単離したてのマウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定

脂肪酸β酸化は脂質代謝に不可欠なプロセスであり、脂肪酸合成と食事からの摂取のバランスをとるための異化経路を提供する。このプロセスは、心筋、腎臓皮質、絶食肝臓を含む複数の臓器にエネルギーを生成し、食事から得られる脂肪酸、脂肪組織の脂肪分解、および内部トリグリセリドストア^1,2を利用します。

β酸化経路を介した脂肪酸の酸化は、アセチルCoAとして放出される一度に2つの炭素による脂肪酸アシル鎖の逐次的な短縮をもたらし、このプロセスはミトコンドリアおよびペルオキシソームの両方で起こる。ほとんどの脂肪酸はβ酸化のみを受けるが、一部はこの経路に入る前に異なる炭素で酸化される。例えば、フィタン酸などの3-メチル置換脂肪酸は、α酸化経路に入る前にペルオキシソーム中のβ酸化によって1つの炭素の除去を受ける。同様に、一部の脂肪酸は、小胞体における末端メチル基の酸化(ω-酸化)によって最初にジカルボン酸脂肪酸に変換され、その後、β酸化³によってペルオキシソーム内で優先的に酸化される。

特定の細胞小器官に関係なく、脂肪酸は、β酸化経路を介して酸化されるためには、まず補酵素A(CoA)チオエステル、またはアシルCoAに変換されなければならない。ミトコンドリアマトリックス中の長鎖アシルCoAsのβ-酸化は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ1(CPT1)がアシル-CoAsのアシルカルニチンへの変換を触媒し、このプロセス⁴における律速酵素であるカルニチンシャトルを必要とする。一旦ミトコンドリアマトリックスに転移すると、アシルCoAsは再形成され、ミトコンドリアβ酸化機構の基質として役立つ。絶食状態では、肝ミトコンドリアにおけるβ酸化によって産生されたアセチルCoAは、主にケトジェネシスにチャネリングされる。ペルオキシソームは、非常に長鎖、分岐鎖、およびジカルボン酸のβ酸化の一次部位として役立つ。ペルオキシソームは、脂肪酸基質を輸入するためにカルニチンシャトルを必要とせず、代わりにATP結合カセット(ABC)トランスポーターの活性を介して対応するアシル-CoAsを輸入する1-3⁵。ペルオキシソーム内では、アシルCoAsは、ミトコンドリア脂肪酸β酸化機構とは異なる専用の酵素セットによって酸化される。ミトコンドリアとペルオキシソームの両方はまた、脂肪アシル鎖を酸化するためにNAD⁺ および遊離CoAの供給を必要とする。肝臓中のCoAレベルは絶食に応答して増加することが示されており、この状態で起こる脂肪酸酸化の速度の増加を支持している⁶。さらに、ペルオキシソームにおけるCoA分解の増加は、ペルオキシソーム脂肪酸酸化⁷の選択的減少をもたらす。したがって、細胞内の脂肪酸酸化のプロセスは、脂肪酸の活性化、輸送、および酸化に関与する酵素の発現レベルおよび活性、ならびに複数の細胞内区画にわたる補因子および他の代謝産物の濃度によって調節される。

脂肪酸酸化を測定するために組織ホモジネートを使用する手順は、このプロセスを調節およびサポートする細胞アーキテクチャを破壊し、in vivo代謝を正確に反映しないデータの収集につながる。播種された初代肝細胞を用いた技術はこの系を保持するが、単離された細胞を長期間培養すると、動物内にまだ生きていたときに細胞内に存在していたin vivo遺伝子発現プロファイルが失われる^{結果となる8,9}。以下のプロトコールは、[^1-14C]パルミチン酸を用いて、初代肝細胞を単離し、単離直後および懸濁液中で脂肪酸β酸化に対するそれらの能力をアッセイする方法を記載している。このアッセイは、[1-14C]パルミチン酸^10,11のβ酸化によって生成されるアセチルCoAのような酸可溶性代謝産物(ASM)または生成物に関連する放射能の測定^{に基づいている。}

マウス(C57BL/6J、雄、9〜11週齢)に対するすべての実験手順は、ウェストバージニア大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。

