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方法論記事

ロボットアームを用いたハイスループットスクリーニングのための トキソプラズム原虫 および ネオスポラカニム におけるヌクレオシド三リン酸加水分解酵素アッセイ

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DOI:

10.3791/62874

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2022年7月22日

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1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

トキソプラズマ原虫 感染症と ネオスポラ・カニナム 感染症は、ヒトや動物に見られ、深刻な健康問題を引き起こします。この2つの寄生虫は、類似したヌクレオシド三リン酸加水分解酵素を共有し、増殖と生存に重要な役割を果たしています。私たちは、ロボットアームの使用を必要とする酵素の高水準のアッセイを確立しました。

要約

原虫寄生虫は、人間や多くの温血動物に感染します。主要な原虫寄生虫であるトキソプラズマ原虫は、HIV陽性患者、臓器移植レシピエント、妊婦によく見られ、深刻な健康状態であるトキソプラズマ症を引き起こします。トキソプラズマ原虫と多くの類似点を持つ別の主要な原生動物であるNeospora caninumは、動物に深刻な病気を引き起こし、犬や牛の脳脊髄炎や筋炎-多発性神経根炎を引き起こし、子牛を死産させます。これらはすべて、同様のヌクレオシド三リン酸加水分解酵素(NTPase)を示しました。Neospora caninumはNcNTPaseを、トキソプラズマgondiiはTgNTPase-Iを保有する。酵素は、繁殖と生存に重要な役割を果たすと考えられています。原虫感染を予防する化合物や抽出物を確立するために、これらの酵素を標的とした創薬を行いました。次のステップは、従来の生化学的酵素アッセイと蛍光アッセイを組み合わせてADP含有量を決定することにより、新規で高感度かつ高精度なアッセイを確立することでした。また、この新規アッセイが、2つの原虫酵素のハイスループットスクリーニング(HTS)を実施するための基準を満たしていることも検証しました。HTSを行い、2つの合成化合物ライブラリーから19種類の化合物を、6種類の抽出物を、海洋細菌由来の抽出ライブラリーをそれぞれ同定しました。本研究では、HTSの実施方法について、試薬やデバイス、ロボットアームなどの調製に関する情報も含めて、詳しく解説しています。

概要

ロボティクスは、生化学、分子生物学、臨床研究など、産業工学や製造工学を超えたさまざまな分野、特にHTS 1,2,3で大きなブレークスルーを達成するための洗練された強力なツールとして確立されています。トキソプラズマ原虫は、主要な寄生虫であり、単一細胞の寄生真核生物4であり、ヒト5および多くの恒温動物4に深刻な健康問題を引き起こし、エイズ患者6、臓器移植レシピエント7、および妊婦8において特に重篤な状態であるトキソプラズマ症につながる感染症を引き起こします。Phylum Apicomplexa9に属するNeospora caninumは、主に犬と牛6に感染し、その結果、犬10,11の脳脊髄炎と筋炎-多発性神経根炎、牛12,13の流産を引き起こします。さらに、Neospora caninumは、Toxoplasma gondiiの形態学的および系統発生的に類似性を示しています9,14。さらに、それらはヌクレオシド三リン酸加水分解酵素(NTPase;EC3.6.1.15)14.この酵素は、従来のecto-ATPase14とは大きく異なります。これらの寄生虫は、全タンパク質の2%〜8%にあたるNTPアーゼタンパク質を大量に生成し、タキゾイトステージ15で休眠酵素として重要な役割を果たします。緻密な分泌顆粒では、これらは凝縮16され、寄生胞16に分泌されることに留意すべきである。生化学的酵素特性として、NTPaseはジチオスレイトール17によって活性化されます。ジチオール化合物などの誘導物質、ジチオールジスルフィド酸化還元酵素などの未同定の酵素、およびその他の酵素も同様の性質を示すと予測されています。それらはまだ寄生虫で特定されていません。しかし、この酵素は、感染した宿主細胞からタキゾイトを放出する上で重要な役割を果たしている17。

