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方法論記事

ラオデルファクス・ストリアテルス・サリヴァコレクション用2層膜サンドイッチ法

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DOI:

10.3791/62831

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2021年8月27日

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

この記事について

サマリー

本プロトコルは、人工培地を用いて穿刺吸引昆虫から十分な唾液を採取する方法を説明する。昆虫の唾液を採取し、昆虫の摂食行動やベクター媒介ウイルス感染に関する唾液機能を研究する便利な方法です。

要約

東アジアの農業の著しい経済的損失を引き起こす米の縞(RSV)は、宿主米間の効果的な伝染のために昆虫ベクターに完全に依存している。 ラオデルファックスストリアテルス (小さな茶色の植物ホッパー、SBPH)は、フロエムから樹液を吸い込みながらRSVを水平に伝達する主要な昆虫ベクターです。唾液は昆虫の摂食行動に重要な役割を果たしている。ここでは、ピアス吸引の摂食行動を用いた昆虫の唾液の研究に役立つ便利な方法を説明します。この方法では、昆虫を2つの伸伸されたパラフィンフィルム層の間に挟まれた人工食を食べさせた。唾液を含む食事を毎日採取し、濾過し、さらに分析するために濃縮した。最後に、採取した唾液の質をタンパク質染色および免疫ブロット法で調べた。この方法は、SBPHの唾液中にRSVおよびムチン様タンパク質の存在を検出することによって例示した。これらの人工給餌および唾液採取法は、摂食行動およびウイルス感染に関連する昆虫唾液の要因に関するさらなる研究のための基礎となる。

概要

テヌイウイルス属のネガ鎖RNAウイルスである米縞ウイルス(RSV)は、東アジア1、2、3における米生産において重篤な疾患を引き起こす。感染した稲植物から健康な稲植物へのRSVの伝染は、RSVを持続的に伝播させるラオデルファックスストリアテルスを中心に昆虫ベクターに依存する。SBPHは、RSV感染した植物に餌を与えた後、ウイルスを取得します。昆虫の中に入ると、RSVは摂食の翌日に中腸上皮細胞に感染し、中間腸の障壁を通過してヘモリンフを貫通する。その後、RSVは、ヘモリンパを介して異なる組織に広がり、その後伝播する。取得後約10〜14日の潜伏期間の後、唾液腺内のウイルスは分泌唾液を介して健康な宿主植物に伝染し、SBPHはフロエム4、5、6、7、8、9、10から樹液を吸い込む.効率的な供給プロセスと唾液の様々な要因は、昆虫から宿主植物へのRSVの普及に不可欠です。

唾液腺から分泌される昆虫唾液は、昆虫、ウイルス、宿主植物を媒介すると考えられている。片虫虫は通常、唾液の2つのタイプを生成する:唾液と水性唾液11、12、13をゲル化する。ゲル化唾液は主に、宿主細胞間のスタイの動きを維持するためにアポプラズムに分泌され、また、植物抵抗性および免疫応答14、15、16、17を克服することに関連している。摂食の調査段階では、昆虫は断続的にゲル化唾液を分泌し、すぐに酸化されて表面フランジを形成する。次に、単一または分岐したシースは、管状チャネル18、19、20を予約するためにスキャレットを包み込む。表皮上の表面フランジは、アンカーポイントとして機能することによりスタイレットの浸透を促進すると推測され、一方、スタイレットの周囲の鞘は、機械的安定性および潤滑16、21、22、23を提供し得る。Nlshpは、唾液鞘形成および褐色植物ホッパーの供給に成功した(ニラパルバタルゲン、BPH)に必須のタンパク質として同定された。アブラムシアシルトシフォンピスムによって分泌される構造シースタンパク質(SHP)の発現の阻害は、宿主篩管24からの送出を妨害することによってその繁殖を減少させた。さらに、一部の昆虫種では、ゲル唾液因子は、いわゆる草食動物関連分子パターン(HAMPs)を形成することによって植物の免疫応答を引き起こすと考えられている。N.ルゲンでは、外装形成に関連するムチン様タンパク質であるNlMLPは、細胞死、防御関連遺伝子の発現、およびカロロース沈着25,26を含む摂食に対する植物防御を誘導する。また、アブラムシのゲル唾液因子の一部は、病原体関連分子パターン12、15、27と同様の遺伝子間相互作用を介して植物防御応答を引き起こすことが証明されている。

昆虫の餌や病原体の伝染に不可欠な唾液因子を研究するためには、分泌された唾液を分析する必要があります。ここで、十分な量の唾液を得るための人工給餌および採取方法が、さらなる分析のために説明される。単一の栄養元素のみを含む培地を用いて、多くの唾液タンパク質を採取し、銀染色およびウェスタンブロッティングによって分析した。この方法は、SBPHによるRSV伝達に不可欠な唾液の因子に関するさらなる研究に役立ちます.