1. 肝細胞の単離

1. 準備
   1. 肝細胞単離の数日前に、 表1に記載の緩衝液及び細胞培養培地を調製した。手術が行われる場所の近くで温度を37°Cに設定したウォーターバスを設置します。
   2. 肝細胞単離の日に、層流フードの下で、35mLの緩衝液1を滅菌50mL遠沈管に、70mLの緩衝液2を100mLの滅菌ビーカーまたはボトルに移す。
   3. 抗生物質ゲンタマイシン(50μg/mL)およびペニシリン/ストレプトマイシン(1x)を両方の緩衝液に加える。
   4. ステップ1.1.3で調製したバッファー2の20 mLを100 mm細胞培養皿に移し、氷上に置きます。
   5. 残りの50 mLのバッファー2を滅菌50 mL遠沈管に移す。抗生物質添加バッファー 1 および 2 を含む 50 mL チューブを 37 °C に設定したウォーターバスに入れ、灌流を開始する前に少なくとも 15 分間ウォームアップさせます。
      注:セッションで複数の肝細胞単離を実施する場合は、それに応じて準備するために、バッファー1および2の抗生物質添加アリコートの数をスケールアップしてください。
   6. コラゲナーゼ溶液のアリコートを解凍し、氷の上に保ちます。
      注:適切に保存すれば、調製から3週間以内に3回まで凍結および解凍し、使用したコラゲナーゼ溶液において酵素活性の有意な損失はない。
   7. 手術器具とペリスタルティックポンプを準備します。15mLの70%エタノールを循環させ、続いて15mLの滅菌水を循環させることによって、蠕動ポンプのラインを滅菌する。
   8. 22Gの針を出口ラインに接続します(図1A)。カテーテルのくり抜かれたフィルターはコネクタとしてうまく機能します。ラインをバッファ 1 で満たし、ライン、コネクタ、およびニードルを調べて、気泡がトラップされていないことを確認します。

