方法論記事

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

DOI：

10.3791/62902

⸱

2021年8月13日

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1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリア基質フラックスは、各細胞型の特徴であり、トランスポーター、チャネル、酵素などの成分の変化が、いくつかの疾患の病因に関与している。ミトコンドリア基質フラックスは、インタクト細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリアを用いて研究することができる。無傷の細胞を調査することは、異なる基質の同時酸化のためにいくつかの問題に遭遇する。また、いくつかの細胞タイプは結果解釈を複雑にする異なる基質の内部ストアを含む。ミトコンドリアの分離や透過性の薬剤の使用などの方法は、容易に再現できません。小さいサンプルから十分な量の無傷の膜で純粋なミトコンドリアを分離することは問題である。非選択的パーメアビライザーを使用すると、さまざまな程度の不可避ミトコンドリア膜損傷を引き起こす。組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、ミトコンドリア完全性に影響を与えることなく、細胞膜を選択的に透過させる能力のおかげで、より適切なパーメアビライザーとして提供された。マイクロプレートの呼吸数と組み合わせて使用すると、最小数の細胞を使用しながら、1回の実験内で十分な反復を伴ういくつかのミトコンドリア基質のフラックスをテストすることができます。本研究では、このプロトコルは、2つの異なる細胞表現型または遺伝子型のミトコンドリア基質フラックスを比較する方法を説明し、様々なミトコンドリア基質または阻害剤を試験するようにカスタマイズすることができる。

概要

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マイクロプレートベースの呼吸数は、小さいサンプルサイズ1の細胞呼吸の研究を可能にすることによってミトコンドリア研究に革命を起こしました。細胞呼吸は、ミトコンドリア機能または「機能不全」の指標として一般的に考えられるが、ミトコンドリアの機能範囲がエネルギー産生を超えて広がっている2。好気条件では、ミトコンドリアは、これらの基質を分解して、クエン酸サイクル3 を燃料とすることができる代謝中間体に変換することによって、異なる基質に蓄えられているエネルギーを抽出する(図1)。基質の連続流束は、クエン酸サイクルの流れに不可欠であり、高エネルギーの「電子ドナー」を生成し、内部ミトコンドリア膜を横切って陽子勾配を生成する電子輸送鎖に電子を送達し、ATP合成酵素がADPをATP4にリン酸化することを可能にする。したがって、ミトコンドリア呼吸をアッセイする実験計画には、サンプル性質(無傷細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリア)およびミトコンドリア基質を含まなければならない。

細胞は先住民族の基質5の貯蔵を維持し、ミトコンドリアは、同時に数種類の基質を酸化する6、無傷の細胞に対して行われた実験から得られた結果の解釈を複雑にする。選択した基質を酸化するミトコンドリア能力を調査する一般的なアプローチは、ミトコンドリアを単離するか、または調査した細胞5を透過させることである。分離ミトコンドリアは定量的研究に理想的ですが、分離プロセスは面倒です。大きなサンプルサイズ、収率の純度、技術5の再現性などの技術的な困難に直面しています。透過細胞はミトコンドリアの分離の欠点のためのソリューションを提供します;;しかし、洗剤の日常的な透過性剤は特異的ではなく、ミトコンドリア膜5に損傷を与える可能性がある。

組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、選択的な血漿膜透過性剤7として提供され、そして、いくつかの研究7、8、9、10において細胞外フラックス分析装置との併用に成功した。XFe96細胞外フラックス分析装置を用いて、rPFOを用いてミトコンドリア基質フラックスをスクリーニングするプロトコルを改変した。このプロトコルでは、2つの細胞型の4つの異なる基質酸化経路を比較し、試験した各材料に対して十分な反復と適切な制御を有する。