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プロトコル

1. SBPH メンテナンス

  1. 実験室でガラス室あたりの5-6米(オリザサティバ cv.日本ベア)の苗を持つガラスインキュベーター(65 x 200ミリメートル)で、ビールフェロスとRSVフリーのSBPH個体を飼育します。16時間光/8時間暗光周期で25°Cで稲を育てます。
    注:ウイルスとRSVフリーのSBPHの個人は、当初、中国の江蘇省で捕まえられました。
  2. SBPHのRSVを、RSVリボヌクレオタンパク質(RnPs)に対して発生させたウサギのRSV特異的ポリクローナル抗体( 材料表を参照)を用いて、ドット酵素結合免疫吸着測定法(ドット-ELISA)により検出します。
    注:高い子孫感染効率を確保するために、女性は別々に維持され、子孫の15%がRSV感染について無作為に試験された。ドットELISAの詳細は、ステップ1.3-1.7で説明されています。
  3. コーティングバッファーの 20 μL でシングル SBPH を均質化します (0.05 M Na2CO3-NaHCO3、 pH 9.5)。ナイロン膜に3μLを入れ( 材料表を参照)、室温(RT)で膜を乾燥させます。
  4. 15 mLのブロッキングバッファー(PBS + 3%スキムミルク)を室温で30分間インキュベートします。
  5. PBSの15mLで15mLのRSVに対して希釈された一次ウサギ抗体で膜をインキュベートし、毎回5分間のインキュベーションのためにPBSで3回洗浄します。
  6. 15 mLのPBSで1.5μLの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体( 材料表を参照)で膜をインキュベートし、毎回5分間のインキュベーションのためにPBSで3回洗浄します。
  7. メーカーが提供するプロトコルに従って、強化されたHRP-DAB発がん性キット( 材料表を参照)を使用して免疫ブロットを開発します。

2. 摂食室と人工食の準備

  1. 2gのスクロース粉末を秤量し、40mLのddH2Oに溶解し、人工食餌として5%スクロース水溶液を調製する。
  2. 0.22 μmのフィルター( 材料表を参照)を通して溶液をフィルターして、細菌の汚染や不純物を除去します。
  3. 部屋にそれらを導入する前に3-5時間のための3rd-5th SBPH幼虫をスターブ。
    注:200 SBPHは1つの部屋のために準備される;より多くのSBPHは、いくつかのチャンバーのために準備する必要があります。
  4. ガラスシリンダーを給餌室として準備します(図1A)。実験昆虫を導入する前に、チャンバーの1つの開いた端をパラフィン膜( 材料表を参照)で覆います。
    注:各シリンダーは長さ15.0cm、直径2.5cmです。これらのガラスシリンダーは実験の条件に従ってカスタムメイドである。
  5. 昆虫をガラスシリンダーに移す。
  6. 伸ばされたパラフィン膜(具体的には、パラフィルムM)でチャンバーの反対側を覆う。その後、200 μLの人工食を加えます。最後に、伸ばしたパラフィン膜の別の層で液体を覆います。
    注:パラフィン膜は元の面積の約2倍まで伸ばされています。
  7. チャンバーをアルミホイルで覆うが、人工ダイエット装置を光にさらして最後を残す。

3. SBPH唾液の回収

  1. 24時間の期間の終わりにRSVフリーとビレスフィアSBPHから人工食事を収集します。
  2. 4°Cでシリンダーを冷却し、昆虫を固定化します。
  3. 外側のフィルムを発見し、1.5 mLの無菌チューブに無菌ピペットを使用して人工食餌液を収集します。採取した唾液は分析まで-80°Cに保ちます。
    注:採取した唾液は-80°Cで1年間保存することができました。
  4. 50μLの新鮮な人工食で内膜を柔らかくピペットで3回洗い流し、ステップ3.3に記載した人工洗浄食を収集する。新しい人工食を内膜に置き、上に伸ばした新しいパラフィン膜を保ちます。
  5. 5 日間から 2 週間の手順 3.2 と 3.3 を繰り返します。
    注:人工給餌SBPHの生存率をカウントし、生存率に応じて新鮮なSBPHの十分な補充を確保します。
  6. 収集したサンプルを0.22 μmのフィルターユニットでフィルターし、微生物やその他の汚染物質を除去します。