図1:灌流装置および灌流肝臓。 (A)肝臓をカニューレおよび灌流するために使用される針に接続された出口ラインを備えた蠕動ポンプ。(B)カニューレが成功したことは、肝臓の即時かつ均質なブランチングによって示される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 肝臓灌流と解離
   1. 医療グレードの空気をキャリアガスとしてイソフルラン吸入を介してマウスを麻酔し、誘導に4%イソフルランを使用し、麻酔を維持するために1.5%イソフルランを使用する。ペダル反射の損失を評価することによって麻酔の深さを確認する。
   2. つま先をつまんでも反応がない場合は、手術ボード上でマウスを仰臥位に置き、手足を伸ばしてピンでボードに固定します。
   3. マウスの腹部と胸部に70%エタノールを自由にスプレーします。
   4. 鉗子を使用して、腹部の基部付近の皮膚および腹壁を引き上げ、正中線の両側および横隔膜まで横方向に切断して、器官を露出させる。
   5. 腸を右側に動かし、肝臓の葉を静かに上にひっくり返して、下大静脈(IVC)を露出させます。ニードルキャップなどの小さな円筒形の物体をマウスの背面の下に挿入して、IVCをわずかに傾け、カニューレを容易にします(図1B)。
   6. ポンプを最低速度で始動し、バッファー 1 が流れている状態で、IVC に針を挿入します。
   7. 門脈を切断して圧力を緩和し、血液および灌流緩衝液の排液を可能にし、直ちに流量を7mL/minに増加させる。正しく行うと、肝臓は数秒以内に均一にブランチします(図1B)。
   8. より一貫した結果を得るには、灌流の全期間にわたって針を手で所定の位置に保持します。
   9. 温かいバッファー1で肝臓を灌流します。気泡の導入を避けるため、バッファー 1 を含むチューブに挿入されたラインが連続的に水没したままであることを確認してください。
   10. 灌流が発生している間、130 μLのコラゲナーゼ溶液をバッファー2に加え、上下にピペッティングするか、5 mLまたは10 mLの血清学的ピペットで攪拌して混合する。
   11. バッファー 1 を含むチューブ内の容量が約 5 mL に減少したら、チューブの側面にピペッティングしてバッファー 1 にバッファー 2 をゆっくりと加えます。目標は、バッファ 1 からバッファ 2 に変更している間にラインに気泡が導入されないようにすることです。
   12. 容量が再び5 mLに減少するまで待ってから、さらに5 mLのバッファー2をゆっくりと加えます。もう一度繰り返します。バッファー 2 がバッファー 1 に置き換わり、解離が始まると、肝臓が腫れ上がります。
   13. 残りのバッファー 2 を、最初にバッファー 1 が入っていたチューブに追加します。チューブ内に約5〜10mLのバッファー2が残っている場合は、灌流を停止します。
       注:バッファ2が肝臓を灌流している間、門脈は鉗子で断続的に5秒間クランプすることができます。このステップは任意であるが、肝臓全体にわたる圧力の結果生じる増加は、その解離を改善し、したがって、最終的な肝細胞収率を改善することができる。
   14. 肝臓を慎重に切除し、ステップ1.1.4で確保した20mLの氷冷バッファー2を含む100mm培養皿に移す。
   15. 層流フードの下で、外科用はさみとピンセットを使用して肝臓を静かに分解します。
   16. 約20mLの氷冷M199を肝細胞懸濁液に加え、シリンジのプランジャーを用いて100μmの細胞ストレーナーを通して濾過し、より大きな肝臓片からの追加の肝細胞の放出を穏やかに促進する。
   17. 100 mm培養皿とセルストレーナーを追加のM199で、収集チューブがいっぱいになるまで洗浄します。
   18. 懸濁液を50 x g で4°Cで2分間遠心分離する。 上清を注意深く吸引し、肝細胞ペレットを渦巻いて30mLの冷たいM199に穏やかに再懸濁する。
   19. ステップ1.2.18で述べたように肝細胞をペレット化する。洗濯をもう一度繰り返します。
   20. 肝細胞を10mLの温かいM199に再懸濁し、トリパンブルー排除法および血球計数器¹²を用いて生存率および収量を決定する。
   21. 37°Cに加温したM199中の細胞を終濃度1.0 x¹⁰⁶ 生細胞/mLに希釈し、直ちにアッセイを開始する。

2. 脂肪酸β酸化測定法

注:アッセイは3連で行われ、各反応混合物は750,000細胞、1.35 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、100 μMパルミチン酸、および0.4 μCi[^1-14C]パルミチン酸を最終容量2mLで含む。
警告: 放射性化合物は危険です。放射性物質の購入、取り扱い、保管、廃棄は、制度、州、連邦の規制に従って行う。

