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方法論記事

マウス線維芽細胞のメラノサイトへの直接リプログラミング

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DOI：

10.3791/62911

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2021年8月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, Jiangsu University, 2Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University

この記事について

サマリー

ここでは、メラノサイト用に最適化されたダイレクトリプログラミングシステムと、スムーズなダイレクトリプログラミングを保証する高効率で濃縮されたウイルスパッケージングシステムについて説明します。

要約

メラノサイトの機能の喪失は白斑につながり、罹患した個体の身体的および精神的健康に深刻な影響を及ぼす。現在、白斑の効果的な長期治療はありません。したがって、白斑の便利で効果的な治療法を開発することが不可欠です。皮膚細胞をメラノサイトに直接リプログラミングする再生医療技術は、白斑の有望な新規治療法であると思われる。これは、白斑患者のメラノサイトの損失を改善するのを助けるために、患者の皮膚細胞を機能的なメラノサイトに直接リプログラミングすることを含む。しかしながら、この方法は、最初にマウス上で試験される必要がある。直接リプログラミングは広く使用されているが、メラノサイトへの直接リプログラミングのための明確なプロトコルはない。さらに、利用可能な転写因子の数は圧倒的である。

ここでは、皮膚細胞をメラノサイトにリプログラミングするために選択された転写因子(Sox10、Mitf、Pax3、Sox2、Sox9、およびSnai2を含む)を産生するための濃縮レンチウイルスパッケージングシステムプロトコルが提示される。マウス胚性線維芽細胞(MEF)を、 インビトロで誘導メラノサイト(iMels)へのMEFの直接リプログラミングのために、これらすべての転写因子について濃縮レンチウイルスに感染させた。さらに、これらの転写因子をスクリーニングし、メラノサイトへの直接リプログラミングのために系を最適化した。iMelsにおけるメラニンの特徴マーカーの発現は、遺伝子またはタンパク質レベルで有意に増加した。これらの結果は、線維芽細胞からメラノサイトへの直接リプログラミングが白斑の新たな治療戦略として成功し、メラノサイト発生のメカニズムを確認し、線維芽細胞からメラノサイトへのさらなる直接リプログラミングの基礎を 生体内で提供できることを示唆する。

概要

白斑は、罹患した個体の身体的および精神的健康に深刻な影響を与える皮膚疾患である。代謝異常、酸化ストレス、炎症メディエーターの生成、細胞剥離、自己免疫応答など様々な理由により、機能的なメラノサイトが失われ、メラニンの分泌が停止し、白斑1,2の発症につながる。この状態は広く発生し、顔に特に問題があります。主な治療法は、コルチコステロイドおよび免疫調節剤の全身使用である。光線療法は全身性または局所疾患に使用でき、穿孔皮膚移植および自家メラノサイト移植などの外科的治療がある3,4,5。しかし、薬物療法や光線療法を使用する患者は再発しやすく、これらの治療法は長期的な治療効果が低い。外科的治療は外傷性であり、適度にしか有効ではない2,6。したがって、白斑には新しく効果的な治療戦略が必要です。

人工多能性幹細胞(iPSC)のリプログラミングは、転写因子Oct4、Sox2、Klf4、およびc-Myc7によって媒介されるプロセスである、これらの細胞を末端状態から多能性状態に逆転させる。しかし、造腫瘍性の可能性と長い生産時間のために、この技術を臨床現場に適用すると懐疑的な見方をされている8。ダイレクトリプログラミングは、あるタイプの端末セルを別のタイプのターミナルセル9に変換する技術である。このプロセスは、適切な転写因子によって達成される。心筋細胞10、ニューロン11、および蝸牛有毛細胞12を含む様々な細胞が、既に首尾に直接再プログラムされている。一部の研究者は、皮膚組織をその場で直接再プログラムし、創傷修復に使用することができる13。直接リプログラミングの利点には、待ち時間とコストの削減、がんのリスクの低下、倫理的問題の減少、および細胞運命決定の根底にあるメカニズムのより良い理解が含まれます9。

