完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成

サマリー

ここでは、定義されたプロテオリポソームにおける完全に精製された成分を用いたMsp1抽出活性の再構成のための詳細なプロトコルを提示する。

要約

酸化リン酸化とアポトーシス調節の中心として、ミトコンドリアは人間の健康に重要な役割を果たします。適切なミトコンドリア機能は、タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)を維持するための堅牢な品質管理システムに依存します。ミトコンドリアプロテオスタシスの低下は、癌、老化、神経変性、および他の多くの疾患に関連している。Msp1は、ミトコンドリア外膜に固定されたAAA+ATPaseであり、誤局化したテールアンカータンパク質を除去することによってプロテオスタシスを維持します。精製した成分をプロテオリポソームに再構成し、Msp1が脂質二重層からモデルのテールアンカータンパク質を抽出するのに十分であることを示しました。当社の簡略化された再構成システムは、膜タンパク質抽出の詳細な研究を妨げている技術的障壁のいくつかを克服します。ここでは、リポソームの生成、膜タンパク質の再構成、Msp1抽出アッセイの詳細な方法を提供します。

概要

適切な細胞機能は、機能的タンパク質が正しい濃度と細胞位置¹であることを保証するプロテオスタシスと呼ばれるプロセスに依存します。プロテオスタシスの障害は、オルガネラ機能の低下を招き、多くの神経変性疾患^2、3、4に関連している。膜タンパク質は、疎水性膜貫通ドメイン(TM)5からの凝集を避けながら、正しい膜を標的としなければならないプロテオスタシスネットワークに固有の課題を提示する。その結果、特殊化された機械は、疎水性TMDをサイトゾルから保護し、適切な細胞膜6、7、8、9、10、11、12、13、14、15への標的化と挿入を容易にするために進化しました。

ミトコンドリアは細胞の代謝ハブであり、酸化リン酸化、鉄硫黄クラスター生成、アポトーシスレギュレーション^16、17など、数多くの必須細胞プロセスに関与している。これらの子宮内生体オルガネラは、ミトコンドリア膜(IMM)および外ミトコンドリア膜(OMM)と呼ばれる2つの膜を含む。1,500個のヒトミトコンドリアタンパク質の99%以上が核ゲノムにコードされており^、1つまたは2つの異なる膜^18、19に渡ってトランスロケーションする必要がある。したがって、適切なミトコンドリア機能は、タンパク質ターゲティングまたは転座の誤差を修正するために、堅牢なプロテオスタシスネットワークに依存します。

私たちの研究室では、非常にC末に^{20、21、22、23、24}の単一の膜貫通ドメインを有する、尾アンカー(TA)タンパク質と呼ばれるミトコンドリア膜タンパク質のサブセットに焦点を当てています。TAタンパク質は、アポトーシス、小胞輸送、およびタンパク質転座²⁵などの多くの必須プロセスに関与している。TAタンパク質のユニークなトポロジーは、尾アンカー(GET)またはエンドパラムレチラム膜タンパク質複合体(EMC)経路によって導付入り(GET)によって小胞体(ER)で起こる、または十分に特徴付けの経路^{20、26、27、28}によってOMMに起こる翻訳後挿入^{を必要とする}。TMDの生物物理学的性質は、TAタンパク質を正しい膜²⁹に導くために必要であり、十分である。定義された配列モチーフではなく生物物理学的特徴の認識は、標的経路⁵の忠実さを制限する。したがって、TAタンパク質の誤局在化は、プロテオスタシスネットワークに対する一般的なストレスである。細胞ストレスは、GET経路の阻害などの、これらのタンパク質が速やかに除去されない限りOMMおよびミトコンドリア機能障害に対するタンパク質の誤局在化の増加を引き起こす^30,31。