トキソプラズマ原虫には、I型酵素TgNTPase-IとII型酵素TgNTPase-II18の2つのNTPaseアイソフォーム18があります。前者は、基質18として三リン酸ヌクレオシドを優先的に利用する。後者は、三リン酸ヌクレオシドと二リン酸ヌクレオシドの両方を加水分解します18。相同性はアミノ酸レベル18で97%です。Neospora caninumは、NcNTPase19という名前のTgNTPase-Iのオルソログも持っています。相同性はアミノ酸レベル19で73%です。浅井教授と原田教授は、大腸菌を用いて両NTPaseの組換え体を作製し、これらの構成活性変異体を以前に報告した20。彼らは親切にも2人のアクティブミュータントに贈り物をしました。どちらの酵素もin vitroでATPをADPに変換できます20。ごく最近、酵素によって加水分解されたADP含有量を使用してNTPaseの活性を測定しました。最後に、以前に報告されたように、蛍光反応と酵素反応の組み合わせでADP含有量を決定するプロセスを通じて、高水準のアッセイを確立することに成功しました21,22。また、ハイスループットスクリーニング(HTS)22も行いました。

本研究では、新しい高精度・ダイナミックレンジアッセイ21 の詳細な手順を紹介するとともに、HTS用ロボットアームを用いて酵素活性を測定し、蛍光強度を発生させるための試薬の調製方法について詳細に解説する。

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プロトコル

1. 組換えTgNTPase-IおよびNcNTPaseの発現と精製

  1. 発現プラスミドを調製し、 大腸菌 に導入します。BL21株。
    注:構成と手順に関する詳細な情報は、以前のレポート14に示されている。本研究では、浅井教授と原田教授のご厚意により、TgNTPase-IとNcNTPaseの構成的に活性な変異体を贈呈しました。

2. バイオ蛍光反応液の調製とプレート上への配置

  1. 表1に記載されているように、384ウェルフォーマットの400ウェルアッセイ用の2 mLのマスターミックスに対して2倍バイオ蛍光反応溶液を調製します。
  2. レサズリンとN-エチルマレイミドを除く各指示濃度について、蒸留水(DW)を使用してストック溶液を調製します。残りの2つの試薬をDMSOで適切な濃度で溶解します。その後、実験を行う時間まで試薬を-30°Cで保存します。
  3. 15 μLの2倍バイオ蛍光反応溶液を368ウェル(384ウェルフォーマット)のそれぞれに加えます。
    注:最初のプレートは、実験を2回行うのに十分な試薬を保持するためのリザーバーとして機能します。

3. アッセイプレートの各ウェルの底に試験化合物または抽出物を置きます

  1. 各化合物(試験化合物を含む)をライブラリマザープレートのロボットアームを使用して、プレートの底に0.5 μLを入れます。
  2. 0.5 μL の DMSO をネガティブコントロールとポジティブコントロールの両方に添加します。

4.酵素反応混合物の調製と反応の開始

  1. 表2に示すように酵素反応溶液を調製します。
  2. 酵素反応混合物50 mLにNTPase(最終濃度0.0002 μg/mL)を添加し、迅速に混合してプラスチックリザーバーに移します。
  3. ロボットアームを使用して、ネガティブコントロールラインを除く各ウェルに4.5μLを同時に注入します。
  4. 同時注入に先行する酵素の代わりに、PBSと同量の酵素反応混合物を追加します。.
  5. プレートを37°Cのインキュベーターに10分間置きます。

5. マイクロプレートリーダーによる酵素活性のリアルタイム測定

  1. 10分間のインキュベーション後、すぐにロボットアームを使用して、5 μLの2倍バイオ蛍光反応溶液を各ウェルに同時に加えます。
  2. ロボットアームを一時的に停止して、プレートを配置する場所に各先端の溶液を保持します。
  3. アッセイプレートが所定の位置に配置されたら、ロボットアームを再起動します。
    注:生成されたADPの飽和を避けるために、すぐに蛍光強度を測定してください。
  4. プレートを素早くスピンダウン(200 x g で1分間)し、プレートリーダーにセットします。
  5. 1時間ごとに540 nm/590 nm(励起/発光)の蛍光のリアルタイム測定を開始します。