直接リプログラミング法は広く使用されているが、特に考慮されるべき多数の転写因子のために、皮膚細胞をメラノサイトに直接リプログラミングするための明確な方法は現在のところ存在しない14,15。転写因子であるMitf、Sox10、およびPax3は、皮膚細胞をメラノサイト14に直接リプログラミングするために使用されている。対照的に、MITFおよびPAX3、SOX2、およびSOX9の組み合わせは、別の研究15において、皮膚細胞のヒトメラノサイトへの直接リプログラミングにも使用されている。このプロトコールでは、異なるスクリーニング方法を使用しているにもかかわらず、先に説明したように皮膚細胞をメラノサイトに直接リプログラミングするためのMitf、Sox10、およびPax3の組み合わせでも同じ結果が得られた14。他の皮膚細胞からメラノサイトを生成するシステムを開発することは、白斑患者の他の皮膚細胞をメラノサイトに変換するためのスキームを提供することができる。したがって、メラノサイトを正常に生成するためには、この直接リプログラミングのための簡単で効率的な方法を構築することが重要です。

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プロトコル

この研究は、江蘇大学実験動物管理使用委員会(UJS-IACUC-AP--20190305010)によって承認されました。実験は、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALACインターナショナル)が定めた基準に厳密に従って実施された。人間を対象とした実験はなかったので、人間研究倫理委員会の承認は必要なかった。試薬の詳細については 、材料表 を参照してください。

1. 転写因子の濃縮レンチウイルスパッケージングシステムの構築

  1. 濃縮ウイルスの産生(図1A、B)
    1. プレート1.5×106個のHEK-293T細胞を60mmディッシュに入れ、これらの細胞を5%CO2の加湿インキュベーター中で37°Cで通常の培地(表1参照)で培養した。
      注: ウイルスをバッチでパッケージ化する必要がある場合は、100 mm の細胞培養ディッシュを使用できます (詳細については、 表 2 を参照してください)。
    2. 24時間後、HEK-293T細胞が形質導入日に80〜90%のコンフルエントに達したことを確認し、培地を3.5mLのDMEM(1cm2あたり150μLのDMEM)と交換する。細胞を5%CO2 で加湿したインキュベーターに37°Cで2時間放置する。
      注: 交換用培地は無血清でなければならず、その結果、細胞はプラスミドのトランスフェクションをより良くするために「飢え」状態になります。
    3. Mitf、Sox10、Pax3、Sox2、Sox9、またはSnai2の標的プラスミド3μgを含むプラスミドの混合物(ミックスA)を調製する。1μgのパッケージングプラスミドPMD2。G、および2μgのパッケージングプラスミドPSPAX2を含む。ミックスAの容量を無血清DMEMで150 μLにします。トランスフェクション試薬 12 μL (体積はすべてのプラスミドの総質量の 2 倍) を加えてトランスフェクション試薬のミックス (ミックス B) を調製し、無血清 DMEM でミックス B の容量を 150 μL にします。
      注:ミックスを準備するときは、気泡を避けるために液体をゆっくりと加えることが重要です。
    4. ミックスAとミックスBを室温で5分間放置した後に組み合わせます。混合物を室温で20〜30分間インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させた。
    5. HEK-293T細胞をインキュベーターから取り出し、培地をDMEM+2%FBSに交換し、ステップ1.1.4の混合物を滴下し、液体を穏やかに混合する。
    6. 8時間後、培地を3.5 mLの通常培地と交換する。培地を交換した後、24時間および48時間ごとにウイルス上清を回収する。
    7. 2つの異なる時点で収集されたウイルス上清を混合する。200 × g で4°Cで5分間遠心分離する。 上清を0.45 μmのフィルターに通し、50 mLの滅菌円錐管に集めます。
      注: 24 時間で収集されたウイルスは、4 °C で保存し、48 時間で収集されたウイルスと混合することができます。
    8. ウイルス上清を4°Cで6000× g で一晩(〜16時間)遠心分離することによって濃縮する。遠心分離後、ウイルスペレットが円錐形のチューブの底に見えることを確認します。
    9. 上澄み液をゆっくりと注ぎます。ウイルスペレットを、ウイルス上清の体積の1/100である体積の通常 培地に溶解する。P1000マイクロピペットを用いて、均一な混合物が得られるまでピペットを穏やかに上下させる。濃縮したウイルスを必要に応じて微量遠心チューブに分割します。-80°Cで保存してください。
      注:この方法では、ウイルスは100倍濃縮されます。濃縮されたウイルス(100倍)は、-80°Cで>1年間保存することができます。 ウイルスの凍結と解凍を繰り返し使用しないでください。
  2. 濃縮ウイルス力価の検出(図1C)
    1. プレート1×105個の HEK-293T細胞を6ウェルプレートの1ウェルに作製した。ネガティブコントロールとしてウェルを1つ追加することを忘れないでください。これらの細胞を5%CO2で加湿したインキュベーター中で37°Cの通常の培地で培養する。
    2. 24 時間後に 0.1 μL または 0.2 μL の蛍光濃縮ウイルス (100x) を各ウェルに追加し、4 ng/μL のカチオン性ポリマートランスフェクション試薬を各ウェルに加えます。感染後約8〜12時間後、培地を通常の培地に交換する。
      注:蛍光検出の精度と効率を確保するために、感染率は10〜30%でなければなりません。0.1 μLまたは0.2 μLの蛍光濃縮ウイルスを添加すると、感染効率をこの範囲内に維持することができる。濃縮されたウイルス力価は、少なくとも1×108 形質導入単位(TU)/ mLに達することができる。
    3. 感染から約48時間後、1mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で皿を洗浄し、死細胞を除去した。
    4. これらの細胞を、6ウェルプレート中の1ウェルあたり250 μLの0.05%トリプシン-EDTAを用いて室温で1分間トリプシン処理する。200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去した。
    5. 細胞ペレットを1mLのPBSに再懸濁し、懸濁液を5mLポリスチレン丸底チューブに加え、フローサイトメトリーを用いてウイルス蛍光(緑色蛍光タンパク質、GFP+)の感染効率を検出した。
    6. 105 (細胞容量) ×感染率 (GFP+%)/添加ウイルス量 (0.1 μL または 0.2 μL) の式を使用して、濃縮ウイルス力価を計算します。