膜プロテオスタシスの一般的なテーマは、AAA+ (細胞A ctivitiesでソシエ化されたTPase A)タンパク質を使用して、脂質二重層^{1、32、33、34、35、36、37、38}から古い、損傷した、または誤局化したタンパク質を除去^{することです。} .AAA+タンパク質は、六方体環を形成し、基板を改造するためにATP依存的な動きを受ける分子モーターであり、しばしば狭い軸孔^39、40を通して転位することによって。AAA+ATPasesによる膜タンパク質の抽出の研究には多大な努力が必要であったが、再構成は複雑であるか、脂質と洗剤^41,42の混合物を含み^、脂質二重層からの基質抽出のメカニズムを調べる実験力を制限する。

Msp1は、OMMおよびペルオキシソームに固定された高度に保存されたAAA+ATPaseであり、誤局化したTAタンパク質43、44、45、46、47を除去することによって膜プロテオスタシスにおいて重要な役割を果たす。Msp1は、OMM⁴⁸を横断する転座の間に失速する膜タンパク質を除去することによって、ミトコンドリアタンパク質のインポートストレスを軽減することも最近示された。Msp1またはヒトホモログATAD1の喪失は、ミトコンドリア断片化、酸化リン酸化の障害、発作、脳卒中後の傷害の増加、および早期死亡31、49、50、51、52、53、54、55、56をもたらす。

我々は、TAタンパク質をMsp1と共再構成し、脂質二重層⁵⁷からの抽出を検出することが可能であることを示した。この簡略化されたシステムは、完全に精製されたタンパク質を、OMM(図^1)58、59を模倣する定義されたリポソームに再構成して使用^する。このレベルの実験的制御は、他のAAA+タンパク質を含むより複雑な再構成で実験的に難解な基質抽出の詳細な機械学的な質問に対処することができます。ここでは、リポソーム調製法、膜タンパク質再構成法、抽出アッセイの方法を詳述した実験的プロトコルを提供します。これらの実験の詳細が、膜プロテオスタシスの本質的だが十分に理解されていないプロセスのさらなる研究を促進することを期待しています。