1. 準備
   1. アッセイの数日前に、パルミチン酸およびBSA溶液(表1)を調製し、それらを-20°Cで保存する。
   2. アッセイの日に、肝臓灌流を開始する前にステップ2.1.3〜2.1.9を完了する。
   3. パルミチン酸とBSA溶液を解凍する。表2に示す典型的なアッセイセットアップを用いて、20%〜30%過剰を加えた複数の反応のための基質混合物を調製 する。
   4. 微量遠心管内の反応ごとに13.5 μLのBSA溶液をアリコートし、41°Cに加温し、次いで1反応あたり1 μLの200 mMパルミチン酸溶液(BSA:パルミチン酸モル比= 1:5)を加える。
      注:放射性および非放射性パルミチン酸溶液などの有機溶媒を使用して調製した溶液を、正の置換ピペットおよび適切なチップで分配することが好ましい。
   5. 渦を激しく、そして可溶性パルミチン酸の形成を促進するために41°Cでインキュベートする:BSA複合体。潜伏期間中に時折渦。
   6. 混合物は最初は白濁して見えるが、41°Cで20〜30分のインキュベーション後に完全に透明になる。 反応を開始する準備ができるまで41°Cに保ちます。
   7. 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 133 μL の 1 M 過塩素酸をアリコートし、反応を停止しました。
      警告: 過塩素酸は強酸であり、強酸化剤です。この化合物を取り扱うには適切な保護具が必要です。
   8. 反応ごとに485.5 μLのM199をチューブにアリコートし、37°Cに保ち、反応を開始する前にステップ2.1.4〜2.1.6で調製した放射性BSA:パルミチン酸複合体を希釈する。
   9. 750 μL の M199 をサンプルと同じ数の 14 mL 丸底チューブに分注します。所望により、ビヒクル対照を含む、エトモキβ、ロテノン、およびアンチマイシンなどの脂肪酸酸化の阻害剤を添加する(表2)。
   10. 肝細胞洗浄ステップの間、反応開始の10〜15分前に、ステップ2.1.9で調製したチューブを37°Cに設定した振とう水浴に移し、180〜200rpmで振とうした。
2. 脂肪酸β酸化反応の開始、停止、分析
   1. 肝細胞の生存率が許容できる場合(典型的には75%、図2≥)、各反応について、0.8μLの[1-14C]パルミチン酸(0.5mCi/mL)を、清澄化されたBSA:パルミチン酸溶液を含む微量遠心管に移す(ステップ2.1.4-2.1.6)。渦を巻き込み、41°Cで水浴に戻る。
   2. 肝細胞を37°Cに平衡化し、阻害剤(存在する場合)と共にそれらをプレイインキュベートするために、最終的な肝細胞再懸濁液の直後に(ステップ1.2.21)、1mLピペットで750μLの肝細胞懸濁液を振とう水浴中の14mL丸底チューブのそれぞれに移し(ステップ2.1.9〜2.1.10)、低速で短時間渦を吹いて混合する。
   3. 各添加を30秒ずらし、15分間インキュベートする。タンパク質測定のためにサンプルを保存するには、肝細胞の別のアリコートを1.5mLの微量遠心チューブに移し、3,000 x gで5分間スピンします。
      注:分注中、肝細胞懸濁液を連続的に旋回させるか、分注1 mLピペットで穏やかに攪拌して、沈降およびサンプル間での細胞数の大きな変動を防ぐ必要があります。
   4. 上清を取り出し、サンプル中のタンパク質の総量を測定する準備ができるまでペレットを-80°Cで保存し、結果を正規化した(図3)。
   5. 肝細胞が37°Cでプレイインキュベーションされている間、放射性BSA:パルミチン酸複合体を2.1.8の温培地に加え、反応を開始する準備ができるまで37°Cに保ちます。これが最終的な基質混合です。
   6. 反応を開始するには、肝細胞をウォーターバスから取り出し、500μLの基質混合物を加える。
   7. 低速で5秒間渦を巻き起こし、細胞を完全に再懸濁させ、水浴に戻す。すべてのサンプルで、30秒ずらして繰り返します。
   8. 15分間インキュベートする。一連の反応を開始し、直ちに停止し(ステップ2.2.10-2.2.11を参照)、バックグラウンド放射能を決定する(表2)。
   9. 残りの基質ミックスの重複アリコート(200〜250μL)を6mLシンチレーションバイアルに移し、カウントするために脇に置いておきます。これらのカウントを使用して、500 μLの基質混合物中の酸化に利用可能なパルミチン酸の総nmolesに対応する放射能を計算します。
   10. 反応を止めるには、水浴から肝細胞を取り出し、適度な速度でボルテックスすることによって肝細胞を再懸濁し、次いで400μLの肝細胞懸濁液を過塩素酸を含む微量遠心チューブに移す。
   11. すぐにチューブをキャップしてください。すべてのサンプルについてこのシーケンスを繰り返し、30秒ずらします。
   12. 1.5 mL の微量遠心チューブを激しく渦巻き、1.5 mL の微量遠心チューブを 13,000 x g で 10 分間スピンダウンします。
   13. 300 μLの上清を6 mLシンチレーションバイアルに移し、4 mLのシンチレーション液を加え、サンプルおよび基質混合アリコート中の放射能をシンチレーションカウンターでカウントする(ステップ2.2.9)。
       警告: 遠心分離後、ヒュームフードの下でチューブを開き、^{脂肪酸β酸化}によって生成し、酸性条件によって放出される 14 C-アセチル-CoA の完全な酸化によって生成される ¹⁴C-Co₂ を呼吸しないようにします。