2. 線維芽細胞からメラノサイトへの直接リプログラミング(図2A)

  1. 6ウェル細胞培養プレートの1ウェルを1mLの0.1%ゼラチン溶液で室温で15〜30分間コーティングする。ウェルが0.1%ゼラチン溶液で完全に覆われていることを確認してください。塗布後の0.1%ゼラチン溶液を吸引する。
    注:0.1%ゼラチン溶液(100mL)を以下のように調製する:0.1gのゼラチン粉末をオートクレーブ処理されたガラス瓶の100mLの超純水に溶解し、その後4°Cで2ヶ月以内に保存する。
  2. プレート5×104個の MEFsを0.1%ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに(ステップ2.1と同様に)、これらの細胞を5%CO2 で加湿したインキュベーター中で37°Cで通常培地で一晩培養した。
  3. 24 時間後、MEF が 40 ~ 50% の合流点に達したことを確認します。メディアを通常のメディアと交換してください。
  4. 0日目に、濃縮されたウイルスを冷凍庫から取り出し、氷の上でウイルスを溶かします。式 (1) を使用して、追加するウイルスの量を計算します。計算された容量に従って、6 つの転写因子 Mitf、Pax3、Sox10、Sox9、Sox2、および Snai2 ( 材料表を参照) の濃縮ウイルスを各ウェルに加え、4 μg/mL のカチオン性ポリマートランスフェクション剤を加えます。
    細胞数(5×104)×30(感染多重度、MOI)/ウイルス力価(1)
  5. 感染後8~12時間で1日目に、ウイルスを含む培地を取り出し、0.5μg/mLのピューロマイシンを添加しながら新鮮な正常培地と交換し、安定した感染細胞株をスクリーニングします。
  6. 感染後48時間後の2日目に、上清培地を徐々にリプログラミング培地に交換する。まず、培地全体の1/4番目 を変え、3μM CHIR99021を加える。
  7. 3日目から7日目にかけて、細胞の状態に応じて、徐々にリプログラミング培地の割合が高い( 表1参照)に交換して培地を交換し、5日以内に完全リプログラミング培地に切り替える。
    注:この期間中、ピューロマイシンとCHIR99021は毎日使用する必要があります。多くの死細胞は、リプログラミング培地を交換した1日目と2日目に現れるでしょう。これは、細胞が徐々に形質転換に適応するので正常である。したがって、細胞の健全な増殖を確実にするために培地を徐々に交換する必要がある。
  8. 細胞を継代するために、500 μLの0.05%トリプシン-EDTAを加え、室温で3分間細胞を消化する。細胞の〜60%が浮遊したら、消化酵素の体積の2倍の通常の培地を加えて消化を止める。細胞懸濁液を15 mL滅菌円錐管に集め、200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを初期化培地で再懸濁し、細胞を3×104/cm2の密度で60 mm滅菌ディッシュにプレートした。これらの細胞を加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで培養する。
    注:8日目から21日目まで、これらの細胞は3〜5日ごとに継代培養され、60mm滅菌皿中で増殖する。それらは、少なくとも継代5に達するまで培養することができる。

