脂肪酸β酸化は、肝細胞を含む多くの異なる細胞型においてエネルギーを生成する役割を担う必須代謝経路である。ここでは、 14C標識パルミチン酸を用いて新たに単離した初代肝細胞における脂肪酸β酸化を測定する方法について述べる。
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方法論記事
単離したてのマウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
脂肪酸β酸化は、肝臓のエネルギー需要を満たすための重要な代謝経路であり、全身のグルコース恒常性を維持し、絶食状態での肝外器官機能をサポートするために不可欠なケトジェネシスおよび糖新生などの追加プロセスのための基質および補因子を提供する。脂肪酸β酸化は、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム内で起こり、脂肪酸の取り込みおよび活性化、酵素発現レベル、補酵素AおよびNAD+などの補因子の利用可能性を含む複数のメカニズムによって調節される。肝臓ホモジネート中の脂肪酸β酸化を測定するアッセイでは、細胞溶解および補因子の超生理学的レベルの一般的な添加は、これらの調節機構の影響を隠す。さらに、ホモジネート中の細胞小器官の完全性は制御が困難であり、調製物間で大きく異なる可能性がある。無傷の初代肝細胞における脂肪酸β酸化の測定は、上記の落とし穴を克服する。このプロトコールは、 14C標識パルミチン酸と共にインキュベートされた新たに単離された初代マウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定のための方法を記載する。数時間から数日の培養を避けることによって、この方法は、摂食マウスと比較して絶食マウスから単離された肝細胞において観察される脂肪酸β酸化の活性化を含む、元の肝臓のタンパク質発現レベルおよび代謝経路活性をよりよく保存するという利点を有する。
概要
脂肪酸β酸化は脂質代謝に不可欠なプロセスであり、脂肪酸合成と食事からの摂取のバランスをとるための異化経路を提供する。このプロセスは、心筋、腎臓皮質、絶食肝臓を含む複数の臓器にエネルギーを生成し、食事から得られる脂肪酸、脂肪組織の脂肪分解、および内部トリグリセリドストア1,2を利用します。
β酸化経路を介した脂肪酸の酸化は、アセチルCoAとして放出される一度に2つの炭素による脂肪酸アシル鎖の逐次的な短縮をもたらし、このプロセスはミトコンドリアおよびペルオキシソームの両方で起こる。ほとんどの脂肪酸はβ酸化のみを受けるが、一部はこの経路に入る前に異なる炭素で酸化される。例えば、フィタン酸などの3-メチル置換脂肪酸は、α酸化経路に入る前にペルオキシソーム中のβ酸化によって1つの炭素の除去を受ける。同様に、一部の脂肪酸は、小胞体における末端メチル基の酸化(ω-酸化)によって最初にジカルボン酸脂肪酸に変換され、その後、β酸化3によってペルオキシソーム内で優先的に酸化される。
特定の細胞小器官に関係なく、脂肪酸は、β酸化経路を介して酸化されるためには、まず補酵素A(CoA)チオエステル、またはアシルCoAに変換されなければならない。ミトコンドリアマトリックス中の長鎖アシル....
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プロトコル
マウス(C57BL/6J、雄、9〜11週齢)に対するすべての実験手順は、ウェストバージニア大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。
1. 肝細胞の単離
- 準備
- 肝細胞単離の数日前に、 表1に記載の緩衝液及び細胞培養培地を調製した。手術が行われる場所の近くで温度を37°Cに設定したウォーターバスを設置します。
- 肝細胞単離の日に、層流フードの下で、35mLの緩衝液1を滅菌50mL遠沈管に、70mLの緩衝液2を100mLの滅菌ビーカーまたはボトルに移す。
- 抗生物質ゲンタマイシン(50μg/mL)およびペニシリン/ストレプトマイシン(1x)を両方の緩衝液に加える。
- ステップ1.1.3で調製したバッファー2の20 mLを100 mm細胞培養皿に移し、氷上に置きます。
- 残りの50 mLのバッファー2を滅菌50 mL遠沈管に移す。抗生物質添加バッファー 1 および 2 を含む 50 mL チューブを 37 °C に設定したウォーターバスに入れ、灌流を開始する前に少なくとも 15 分間ウォームアップさせます。
注:セッションで複数の肝細胞単離を実施する場合は、それに応じて準備するために、バッファー1および2の抗生物質添加アリコートの数をスケールアップしてください。 - コラゲナーゼ溶液の....