プロトコル

1. リポソーム製剤

1. 適切な比率で脂質のクロロホルムストックを組み合わせて、外のミトコンドリア膜を模倣します。
   1. 脂質混合物の25mgを調製します。ミトコンドリア膜を模倣する脂質の既に確立された混合物を使用し、 鶏卵ホスファチジルコリン(PC)、鶏卵ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ウシ肝臓ホスファチジルイノシトール(PI)、合成1,2-ジオレオイルの48:28:10:10:4モル比から成る -sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)、および合成1',3'-ビス[1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ]グリセロール(TOCL)58,^59.サンプル計算は、表 1に示されています。
   2. これは凝縮を制限するので、開く前に室温にすべての脂質ストックを持参してください。ほとんどの研究室では脂質の濃度を正確に測定する方法がないため、クロロホルムストックによって吸収される水は、脂質ストックの濃度を変化させ、従ってアッセイで使用される脂質の比率を変化させます。
   3. 脂質ストックがガラスアンプルに入ってくるので、必要な量の脂質を1mLのシリンジを使用してガラスバイアルに移します。バイアルにジチオトレイトール(DTT)を2mg加え、脂質酸化を防ぎます。クロロホルムの蒸発が脂質の濃度を変化させますように迅速に作業します。
   4. 残った脂質を別のガラスバイアルに移し、PFTEセプタと合わせます。2mgのDTTをバイアルに加え、パラフィルムで包み、-20°Cで保存して脂質酸化を防ぎます。バイアルへの移写から3ヶ月以内に脂質を使用するようにしてください。マーカー流出によるクロロホルムストックの潜在的な汚染を防ぐには、マーカーでラベルを付けるのではなく、元のアンプルからガラスバイアルにステッカーを転送します。
2. ガスフードでガラスバイアルを手で連続して回転させながら、窒素の非常に穏やかな流れの下でクロロホルムを蒸発させ、本質的に手動ロトバップとして機能します。バイアルを一貫した速度(20~40 rpm)で回転させ、脂質を動かし続けます。目標は、すべてのクロロホルムを蒸発させ、ガラスバイアル全体に脂質の均一なコーティングを取得することです。
   注意:クロロホルムは神経毒性であり、このステップはヒュームフードで行われるべきです。
   1. 窒素管に新鮮なパスツールピペットを取り付けます。バイアルからまたはパスツールピペットに脂質を飛び出させないでください。空気が底から跳ね返り、バイアルの中心に向かって脂質を押し上げるので、バイアルの底部の先端を目指します。コーナーやキャップの蓄積を避けながら、バイアル全体に均一なコーティングを取得します。このプロセス全体は約5分かかります。
   2. 混合物が脂質の「ビーズ」に厚くなるにつれて、バイアルの角度を変えることによってバイアルの中心に導きます。ビーズが小さくなり始めたら、窒素気流をわずかに上げてビーズを分散させ、バイアルから脂質が吹き出さなくなることを保証します。
3. 残りのクロロホルムを真空下で取り除きます。
   1. ガラスバイアルをハウス真空またはダイヤフラム真空ポンプに1時間置き、残留クロロホルムの大部分を除去します。これらの真空は、一般的にクロロホルムのすべてを除去するのに十分な強度ではありませんが、回転無駄な真空よりも少量の溶媒を許容することができます。
   2. 強い真空(<1 mTorr)にバイアルを12〜16時間置き、残留クロロホルムをすべて除去します。このプロセス中にバイアルのぶつかりは避けてください。
4. リポソーム緩衝液の1.25 mLに脂質を再懸濁する(50 mM HEPES KOH pH 7.5、15%グリセロール、1 mM DTT)。25 mg の脂質から始めたように、20 mg/mL の濃度になります。目に見える塊のない脂質を完全に再中断する。バイアルの隅に脂質が溜まった場合、これは長いプロセスになる可能性があります。
   1. サンプルが乳白色になるまで、バイアルを激しく渦液化します。クロロホルム蒸発が前の晩に適切に行われた場合、このプロセスは約5〜10分かかることがわかります。
   2. 脂質の完全な再懸濁を確実にするため、室温で車輪を3時間~80rpmで回転させます。1時間に1回バイアルを取り出し、1分間の渦を取り除き、均一に混合します。
5. 脂質をクリーンな1.5 mLマイクロ遠心チューブに慎重に移します。液体窒素を使用して凍結し、30°Cのヒートブロックを使用して解凍します。このステップは、多層小胞をユニラメラ小胞に変換するのに役立ちます。
6. 脂質を押し出す。
   1. 凍結解凍サイクル中に、ミニ押出機を準備します。10 mmフィルターサポートと所望の細孔サイズのポリカーボネート膜でミニ押出機を組み立てます(我々は200 nmを使用します)。フィルターのサイズはリポソームのサイズに影響を与え、再構成に必要なタンパク質の濃度に影響を与える(ステップ2.3)。
   2. ミニ押出機をホットプレートに置き、押出機の温度を60°Cまで下ろします。
   3. 脂質を1 mLのガスタイトガラスシリンジに引き上げ、ミニ押出機の一端に慎重に入れます。空のガス密着注射器をミニ押出機の反対側に入れる。脂質を押出機スタンド温度に5~10分間平衡させます。
   4. 充填したシリンジのプランジャーを軽く押して、脂質を代替シリンジに移します。代替シリンジから元のシリンジに溶液を押し込みます。この前後のプロセスを15回繰り返し、15^回目 に脂質が代替シリンジで終わるようにします。各パスのボリュームを監視して、リークがないことを確認します。
7. 脂質の単一使用アリコートを準備し、液体窒素でフラッシュフリーズし、-80°Cで保存します。 リポソームは、数ヶ月間-80°Cで安定しています。再構成には一度に10μLのリポソームが必要です(ステップ2.3.4)ので、10μLまたは20μLのアリコートを調製するのが便利です。