表1:肝細胞単離および脂肪酸β酸化アッセイに必要な緩衝液、培地、およびその他の溶液

表2:エトモキシルの存在下および非存在下で三連でアッセイされた肝細胞懸濁液についての実験セットアップの例。

ここで説明する肝臓灌流は、トリパンブルー排除によって推定されるように、典型的には3000万〜4000万個の細胞/肝臓を生じ、平均生存率は80%である(図2)。灌流バッファー 1 および 2 の調製に使用される Krebs-Henseleit バッファー (KHB) 中のグルコースの典型的な濃度は 11 mM です。絶食マウスから単離した肝細胞における脂肪酸β酸化を測定する場合、KHB中のグルコース濃度を下げて絶食状態をよりよく表すことができる。 図2に示すように、グルコース濃度を5.6 mMに下げても、肝細胞の収量または生存率に悪影響はない。

表2 は、CPT1の強力な阻害剤であり、したがってミトコンドリア脂肪酸酸化10、13の強力な阻害剤であるエトモキシルの存在下および非存在下で三連でアッセイされた肝細胞懸濁液についての典型的な実験セットアップを示す10、13。これまたは他のミトコンドリア脂肪酸酸化の阻害剤の存在下で、[1-14C]パルミチン酸酸化によって生成される任意の残留 14C標識産物は、ペルオキシソームにおけるβ酸化の第1サイクルに起因する可能性がある。したがって、全脂肪酸酸化に対するミトコンドリア脂肪酸酸化の寄与は、総脂肪酸β酸化(-エトモキシル)とペルオキシソーム(+エトモキシル)脂肪酸酸化7、14、15 の差として計算することができる(図3)。

肝細胞の場合、[1-14C]パルミチン酸のβ酸化の産物に関連する放射能の95%以上がASMに見出され、残りは14C-CO210として放出される。バックグラウンド放射能に関連する1分あたりのカウント数(CPM)は、[1-14C]パルミチン酸のバッチによって変化する。しかしながら、それらは、基質混合物と共に15分間インキュベートさせたサンプルで得られたCPMよりも依然として有意に低い(図3A)。予想されたように、絶食マウスから単離された肝細胞は、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム脂肪酸β酸化の両方の速度の堅固な増加を示し、これらの経路の既知の活性化と一致する16、17、18、19。

図2:本明細書に記載の手順を用いて単離された肝細胞の生存率および収量。 肝細胞を雄マウスから単離し、自由摂取させたり、一晩16〜18時間絶食させたり、水に 自由 にアクセスしたりした。(A)肝細胞生存率および(B)肝臓当たりの収量。データは、SEMの個々の肝細胞調製物(円)に関する測定値の平均(バー)として報告され±、給餌および絶食マウスから単離された肝細胞は、不対の両側スチューデントのt検定を用いて比較された。* p < 0.05. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:給餌および絶食雄マウスから単離し、懸濁状態でアッセイした肝細胞における脂肪酸β酸化能。 新たに単離された肝細胞を、基質混合物を添加する前に、エトモキシル(45μM、+Eto)またはDMSO(ビヒクル、-Eto)と共にプレインキュベートした。(a)各アッセイで導入された総CPMおよびバックグラウンド放射能を推定するために設定された反応のASM画分で回収された総CPM、総(−Eto)、ペルオキシソーム(+Eto)、およびミトコンドリア脂肪酸β酸化。これらのデータは、補正(バックグラウンド、細胞数、またはタンパク質レベル)またはその他の計算が適用される前に表示されます。(B)(A)におけるデータはバックグラウンドについて補正し、アッセイの全体積を、100万個の生細胞に正規化し、給餌および絶食マウスから単離された肝細胞においてパルミチン酸が酸化される速度として表した。(C)使用した推定750,000個の肝細胞/アッセイに対応する総タンパク質。(D)(A)のデータは(B)のように補正されたが、タンパク質のmgに正規化された。データは、SEMの個々の肝細胞調製物(円)に関する測定値の平均(バー)として報告され±、給餌および絶食マウスから単離された肝細胞は、不対の両側スチューデントのt検定を用いて比較された。* p < 0.05;** p < 0.01. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、開示する利益相反はありません。