4. 採取した唾液の濃度

  1. 採取した唾液サンプルを0.5 mL 10 kD遠心フィルター(材料表を参照)で移し、4°Cで5,500 x g で20分間スピンします。上清を集めて最終ボリュームを100μLにします。
  2. ステップ4.3-4.6に従って適切なUV-Vis分光光度計を使用して、採取した唾液の濃度を測定する。
  3. 分光光度計をオンにし、ddH2Oでペダーを3回洗います。
  4. 画面で適切な順序で次のオプションを選択 |プロテイン A280 |タイプ|の選択1腹筋 = 1 mg/mL.次に、[ ベースライン補正 340 nm]チェックボックスをオンにします。
  5. 5%のスクロース水溶液をブランクとして2μLロードし、画面下部の ブランク をタッチします。
  6. 標準を設定した後、測定のために収集した唾液の2μLをロードします。タンパク質濃度を読み取り、記録します。
    注:唾液タンパク質の1mgは、最終的に少なくとも合計で収集されました。

5. 唾液タンパク質の銀染色

  1. サンプルローディングバッファー(50 mM Tris-HCl pH 6.8、10%グリセロール、2%SDS、0.1%ブロモフェノールブルー、および1%βメルカプトエタノール)を使用して、昆虫唾液サンプルからタンパク質を抽出します。次に、それを 10% SDS-PAGE で分数します ( 資料表を参照)。5%のスクローセ水溶液をネガティブコントロールと同様にして処理した溶液をロードする。
  2. サンプルの20 μLのアリコートを、SDS-PAGEゲルに、先に染色されたマーカーと一緒にロードします。90ボルトで15分間ゲルを実行し、140ボルトで50分実行します。
  3. ゲルを30%(vol/vol)エタノール、10%(vol/vol)酢酸を電気泳動後30分以上固定します。
  4. ゲルを20%(vol/vol)エタノールで2回リンスし、水を毎回10分間ずつ別々にすすます。
  5. 0.8 mMチオ硫酸ナトリウムでゲルを1分間感作し、その後1分間水で2回洗い流します。
  6. ゲルを12 mMの硝酸銀に1時間浸し、10秒間脱イオン水に浸してから現像液に移します。
  7. ゲルの背景が暗くなったら、ゲルを停止液(5%酢酸)に浸し、少なくとも30分間、反応を停止させます。
  8. ゲルを水で2回洗い、毎回30分間洗います。検出システムで画像を開発します( 資料一覧を参照)。

6. ウェスタンブロッティングによるタンパク質検出

  1. SBPH(LssgMP)とRSVの唾液ムチン様タンパク質を、それぞれ特異的抗体を用いてウェスタンブロットで検出する。
  2. ステップ5.1に続いて昆虫唾液サンプルを治療する。
  3. サンプルの20 μLアリコートを、10%SDS-PAGEゲルに、前染色マーカーと共に、20 μL RSV非感染唾液サンプルを陰性対照としてロードします。90ボルトで15分間ゲルを実行し、140ボルトで50分間実行します。
  4. 10xタンパク質転写バッファー(湿式)の100mL(湿式)を900mLのddH2Oを働く溶液(1x)に混ぜ、次にタンパク質転写バッファー(1x)を用いてポリビニリデンジフルオリド膜にタンパク質を移管する。
  5. 0.01 Mトリス緩衝生理食酒食糸で5%スキムミルクで膜をブロックし、室温(RT)で0.05%Tween 20(TBST)を1時間ブロックします。
    注: このプロトコルでは、100 mL の 10x TBST (資料表を参照) と 900 mL の ddH2O を作業ソリューションに混ぜます。
  6. RSVまたはLssgMPに対する一次ウサギ抗体(両方とも1:10000)をRTで少なくとも2時間、TBSTで希釈して膜をインキュベートする。
    注: RSVに対する一次抗体の産生は、上記で述べた。バイオテクノロジー企業は、LssgMPペプチドGIQFDSYSASDLTRCに対してウサギの抗LssgMPポリクローナル抗体を産生しました。
  7. 膜をTBSTで3回洗浄し、毎回10分間のインキュベーションを行います。
  8. 1:10000 TBSTで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体で膜をインキュベートします。
  9. 強化された化学発光ウェスタンブロッティング検出システムを備えた免疫ブロットを開発します。

7. SBPHにおけるLssgMP発現パターンの検出

  1. 4°Cで5分間固定化します。
  2. 75%エタノールとddH2Oを1つずつで昆虫を洗い、次に冷蔵TBS(0.01 Mトリス緩衝生理液)で昆虫を解剖します。
  3. 鉗子によってコクサトロシャンターの接合部でSBPHの前足を切断しながら腹部から昆虫を解剖;中腸と唾液腺を結核で2回洗い、水リンから汚染を取り除きます。
  4. 5つの組織を1.5 mLのRNaseフリーチューブに入れ、RNAを抽出します。各チューブを1つのサンプルと考えてください。
  5. メーカーのプロトコルと逆転写 PCR (RT-PCR) に従って RNA 抽出を実行します ( 資料表を参照)。
  6. 定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行い、L.ストリアテルスの全身または様々な組織の抽出物におけるLssgMPの相対的な転写発現レベルを調べる。
    注:遺伝子増幅に使用されたプライマーペアはLssgMP-q-F/LssgMP-q-Rであり、SYBRグリーンベースのqPCRはメーカーのプロトコルに従って行われました。L. ストリアテルス翻訳伸長因子2(ef2)の転写レベルを、cDNAテンプレートの正規化のためにプライマーペアef2-q-F/ef2-q-Rで定量した。そして、プライマー配列は以下に添付されています:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACACAG;LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTATTCC;ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTTTTT;ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATAtTTTTTTT.