3. 直接リプログラミングと識別のための最適化

  1. 最適化された転写因子のスクリーニング
    1. 手順 2.1 ~ 2.7 を繰り返し、毎回 6 つの転写因子のいずれかを減らします。MEFを5つの転写因子の組み合わせでウイルスに感染させる。
    2. 感染から7日後、これらの細胞16のRNAを抽出し、逆転写PCR(RT-PCR)17 を用いてメラニン球遺伝子の発現量を解析し、メラノサイトへの変換に最も大きな影響を及ぼす転写因子を1つずつ除去してスクリーニングした(図3A)。
    3. メラノサイトへの変換に影響を与える上位3つの転写因子を使用して、MEFに感染します。手順 2.1 ~ 2.7 を繰り返します。
      注:感染後7日で、メラニン球遺伝子はこれらの形質転換細胞で検出可能であるはずです(図3B)。iMels特性評価のためのプライマー情報は、 表3に含まれる。
  2. 誘導メラノサイト(iMels)の同定
    1. 免疫蛍光染色18 を用いて、iMelsがTYRP-1およびDCTを含むメラニン球性タンパク質を発現することを確認する(図4A)。
    2. メラニン特異的3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(DOPA)染色(図4B)
      1. 4%パラホルムアルデヒド(10mL)を以下のように調製する:0.4gのパラホルムアルデヒド粉末を10mLのPBSに溶解する。溶解を促進するために、溶液を56°Cのオーブンに2時間置く。
        注:溶液は4°Cで1ヶ月以内に保てます。
      2. iMelsを30mmの皿で培養し、予め温めたPBSで皿を2回洗う。1mLの4%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を20分間固定し、PBSでディッシュを3回洗浄した。
      3. 使用直前に0.01 gのL-DOPA粉末を10 mLのPBSに溶解して0.1% DOPA染色液(10 mL)を調製する。溶液を37°Cの水浴中に30分間置く。溶解を促進するために数回振る。
      4. 新たに調製した0.1%DOPA染色溶液1mLを加える。37°Cのオーブン中で2〜5時間インキュベートする。褐色 - 黒色の粒子がない場合は、37°Cでさらに2時間インキュベートし続けるが、>5時間インキュベートしない。30分ごとにサンプルを確認してください。
      5. 毎回PBSで1分間皿を3回洗う。核を1mLのヘマトキシリン染色溶液で2分間染色する。
      6. 長期保存の場合は、95%エタノールを3分間、次いで100%エタノールを5分間使用してサンプルを脱水します。キシレンと中性バルサムで皿を密封する。
    3. メラニン特異的マッソン・フォンタナ染色(図4B)
      1. iMelsを30mmディッシュにプレートし、細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定する。PBSで皿を3回洗う。
      2. Masson-Fontana染色キット( 材料表を参照)から溶液A(アンモニア銀溶液)1mLを加え、皿を暗箱に入れ、暗箱を56°Cのオーブンに15〜40分間置く。
        注:オーブンで15分経過しても茶色 - 黒色の粒子が見えない場合は、サンプルを56°Cのオーブンに戻してインキュベートを続けますが、>40分間はインキュベートしないでください。乾燥を防ぐために、暗い箱に水を加えることができます。
      3. 溶液Aを吸引し、蒸留水で皿を5〜6回、毎回1〜2分間洗浄する。
      4. マッソンフォンタナ染色キットから1mL溶液B(ハイポ溶液)を加え、皿を室温で3〜5分間放置する。
      5. 溶液Bを吸引し、水道水で皿を3回、毎回1分間洗浄する。
      6. マッソンフォンタナ染色キットから溶液C(中性赤色染料)1mLを加え、皿を室温で3〜5分間放置する。
      7. 溶液Cを吸引し、蒸留水で皿を3回、毎回1分間洗浄する。
      8. 急速脱水のために1mLの100%エタノールを加え、3分後にエタノールを吸引する。
        注:染色されたサンプルは、キシレンおよび中性バルサムで密封した後、長期間保存することができます。

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結果

本稿には、メラノサイトへの線維芽細胞の直接リプログラミングのための転写因子のレンチウイルスを産生するための濃縮レンチウイルスパッケージングシステムのプロトコルと、MEFからの転写因子のスクリーニングおよびメラノサイトの直接リプログラミングのためのプロトコルが含まれています。

濃縮レンチウイルス産生の成功は、HEK-293T細胞を非濃縮レンチウイルス(1x)および濃縮レンチウイルス(100x)で48時間感染させた後、GFPの蛍光強度を観察することによって(図1A)またはフローサイトメトリー(図1B)によって評価した。濃縮されたウイルスの力価は108TU /mL以上であり、比較的高い(図1C)。

メラノサイトへの線維芽細胞の直接リプログラミングは、転写因子レンチウイルスによる感染および最適化されたリプログラ...