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プロトコル

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1. アッセイの前日

  1. 試薬および基質の調製。
    1. ミトコンドリアアッセイ溶液(MAS): 表1に記載されている全ての試薬のストック溶液を準備する。マンリトールとスクロースの在庫を37°Cに温め、完全に溶解します。試薬を混合して2倍のMASを調製し、その後、混合物を37°Cに温める。 5N KOHでpHを7.4(〜7 mL)に調整し、水を加え、体積を最大1 L.ろ過滅にし、測定日まで-20°Cでアリコートを保存します。
    2. ウシ血清アルブミン(5%BSA):BSAの5gを90mLのプリウォーム無菌水で磁気攪拌機で溶解し、揺れを避ける。5 N KOH で pH を 7.4 に調整し、水を加え、最大 100 mL のボリュームを持たします。フィルター殺菌し、測定日まで-20°Cでアリコートを保管します。
    3. ミトコンドリア基質:コハク酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウムの1Mストック溶液を滅菌水中で調製します。無菌水中のナトリウムマル酸の100 mMストック溶液を調製し、パルミトイルカルニチンの10 mMストック溶液を調製するために、事前に温めた無菌水を使用します。各溶液のpHを7.4,5 N KOHに調整し、フィルター滅菌します。基板は2~8°Cで保管してください。 使用時に、パルミトイルカルニチンを37°Cに温め、任意の沈殿物を溶解させた。後で使用するために、-20°Cでピルビン酸を除くすべての基質のアリコートを保存する。
    4. ミトコンドリア阻害剤:ジメチルスルホキシド(DMSO)を使用して、25 mMオリゴマイシン、50mMカルボニルシアニド4-(トリフルロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、20mMロテネン、20mM抗ミシンAのストック溶液を調製します。
  2. セルのシード処理と処理: 図 2に示すように、列 2 から 11 にセルをシードします。列 1 と 12 は、背景ウェルとして機能するために空のままにする必要があります。本研究では、HepG2およびA549細胞を用いた。
    1. ウェルあたり20,000個の細胞の密度で細胞を播種します。播種には50~80μLの細胞培養培地を使用してください。
    2. ブランクウェルを等量の細胞培養培地で満たし、5%CO2で加湿インキュベーターで37°Cの細胞をインキュベートする。細胞を3〜4時間取り付け、100μLの細胞培養培地を全てのウェルに加えます。
    3. その最終的な媒体の追加で、列7-11で処理を適用します。本研究では、実験群を1mMメトホルミン塩酸塩で16時間処理し、対照群を車両制御として等量の無菌蒸留水で処理した。
  3. センサーのハイドレート:ユーティリティプレートに入れて、滅菌水のピペット200 μLをユーティリティプレートに入れ、センサーを水中に浸しながらセンサーカートリッジを慎重に戻します。次の日まで37°CでCO2フリーインキュベーターにカートリッジをインキュベートします。
  4. アッセイプロトコルテンプレート:アナライザのスイッチ( 材料表を参照)とコントローラユニット。計測器制御およびデータ取得ソフトウェアを起動し、 表2に記載されているアッセイプロトコルを設計します。 [グループ定義] で、注入された基板に応じてポート A が異なる 4 つの射出方法を作成します (図 3)。基板またはその略称の後に戦略に名前を付けます。
  5. ポートB、C、およびDに、それぞれオリゴマイシン、FCCP、ロテロン/アンチマイシンAの化合物を割り当てます。 図 4に示すように、8 つのグループを作成し、名前を付けます。プレート マップ で、対応するウェルにグループを割り当て、すぐに使用できるテンプレートとしてプロトコルを保存します。温度が一晩安定するように、アナライザーの電源を入れたままにしておきます。温度の急激な変化を避けるために、安定した温度の場所に分析装置を保管してください。

2. アッセイの日

  1. 水をキャリバートに置き換える:ユーティリティプレートから水を捨て、プリウォームキャリブラントのピペット200 μLをユーティリティプレートに入れます。カートリッジをアッセイの時点までCO2-freeインキュベーターに戻します。キャリブラントの急速な蒸発を避けるために、インキュベーター内の湿度の源を維持し、ファンの速度を最小限にオフにするか、または減らします。
  2. 作業ソリューションの準備:2x MAS、5%BSA、無菌水を37°Cに温めることから始めます。 一方、阻害剤の在庫が室温に達することを可能にする。表 3に記載されているように、5mLの基質および阻害剤の作業濃度を調製するために、温かい2x MASおよび滅菌蒸留水を使用する。
  3. 注入ポートのロード: 図3に示すように、20 μLの基板をポートAにロードし、より小さい方/ロテノン混合物を行AのポートAにロードし、B.行CとD.ロード・グルタミン酸/マレート混合物を行EとF.ロードパルミトイル・カルニチン/マレート混合物を行AとHのポートにロードします。プレート全体では、22 μLのオリゴマイシン調製でポートBをロードし、25 μLのFCCP調製を用いたポートC、ロテノーン/アンチマイシンA混合物の27 μLを用いたポートDをロードします。
  4. キャリブレーションステップの開始:[ アッセイの実行 ]タブで、[ 実行開始 ]をクリックしてアッセイを開始します。ロードしたセンサーカートリッジを挿入し、キャリブレーションステップを開始します。キャリブレーションが完了するまで待ってから、次の手順に進みます。
  5. アッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)の調製:20mLのアッセイ培地を調製し、2x MASの10mL、無菌水9.2mL、50mLのBSAの0.8mLを50mLチューブに混合します。10 μM rPFOの2 μLを加えて1 nMの濃度を達成し、穏やかなピペットで混合物を再懸濁させます。揺れを避け、混合には渦ミキサーを使用しないでください。使用時まで37°Cでチューブをインキュベートする。
  6. 細胞を洗う:マルチチャネルピペットを使用して、細胞と空の空の井戸を、プリウォームカルシウムおよびマグネシウムフリーのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄します。細胞培養培地を廃棄し、PBSを追加するために同じヒントを再利用しないでください。このステップを層流の外側で行い、空気流による乾燥から細胞を保護します。
  7. アッセイ媒体中の細胞透過化:マルチチャネルピペットを使用して、PBSを廃棄し、プリウォーム付きアッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)の180 μLに交換します。
  8. 測定開始:パーメアビライゼーションの直後に、校正されたセンサカートリッジのユーティリティプレートをセルプレートに交換し、測定を開始します。