2 Msp1およびモデルTAタンパク質の再構成

1. 再構成バッファーを準備する:50 mM HEPES pH 7.5、200 mM酢酸カリウム、7 mM酢酸マグネシウム、2 mM DTT、10%スクロース、0.01%アジドナトリウム、0.2-0.8%デオキシビッグチャップス(DBC)。
   1. リポソームの新しいバッチの再構成条件を最適化します。最適な再構成に必要なDBCおよびバイオビーズの濃度は、使用されるリポソームのバッチによって異なります。準備のばらつきを制限するには、すべての実験に同じ DBC を使用します。DBC の多くを変更する場合は、最適化プロセスを繰り返します。
   2. リポソームの新しいバッチが調製されるたびに、DBC(0.2%-0.8%)およびバイオビーズ(25mg - 100mg)の異なる濃度の一連の再構成を設定する。DBCを0.12%の臨界ミセル濃度(CMC)以下に落とさないことが重要である。条件が最適化されたら、同じリポソーム準備条件と再構成条件を使用してすべてのデータを収集することをお勧めします。
   3. 工程3に記載の抽出アッセイを用いて種々の再構成条件の有効性をアッセイする。
2. 250 mg/mL の最終濃度でバイオビーズを調製します。
   1. 乾燥したバイオビーズの2.7gを計量し、50 mLの遠心分離管で100%メタノール(約45mL)を再懸濁して、ビーズを湿潤させます。最初は、空気がビーズの毛穴に閉じ込められるのを防ぐためにメタノールでバイオビーズを濡らします。メタノールに入ると、バイオビーズに閉じ込められた空気が洗剤を吸収する能力を変えるため、バイオビーズを濡らしてください。
   2. 約45mLの超純水(18.2mΩ)でビーズ8xを洗浄してメタノールを除去し、以下、3,200 x gで1分間回転させてddH₂O.ペレットビーズと呼びます。液体をデスキャンし、ddH₂Oで再中断する。
   3. 洗浄後、0.02%のアジドナトリウムで10mlのddH₂Oで再懸濁し、4°Cで保管します。 バイオビーズは、4°Cで数ヶ月間保存することができます。洗浄工程中に0.2gが失われると想定される250mg/mLです。
3. リポソームのサイズとTAタンパク質の分子の所望の数とリポソーム当たりのMsp1を計算します。これにより、再構成に必要なMsp1およびTAタンパク質の濃度が決定されます。
   1. まず、dがリポソームの 直径、hが二重層の厚さ、およびaが脂質ヘッドグループ領域である式を用いて、ユニラメラリポソーム当たりの脂質分子数(N total)を計算する。
      1. DLSでリポソーム径を測定します。この例では、リポソーム径(d)に対して70nmの値が得られた。
      2. h の場合は 5 nm、ホスファチジルコリンのヘッドグループ サイズである aの場合は 0.71 nm²の値を使用します。この特定の状況では、N_の合計は37,610です。
   2. 次に、混合物中の脂質の平均分子量を用いて脂質M脂質のモル濃度を算出する。この例では、脂質の濃度は20mg/mL(ステップ1.4)であり、脂質の平均分子量は810g/molである(表1)。この結果、M Lipid の値は 0.0247 M_{になります}。
   3. 次に、リポソームM_{リポソーム}のモル濃度を計算し、 ステップ2.3.2からM_Lipidが脂質のモル濃度である式を用いて、N_の合計はステップ2.3.1で計算したリポソーム当たりの脂質の総数である。この例では、リポソームの20mg/mLストック濃度は約660nMである。
   4. 100 μL再構成反応に必要なMsp1およびTAタンパク質の量を計算します。
      注:再構成中の脂質の最終的な濃度は2mg /mLであり、これはリポソームストックの10倍の希釈である。これは66 nMの最終的なリポソーム濃度を与える。Msp1の最終濃度は792 nMで、リポソーム当たり平均12コピー(2機能ヘキサマー)を与えます。TAタンパク質の最終的な濃度は660 nMであり、これはリポソーム当たり平均10コピーを与える。
4. PCR チューブで、精製された Msp1、TA タンパク質、リポソームを再構成バッファーに混ぜ合わせます。添加の順序は、バッファー、タンパク質、リポソーム最後です。総容積は100 μLである。混合物を10分間氷の上に座るようにします。Msp1およびTAタンパク質を、前述の⁵⁷と同様に精製する。
   1. 初めてアッセイを確立する際には、よく特徴付けられるTAタンパク質His-Flag-相撲Sec22を正の対照基質として使用してください。この構成体は、容易な精製のためのHisタグ、ウェスタンブロットによる検出用の3xフラグタグ、溶解度を高める相撲ドメイン、およびMsp1による再構成と認識のためのER-TAタンパク質Sec22のTMDを有する。
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結果

