シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法

Summary

シロイヌズナ(シロイヌズナ)種子の表面滅菌のためのハイスループットプロトコルが提供され、真空ポンプで構成された簡単な吸引装置で液体処理ステップを最適化する。何百もの種子サンプルを1日で表面滅菌することができます。

Abstract

シロイヌナズナは、機能研究に最も広く使用されている植物モデル種です。シロイヌナズナの種子の表面滅菌は、この目的に向かって必要とされる基本的なステップです。したがって、数十~数百個のサンプル(トランスジェニックライン、エコタイプ、または変異体)を一度に処理するハイスループットシロイヌナズナシス種子表面滅菌法を確立することが最も重要です。一般的な真空ポンプから構築された自家製の吸引装置を用いたチューブ内の液体の効率的な除去に基づく種子表面滅菌法を本研究で紹介する。この方法で、1日に数百個のサンプルを処理することで、労働集約的なハンズオン時間を劇的に短縮することで、少しの労力で可能になります。シリーズタイムコース分析は、高い発芽率を維持することにより、表面滅菌の非常に柔軟な時間範囲をさらに示しました。この方法は、種子サイズに応じて吸引装置の簡単なカスタマイズ、および液体を排除するために望まれる速度で、他の種類の小さな種子の表面滅菌に容易に適応することができる。

Introduction

シロイヌナズナは、ブラッシカ科に属する二分植物種です。その比較的短いライフサイクル(長い日の成長条件下で一世代あたり2ヶ月)、小さな植物のサイズ、および植物ごとに何百もの種子の生産と自己受粉は、それを最初の基本的な植物モデル種^1、2にしました。さらに、そのゲノムは^{完全に配列}3であり、広範な逆遺伝学ツール(飽和T-DNA、トランスポゾン、および化学的変異体化された集団)が利用可能である^4、5、6、および効果的なアグロバクテリウム媒介変換は、さらに下流作業のための十分なトランスジェニックラインを得るために十分確立されている⁷ .したがって、過去20年間に、自然、遺伝的、表現型のバリエーション^8、9を含む分子レベルで植物生物学の多様な側面を解剖するためのモデル種としてシロイヌナズナシスを使用して大きな進歩が達成されました。

シロイヌナズナの目的の遺伝子を....

Protocol

1. 試薬および媒体調製

1. 70%エタノール溶液を調製:蒸留水263mLに95%のテクニカルエタノールの737 mLを加えます。よく混ぜます。
   注:無菌の作業台に70%エタノール溶液を準備してください。
   注意:エタノールは非常に可燃性であり、目に深刻な刺激を引き起こす可能性があります。炎や熱源から遠ざけてください。目に触れた場合は、豊富な水ですすいでください。
2. 5%漂白液を調製する:家庭用漂白剤5mL(次亜塩素酸ナトリウム、NaClOの約3.5%を含む)を95mLの滅菌蒸留水に加えます。非イオン性洗剤(例えば、Tween 20)を数滴加え、十分に混ぜます。
   注:ラミナーフードの中に5%の漂白剤溶液を準備してください。
   注意:漂白剤の活性成分である次亜塩素酸ナトリウムは、非常に刺激性が高い。それは非常に腐食性であり、胃腸管に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。接触した場合は、すぐに豊富な水ですすいでください。摂取の場合は、毒物管理センターまたは医師に相談して治療のアドバイスを受けてください。
3. ハーフストレングスムラシゲとスクーグ(1/2 MS)培地²⁶を準備します。
   1. 蒸留水800mLにMS培地パウダー2.2g(ビタミンを含む)と10gのスクロースを加えます。1 M KOH を使用して溶液の pH を調整し、蒸留水を使用して 1 L までの体積を持って下さい。アリコート500mLを1Lボ....