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結果

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まず、結果をベースライン呼吸の2回目の測定に正規化し、酸素消費率(OCR%)として値を示します。アッセイの結果は、図5、図6、図7、図8に示されています。各グループに適切なバックグラウンドウェルを割り当て、他のグループのバックグラウンドウェルを無効にすることが重要です。図5は、処置群がコハク酸誘導呼吸率が高いことを示す。メトホルミン治療に対するA549細胞の応答(図5A)は、HepG2細胞よりも高かった(図5B)。バックグラウンドコントロールウェルは、比較されたグループの同じ行(この場合はウェルA1、B1、A12、B12)のもののみであった。

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ディスカッション

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このプロトコルは、以前に発表された研究7、8、9、10と製品ユーザーガイドの変更です。メーカーのプロトコルとは対照的に、2x MASは3倍MASの代わりに使用され、2×MASは溶解しやすく、凍結後に沈殿物を形成しません。凍結された2x MASアリコートは、最大6ヶ月保存でき、一貫した結果を示すことができます。もう一つの違いは、2x MASの成分にADPを含み、式からBSAを省略する。BSAを含む溶液は、注入することがより困難であり、エラーや外れ値の大きな可能性を引き起こします.しかし、BSAの存在は、適切な透過性を達成するためにrPFOの必要量を減らすために不可欠である。したがって、BSAは、細胞洗浄後の透過化工程で使用されるアッセイ媒体(MAS-BSA-rPFO)にのみ添加される。

細胞培養培地から細胞を洗浄するために、このプ...

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開示事項

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著者は宣言する利害の対立はありません。

謝辞

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著者らは、フラデック・クラロヴェの医学部生理学部門の職員と第3医学部の病態生理学科の職員に、化学物質とサンプルの調製に協力してくれたことに感謝する。この研究は、チャールズ大学の助成プログラムPROGRES Q40/02、チェコ保健省補助金NU21-01-00259、チェコ科学財団助成金18-10144、INOMEDプロジェクトCZ.02.1.01/0.0/18_069/0010046によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アデノシン5′ -二リン酸一カリウム塩二水和物メルクA5285-20°Cで保存します。C
Antimycin AMerckA8674store(-20度);C
ウシ血清アルブミンメルクA3803ストア2 - 8 °C
シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾンメルクC2920-20 °C で保管。C
ジメチルスルホキシドメルクD8418RT
D-マンニトールメルク63559RT
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水Gibco14190-144RT
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&プライム;,N&プライム;-テトラ酢酸メルク03777RT
HEPESメルクの店H7523RT
L(-)Malic acid 二ナトリウム塩MerckM9138RT
L-Glutamic acid ナトリウム塩水和物MerckG5889RT
塩化マグネシウム六水和物MerckM2670RT
OligomycinメルクO4876-20 >C
パルミトイル-DL-カルニチンクロリドメルクP4509-20 °C;C
水酸化カリウムメルク484016RT
リン酸カリウムP5655RT
ロテノンメルクR8875ストア -20 >C
タツノオトシゴ ウェーブ デスクトップ ソフトウェアアジレント技術
www.agilent.com タツノオトシゴ XFe96 アナライザーアジレント技術
タツノオトシゴ XFe96 FluxPakアジレント技術102416-100XFe96 センサー カートリッジと XF96 細胞培養マイクロプレート
ビン酸ナトリウムメルクP22562 - 8 >C
コハク酸ナトリウム 二塩基性六水和物メルクS2378RT
スクロースメルクS7903RT
ウォーターメルクW3500RT
XF キャリブラント アジレント テクノロジーズ 100840-000RT
XF 原形質膜透過剤アジレント テクノロジーズ 102504-100組換えペルフリンゴリシンO(rPFO) - アリコートし、-20°Cで保存します。ハ
は ピル

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

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