結果を正しく解釈するには、染色フリーゲルとウェスタンブロットを一緒に見る必要があります。染色フリーゲルは、すべてのサンプルで等しい負荷を保証します。染色フリーゲルを見ると、シャペロン(GST-カルモドゥリンおよびGST-SGTA)がINPUT(I)およびELUTE(E)レーンに表示されます。これらのバンドの強度がすべての INPUT サンプルで均一であることを再確認します。同様に、輝度が ELUTE サンプル全体で均一であることを確認します。ELUTEはINPUTよりも5倍の濃縮値を持っており、この強度の差はゲルに見えます。

染色フリーゲルを使用して適切なローディングを確認した後、ウェスタンブロットを調べて抽出活性を決定します。抽出活性を測定するには、INPUT(I)分数に対するELUTE(E)分数中の基材の量を比較する。フロースルー(FT)の信号は、ある程度の変動性を示していますが、一般的にはINPUTの端数に似ています。WASH(W)の分数にシグナルが存在しないはずです。典型的には、陰性対照における陽性対照と1〜2%の抽出効率に対して...

ディスカッション

適切なミトコンドリア機能は、堅牢なタンパク質の品質管理システムに依存します。TAタンパク質ターゲティング経路の忠実度に固有の限界のために、誤局化TAタンパク質はミトコンドリアのストレスの一定の源です。ミトコンドリアプロテオスタシスネットワークの重要な成分はMsp1であり、これはOMMから誤局的なTAタンパク質を除去する膜固定AAA+ATPaseである。ここでは、プロテオリポソームを調製する方法について、Msp1とモデルTAタンパク質を共同再構成し、抽出アッセイを行う方法について述べた。我々は以前、このアッセイを用いて、Msp1が誤局性TAタンパク質を直接認識し、これらのタンパク質を補助タンパク質または補因子⁵⁷を使用せずに脂質二重層から抽出できることを実証した。

アッセイの欠点は、再構成プロセスに多少のばらつきがあることです。準備から準備への可変性を制御するために、我々は常に我々のアッセイが意図したとおりに動作していることを確認するために、同じゲル/ウェスタンブロットに正と負のコントロールを含めます。異なる日に行われた再構成の比較や、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Biobeads	Bio-Rad	1523920
Bovine 肝臓 ホスファチジル イノシトール	Avanti	840042C	PI
鶏卵 ホスファチジルコリン	Avanti	840051C	PC
鶏卵 ホスファチジルエタノールアミン	Avanti	840021C	PE
ECL ウェスタンブロッティング検出試薬	GE	RPN2235
フィルターはAvanti		610014
ガラスバイアル	VWR	60910L-1
グルタチオンスピンカラム	サーモフィッシャー	PI16103
ヤギ反ウサギ	サーモフィッシャー	NC1050917
ミニ押出機	Avanti	610020
ポリカーボネートメンブレン	Avanti	610006	200 nM
PVDFメンブレン	Thermo Fisher	88518	45 µM
Rabbit anti-FLAG	Sigma-Aldrich	F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti	840035C	DOPS
Synthetic 1',3'-ビス[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol	Avanti	710335C	TOCL
シリンジ、1 mL	Norm-Ject	53548-001
シリンジ、1 mL、気密性	アバンティ	610017