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ディスカッション

ウイルスの品質は、このプロトコルにおけるメラノサイトへの直接リプログラミングの成功に不可欠です。このプロトコルでウイルスをパッケージングして濃縮する方法は、簡単で繰り返しが容易であり、他の補助濃縮試薬に依存しない。このプロトコルは、ほとんどの研究室でうまく従うことができます。濃縮ウイルスの品質を確保するためには、以下の点に特に注意が必要です。一つはHEK-293Tのセル状態です。HEK-293T細胞は不死化細胞であるが、濃縮ウイルスを作るために使用される細胞は、10継代以内の健康な細胞でなければならない(力価は継代が高いほど減少する)。

もう1つの臨界点は、使用されるトランスフェクション試薬(この場合はリポフェクタミン)の割合です。トランスフェクション試薬を添加した後に細胞が損傷するため、プラスミドに対する試薬の比率を繰り返しチェックして、細胞の最適な状態とウイルスの品質を確認する必要があります。プラスミドに対するトランスフェクション試薬の比率は2:1で、このシステムにウイルスをパッケージングするためのHEK-293T細胞に最適です。さらに、すべてのステップは、プロセス全体を通して...

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開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(82070638および81770621)および江蘇省自然科学財団(BK20180281)からの助成金によって部分的に支援された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン EDTAGibco25300-062-20 °C で保存C
0.45 μMフィルターミリポアSLHVR33RB
5 mL ポリスチレン丸底チューブファルコン352052
95%/100% エタノールLANBAO210106RT
で保存 アデニンSigmaA2786ストック濃度 40 mg/mL
最終濃度 24 & マイクロ;g/mL
Alexa Fluor 555 ヤギ抗マウス IgG2aInvitrogenA21137:500 希釈して
抗生物質を使用(Pen/Strep)Gibco15140-122-20 °C で保存;C
抗TRP1/TYRP1ミリポアMABC592宿主/アイソタイプ:マウス IgG2a
種反応性:マウス/ヒト
抗TRP2/DCT抗体アブカムab74073宿主/アイソタイプ:ウサギIgG
種反応性:マウス/ヒト CHIR99021ステムジェントを使用するための1:200の希釈
04-0004ストック濃度 10 mM
最終濃度 3 μM
コレラ毒素ΣC8052ストック濃度 0.3 mg/mL
最終濃度 20 pM
Cy3 ヤギ抗ウサギIgG (H+L)ジャクソン免疫研究111-165-144
DMEM (高グルコース)HyCloneSH30243.014 °C;C
DMSO SigmaD2650RT
FBSGibco10270-10620 °Cで保管。C
使用前に熱不活性化
ゼラチンシグマG9391RT
GFP-PURO プラスミド (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)。pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325-20 °Cで保存;C
ヘマトキシリンAbcamab220365RT
ヒト EDN3アメリカンペプチド88-5-10Aストック濃度 100 μM
最終濃度 0.1 μM
ヒドロコルチゾンΣH0888ストック濃度 100 & マイクロ;g/mL
最終濃度 0.5 & マイクロ;g/mL
L-DOPASigmaD9628RT
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019トランスフェクション試薬、4°Cで保存;C
Masson-Fontana染色キットSolarbioG20324°Cで保存;C
ニュートラルバルサムSolarbioG85904°C;C
パラホルムアルデヒドΣ P6148RT
PBS で保存 (-)GibcoC10010500BTRT
で保存 ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (TPA)ΣP8139ストック濃度 1 mM
最終濃度 200 nM
ポリブレンΣH9268カチオン性高分子トランスフェクション試薬;ストック濃度 8 μg/µL
最終濃度 4 ng/µL
ピューロマイシンGibcoA11138-03-20°C;C
組換えヒト bFGFInvitrogen13256-029ストック濃度 4 μg/mL
最終濃度 10 ng/mL
組換えヒトインスリンSigma I3536ストック濃度 10 mg/mL
最終濃度 5 &g/mL
組換えヒト SCFR&D255-SC-010ストック濃度 200 μg/mL
最終濃度 100 ng/mL
RPMI-1640Gibco11875-0934 °C;C
キシレンシグマ1330-20-7RT で保管
1抗体 を使用するための1:200の希釈 - に保管されています

参考文献

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