Results

種子滅菌手順全体に要する時間を評価するために、現在のプロトコルにおける液体処理96サンプルの時間差を計算し、従来のピペット法と比較した。この結果は、現在のプロトコルが時間を節約し、従来のプロトコルで液体処理時間をその 4 分の 1 に短縮することを示しています (表 1)。この表はさらに、現在のプロトコルの液体除去時間は、従来の方法よりも多くの時間を節約し、全体的に8倍の削減を行うことを強調しています。

種子滅菌の時間範囲の選択
長い殺菌ステップは汚染率を最小にするが、種子の発芽に悪影響を及ぼす可能性がある。汚染のない発芽率が最も高い種子滅菌の最良の時間範囲を決定するために、各滅菌ステップの異なる持続時間を試験し、種子発芽率と緑色コチルドン出現率の両方を評価した。2日目から4日目、7日目に行われた発芽分析では、70%エタノール滅菌の10分から40分までの時間範囲に有意な差は示さなかった。しかし、70%エタノールによる処理の40分から、発芽率は低下した(図3)。

Discussion

種子の滅菌は、シロイヌナズナの機能研究の基本的なステップです。多くの異なる目的のために頻繁に行われますが、シロイヌズナでのハイスループット種子表面滅菌に関する限定的な研究が可能です。

これまで、最も高いスループットを有する方法の1つは、漂白剤と濃縮HClを混合して発生した塩素ガスを用いることで行なわれた。この方法は、限られた実務時間を必要としますが、それは人間に非常に有毒なガスを使用します²⁷.また、表面滅菌する種子の数と表面種子滅菌の持続時間を慎重に制御する必要があります。種子が多すぎると、塩素ガスの投与量が種子コートに存在する微生物を完全に殺すには十分ではなく、種子バッチの広範な汚染をもたらす。一方、表面滅菌の持続時間が長すぎると、種子が殺されます。したがって、いくつかの利点にもかかわらず、燻蒸はシロイヌズナでの種子表面滅菌のための好みの方法ではない。

対照的に^{、28、29、30}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アクアリウムバルブ	Amazon	B074CYC5SD	2つのバルブと薄肉チューブを含むキット。バルブは、液体が無菌チップに戻るのを防ぎます
シロイヌナズナ Col-0 野生型種子	ノッティンガムシロイヌナズナストックセンター	N1093	野生型種子(カナマイシンに感受性)
シロイヌナズナトランスジェニックライン AdoIspS-79種子	NA		トランスジェニックライン アルンド・ドナックスからのイソプレン合成酵素遺伝子を過剰発現し、Col-0バックグラウンドで変換され、カナマイシンに耐性があります (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34、2583–著者からのリクエストに応じて入手可能
マイクロ遠心分離	エッペンドルフ	EP022628188	ダウンに使用される卓上微量遠心分離機
ラシゲ&ビタミンを含むSkoog	Duchefa	M0222	植物無菌培養のための標準培地
ピペットコントローラー	ブランド	26300	血清ピペットの操作に使用
ポリエチレンチューブ 1	Roth	9591.1	真空ポンプからデカンテーションボトルへの接続用チューブ(内径:7mm、外径:9mm)
ポリエチレンチューブ 2	Roth	9587.1	デカンテーションボトルから水槽用バルブへの接続用チューブ (内径:5mm、外径:7mm)
コネクタ付きスクリューキャップ	Roth	PY86.1	2ウェイディスペンサー スクリューキャップ GL45 ポリプロピレン製 デカンティングボトル用
セロロジカルピペット	ブランド	27823	目盛り付きガラス(再利用可能)セロロジカルピペット。使い捨てピペットは
、Shakeret alの代わりに使用できます。	Qiagen	85300	TissueLyser IIビーズミルは、通常、組織の均質化に使用されます。チューブにビーズを追加しなくても、シェーカーとして機能します。
テクニカルエタノール	ITW試薬(Nova Chimica Srl)	212800	タノール96%v / v部分的に変性した技術グレード
Tween 20	メルクミリポア	655205	面活性剤として機能する非イオン性洗剤
チューブコネクタ	Roth	Y523.1	接続の改善/簡素化に使用できます
真空ポンプ	メルクミリポア	WP6222050	に使用されます吸引装置を作る