6. 結果の分析

  1. 各実験グループで示され±複製されたサンプルからの平均(SEM)の平均および標準誤差として値を計算します。一貫性を確保するために実験を複製します。
  2. スチューデントの t検定を使用して統計的有意性を実行します。
  3. P 値が P < 0.05 の場合、値を統計的に有意な値として計算します。
  4. 次の式を使用して、S/B(S/B)、S/N(S/N)、およびZ'ファクターを計算します。
    S/B = 平均配位子/平均車両
    S / N =(平均配位子-平均車両)/標準偏差車両
    Z'-係数 = 1 - (3 x 標準偏差配位子 + 標準偏差車両)/(平均配位子 - 平均車両)
  5. S/B、S/N、および Z' ファクターがそれぞれ 3、10、0.5 より大きいことを確認します。
    注:各実験が、以前のレポート23,24で述べたように、HTSを行うのに十分な一般的な基準を満たしているかどうかを確認します。

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結果

アッセイの原理は、補足図1に要約されており、以前のレポート12,18に基づいています。このアッセイは、図1に示すように384ウェルフォーマットで設計されました。プレート上では、極右と左のラインは避けられました。次に、左端と右端の線の隣にある2本の線を、酵素の有無にかかわらず、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用しました(n = 16)。これにより、プレート上の320種類の化合物を簡単に調べることができました。図1Bは、この研究で使用したプレート、コンテナ、ロボットアーム、その先端、およびマイクロプレートリーダーを示しています。この研究で使用した手順を図1Cに示します。最初に、蛍光強度を決定するために、2倍バイオ蛍光反応溶液を調製し、右端と左端のライン(352ウェル)を除くすべての...

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ディスカッション

私たちは、TgやNc ATPase22などのATPaseを介して最終生成物であるADPに対して、従来の酵素アッセイと蛍光アッセイを組み合わせることで、新しい高ダイナミックレンジと高精度のアッセイを確立することに成功しました。HTSを実施するためには、アッセイが従来の酵素アッセイ15,22よりもS/B、S/N、およびZ'因子の値が優れていることが重要です。さらに、HClなどの酸との酵素反応を停止し、すべてのウェルで1時間ごとに蛍光をリアルタイムで測定するステップを省略することで、取り扱いが容易になり、誤解を招く可能性が最小限に抑えられるため、サンプル間で飽和している不適切な時点とデータを適切に比較できます。酵素反応の速度は速すぎて、反応の飽和状態のために不適切な時点で正しい活性を測定することができません。

この論文では、試薬、酵素、酵素反応混合物、2倍バ...

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開示事項

著者らは、この研究に金銭的な利害関係はありません。

謝辞

本研究の一部は、日本学術振興会科学研究費補助金基盤研究(C)「創薬・情報・構造生命科学プラットフォーム」(JSPS-21K06566)の支援を受けて行われました。著者らは、組換え2つのNTPase活性変異体を贈呈してくださった浅井氏(慶應義塾大学)、原田氏(京都工芸繊維大学)、Stephen Stratton氏にそれぞれ本稿の作成に貢献していただいたことに心から感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12段ワークステーション EDR-384 SXバイオテック(株)EDR-384SXロボットアームピペッティングシステム
384ウェルチップバイオテック株式会社オーダーメイド
ADP-ヘキソキナーゼ旭化成ファーマ(株)T-92
ATPオリエンタルイースト(株)45140000
BSA和光純薬工業(株)011-15144
ジアフォラーゼI株) ユニチカDi-1
DMSOナカライ・テッシュ社13406-55
G6Pデヒドロゲナーゼオリエンタルイースト(株)〒306-50143
グルコース和光純薬工業(株)049-31165
Greiner 384 well マイクロプレート 非結合 浅井戸 Black#784900
HEPES和光純薬工業(株)342-01375
Mg(CH3COO)2>和光純薬工業(株)130-00095
NADPオリエンタル酵母株式会社44332000
N-エチルマレイミド和光純薬工業(株)056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSマルチモードマイクロプレートリーダー
レサズリン和光 純薬工業(株)191-07581
タツノオトシゴ 実験器具 384 井戸 ロープロファイル貯留層S30022 25/CS
TrisHCl和光純薬工業(株)W01COBQE-4120
トリトン X-100ナカライ・テッシュ35501から02
(

参考文献

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