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結果
ここで説明する肝臓灌流は、トリパンブルー排除によって推定されるように、典型的には3000万〜4000万個の細胞/肝臓を生じ、平均生存率は80%である(図2)。灌流バッファー 1 および 2 の調製に使用される Krebs-Henseleit バッファー (KHB) 中のグルコースの典型的な濃度は 11 mM です。絶食マウスから単離した肝細胞における脂肪酸β酸化を測定する場合、KHB中のグルコース濃度を下げて絶食状態をよりよく表すことができる。 図2に示すように、グルコース濃度を5.6 mMに下げても、肝細胞の収量または生存率に悪影響はない。
表2 は、CPT1の強力な阻害剤であり、したがってミトコンドリア脂肪酸酸化10、13の強力な阻害剤であるエトモキシルの存在下および非存在下で三連でアッセイされた肝細胞懸濁液についての典型的な実験セットアップを示す10、
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ディスカッション
肝臓灌流の間、気泡は肝臓内の微小毛細血管を遮断し、緩衝循環を防止または制限し、肝細胞の収量および生存率を全体的に低下させるので、気泡の導入を避けることが重要である20,21。IVCのカニューレ前にバッファーで満たされた入口ラインを綿密に検査し、バッファー1を含むチューブから入口ラインを持ち上げてバッファー2に切り替えることを避けるなどの予防措置は、失敗した灌流の数を首尾よく減らすことができます(生存率<70%)。灌流システムにおけるバブルトラップの使用はまた、このリスクを有意に減少させることができる20,21。
コラゲナーゼ活性は、肝細胞の単離のためのもう一つの重要なパラメータであり、歴史的に12,20を獲得した各新しいバッチの試験お.......
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開示事項
著者らは、開示する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所がロベルタ・レオナルディに助成金R35GM119528を供与した。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| (R)-(+)-エトモキシルナトリウム塩 | トクリスバイオサイエンス | 4539/10 | |
| [1-14C] - パルミチン酸、50–60 mCi/mmol、0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES、滅菌 | 済み Corning | 25060CI | |
| 10 & micro;L:容積式ピペット用ディスポーザブルキャピラリー/ピストン | メトラー・トレド | 17008604 | |
| 1000 & マイクロ;L、200 µL、および10 µL ピペットとチップ | |||
| 5 mL、10 mL、25 mL 血清ピペット | |||
| 50 mL 滅菌遠心チューブ | CellTreat | 229421 | |
| 70% 過塩素酸 | フィッシャー サイエンティフィック | A2296-1LB | |
| BSA、脂肪酸フリー | フィッシャー サイエンティフィ | BP9704100 | |
| CaCl2 二水和物 | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-グルコース | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| フィルター システム、0.22 μm PES フィルター、500 mL、滅菌 | CellTreat | 229707 | |
| 硫酸ゲンタマイシン | ゴールド バイオテクノロジー | G-400-25 | |
| HDPE、6.5 mL シンチレーション バイアル | フィッシャー サイエンティフィック | 03-342-3 | |
| 血球計算盤 | |||
| 皮下注射針 22 G、1.5 インチ | BD バイオサイエンス | 305156 | |
| イソフルラン | VetOne | ||
| KCl | フィッシャーサイエンティフィック | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | 精製コラゲナーゼ I および II と中濃度のサーモリシン |
| M199 培地 | MilliporeSigma | M5017 | の定義されたブレンド |
| MgSO4 七水和物 | MilliporeSigma | M1880 | |
| 微量遠心分離機 | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | ||
| パルミチン酸 | ミリポアSigma | P0500 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン (100x) | Gibco | 15140122 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| 容積式ピペット MR-10, 10 µL | メトラー・トレド | 17008575 | |
| 50 mLコニカルチューブ用インサート付き冷蔵遠心分離機 | エッペンドルフ | 5810 R | |
| 丸底、14 mL、ポリプロピレン培養試験管 | フィッシャーサイエンティフィック | 14-956-9A | |
| シンチレーションカウンター | パーキンエルマー | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD カクテル | フィッシャーサイエンティフィック | SX18-4 | |
| 振とう水浴、容量30 L | ニューブランズウィックサイエンティフィック | モデルG76 | |
| 滅菌セルストレーナー、100 & マイクロ;m | フィッシャーサイエンティフィック | 22363549 | |
| 親指ドレッシング鉗子 | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| 可変流量蠕動ポンプ | フィッシャーサイエンティフィ | 138762 | |
| ウォーターバス、2–2.5L容量 |
参考文献
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (....
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