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結果

人工給餌設備と唾液採取の概略図
図1A は、唾液を回収するための給餌室として使用されるガラスシリンダー(15cm x 2.5cm)を示しています。まず、SBPH幼虫は、回収効率を向上させるために数時間飢えさせ、5分間冷却して固定化した。昆虫がガラスシリンダーに移された後、チャンバーの両方の開いた端部は伸びたパラフィン膜で覆われていた。一方の端で、200 μLの 5%スクロースを、元の面積の約2倍に広げたパラフィン膜の2層に挟んだ(図1B)。部屋はホイルで覆われていましたが、人工食で終わりは光にさらされました。SBPHは光性の挙動を示すため、最後に集まった飢えた昆虫は光にさらされ、伸ばされた内パラフィン膜を通して人工食事溶液に供給された。それに基づいて、唾液は毎日採取された人工食事に放出される可能性があります。パラフィルムダイエットデバイスは、毎日新しいものに置き換えられました。このようにして、人工食を5日間から2週間採取し、その後、サンプル全体を10KD遠心フィルターを用いて最終...

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ディスカッション

人工食餌上の昆虫の飼育に成功したのは、1962年にミットラーとダッドが人工食29,30を保持するパラフィン膜技術を説明した時に最初に報告された。そして、この方法は、昆虫の生物学や行動の多くの側面で探求されている,例えば栄養補助食品, dsRNAの摂食, ウイルス獲得.唾液分析の要件に基づいて、5%スクロースは、この研究でSBPHの唾液を収集するための一般的な人工食事として使用されます。唾液の収集を成功させるためには、いくつかの重要なステップがここで注目に値します。まず、実験用昆虫をチャンバーに導入する前に飢えさせ、唾液採取の効率を確保する必要がある。第二に、スイート環境を模倣するために、2層パラフィンサンドイッチが作られる。SBPHが人工食を食べる場合、食餌に直面して内側に唾液鞘が形成され、その後水性唾液が分泌される。第三に、人工培地を収集し、収集したサンプル中の微生物汚染を低減するために時間内に交換する必要があります。最後に、人工食生活を変えながら昆虫の損失を避けるためには、4°Cで5分間の昆虫を麻酔することが不可欠で...

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開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFC1200503)、中国国立科学財団(32072385第32072385)、青少年イノベーション促進協会CAS(2021084)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10-KD遠心フィルターメルクミリポアR5PA83496濃縮用
10x タンパク質転写バッファー(ウェット)macGENEMP008ウェスタンブロッティング用転写バッファー
10x TBST バッファーCoolaberSL1328-500mL ×10ウェスタンブロッティング用ウォッシュバッファー
Azure c600 biosystemsAzure BiosystemsAzure c600ウェスタンブロッティングおよび銀染色用イメージングシステム
カラー 染色済みタンパク質ラダーGenStarM221-01ウェスタンブロッティング用タンパク質マーカー
ECL ウェスタンブロッティング検出試薬GE HealthcareRPN2209ウェスタンブロッティング検出
エンチャンシャルHRP-DAB 発色キットTIANGEN発色反応
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体シグマ401393-2MLウェスタンブロッティング用ポリクローナル二次抗体
イモビビロン(R)-P ポリフッ化ビニリデンメルクミリポアIPVH00010ウェスタンブロッティング用トランスファーメンブレン
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR)
キット,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891逆転写 PCR (RT-PCR)
Millex-GP フィルター, 0.22 & micro;mMerck MilliporeSLGP033RBろ過用
Mini-PROTEAB TGX GelsBio-Rad4561043SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-Wタンパク質濃度の検出
ナイロン膜PALLT42754ドットELISA
パラフィルムMembrane SigmaP7793-1EA人工食法サンドイッチ
LssgMPペプチドに対するウサギ抗LssgMPポリクローナル抗体GenstriptRabbit ウェスタンブロッティング用一次抗LssgMPポリクローナル抗体
ウサギ抗RSVポリクローナル抗体GenstriptRabbit ウェスタンブロッティングおよびドットELISA
RNAprep pureマイクロキットRNA抽出用
#PA110 メンブレン 用膜 M 抗LssgMPポリクローナル抗体

参考文献

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