTEAB TGX GelsBio-Rad4561043SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-Wタンパク質濃度の検出
ナイロン膜PALLT42754ドットELISA
パラフィルムMembrane SigmaP7793-1EA人工食法サンドイッチ
LssgMPペプチドに対するウサギ抗LssgMPポリクローナル抗体GenstriptRabbit ウェスタンブロッティング用一次抗LssgMPポリクローナル抗体
ウサギ抗RSVポリクローナル抗体GenstriptRabbit ウェスタンブロッティングおよびドットELISA
RNAprep pureマイクロキットRNA抽出用
#PA110 メンブレン 用膜 M 抗LssgMPポリクローナル抗体

参考文献

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  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Vir....

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