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方法論記事

イン・シトゥ メサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション

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DOI:

10.3791/62930

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2021年8月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

ゼブラフィッシュは腎臓の発達を理解するための重要なモデルです。ここで、イン ・シチュハイブリ ダイゼーションプロトコルは、メサネフォロスの発生中にゼブラフィッシュ幼虫および若年者の遺伝子発現を検出するように最適化される。

要約

ゼブラフィッシュは、その生涯で2つの腎臓構造を形成します。この発症(胚性腎臓)は、胚発生時に形成され、受精後2日で機能し始める。2つのニーフロンだけで構成され、体重増加のためにより多くの腎機能が必要になるまで、幼虫の生活の間に唯一の腎臓として機能する傾向があります。この高い需要に対処するために、メソネフロス(成人腎臓)は変態の間に形成し始める。新しい一次ニーフロンは、傾向のある咽頭に融合し、接続されたルーメンを形成する。次に、二次ニーフロンは一次のネフロンに融合し(など)メソネフロスに分岐ネットワークを作ります。研究の大半は、胚の使用の容易さのために、傾向に焦点を当てています。したがって、 メサネフォロスの開発をよりよく理解するために、古くて大きな幼虫と若年魚を研究する技術を開発する必要があります。.ここでは、遺伝子発現解析のための in in in 遺伝子発現促進プロトコルが、プローブの浸透、プローブおよび抗体の洗浄、およびメサネフロスをよりよく可視化するための顔料の漂白に最適化されている。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインは、前駆細胞および新生性ネフロンの遠位細管を標識するために使用されます。このプロトコルは、メサネフロス研究のギャップを埋めます。これは、新しい腎臓組織がどのように形成され、既存のニーフロンと統合し、再生療法に関する洞察を提供するかを理解するための重要なモデルです。

概要

ゼブラフィッシュ胚は、その小さなサイズ、透明性、利用可能なツール、および最大5日間の給餌なしで生存のために組織の発達を研究するための重要なモデルです1,2。これは、ゼブラフィッシュと哺乳類の間の腎臓の発達と保全の理解に大きく貢献してきました3,4,5.腎臓は、体液性恒常性を維持し、血液を濾過し、廃棄物を排泄する上で不可欠な役割を果たす6。腎臓の機能単位である腎は、長い細管に接続された血液フィルターを含む。ゼブラフィッシュでは、2つの腎臓構造がその生涯を通じて形成される。発症初期の初期の段階で最初に形成される傾向がある(一時的な胚性腎臓)。それは前部後軸に沿って走る2つの腎で構成され、受精後2日(dpf)の周りに機能する。この傾向の有用性は、その単純性にあり、ほとんど線形で視覚化しやすい2つのニーフロンを持っています(ただし、近位畳の尿細管は3 dpfでコイルし始めます)。これは中間中期からその初期の開発の研究を促進しただけでなく、セグメンテーションパターンおよび管状の修理7,8を促進した。

ゼブラフィッシュの有用性は、黄身が減少し、幼虫が水生系での給餌に依存する5dpf後に制限される。生後約2週間で、幼虫は若年に変態を受け、新しい組織が形成され、古い組織が失われたり再編成されたりする。これはまた、メソネフロス(永久成人腎臓)が10,11,12を形成する場合である。最初の成人のネフロンは、第六のスマイトの近くに形成され、そして、傾向のある初期の尿細管と融合する。追加のニーフロンは、最初はこの位置に後部を追加されますが、後で前部に向かっても追加されます。この最初の波の主なネフロンは、傾向のある尿細管に融合し、廃棄物を堆積させるために共通のルーメンを共有しています。二次ニーフロンは次の波で形成され、一次ネフロンに融合する。この繰り返しのプロセスは、哺乳類の腎臓にやや似た分岐しているメソネフロスを作成します。おそらく、傾向のあるフロスは最終的にその尿細管の同一性を失い、すべてのネフロンが彼らの廃棄物を排出する2つの主要な収集ダクトになります13。

最初の成体腎の形成に先立ち、単一の前駆細胞は、〜4mm(全長)幼虫(〜10dpf)で出現し始める。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインに印が付いているこれらの細胞は、傾向に付着し、腎生原の将来の部位に移行するように見える。単一の細胞はクラスターに合体し、新しいnephrons12に分化する。これらの細胞がどこに存在するか、または彼らがメサネ咽頭形成の発症前にどのような遺伝子を発現するかは不明である。

メソネフロスの発達を理解することは、哺乳類腎臓に対する洞察を、傾向のある人にはできない方法で提供する。これらには、単一の前駆細胞からのネフローゲン凝集体の形成、既存のネフロンとの新しいネフロンの機能的統合、および分岐形態形成が含まれる。しかし、胚後の発達を研究することには限界があります。幼虫は大きな大きさと色素沈着のため、透明度が低くなります。発達タイムラインは個々の動物間で同期的ではなく、摂食や混雑などの環境要因に大きく依存しています。ノックダウン試薬は存在するが、胚15に比べて幼虫の効果は低い。本プロトコルでは、ゼブラフィッシュメソネフロスの発生時に遺伝子発現を決定するin in situハイブリダイゼーション法について説明する。いくつかのステップは、メゾンフォロスの可視化とプローブおよび抗体の浸透および洗浄を増加させるために最適化されています。Tg(lhx1a-EGFP)トランスジェニックラインは、EGFP用プローブとともに、単一の前駆細胞、ネフローゲン凝集体、および新生ネフロンの遠位細管を標識するために使用されます。この方法は、メソネフォロスの開発のより深い理解と再生療法への洞察を提供します。

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プロトコル

ゼブラフィッシュの幼虫と少年の使用は、IUP IACUC(プロトコル#02-1920、#08-1920)によって承認されています。ソリューションの内容の詳細は、 材料表にリストされています。

1. 幼虫を育てる

注:幼虫や少年を対象段階まで上げるには、最大21日以上かかります。

  1. 最後の食事の後、午後遅くに交配タンクに1匹のオスと1匹のメスの魚を加えて、成虫のゼブラフィッシュを合分するように設定します。
    注:すべての魚のペアが交尾するわけではありません。20組を設定して交配速度を決定し、今後の実験で調整します。
  2. 魚が交尾を終えた翌日(午後1時頃)、ペトリプレートにE3培地で胚を集めます。
    1. プレートあたり30個以下の胚を確認してください。
    2. ペトリプレートから破片(便などの)を取り除き、20mLのE3培地を加えます。
    3. 28.5 °Cで1日インキュベートします。
  3. 成虫のゼブラフィッシュを水生系に戻します。
  4. 1 dpf で、E3 メディアを新しい E3 に交換します。
    1. 28.5 °Cで5dpfまでさらに4日間インキュベートする。
  5. 400 μmのスクリーンを2.8 Lタンクに入れ、2cmのシステム水で満たします。
    1. 1プレートから5 dpf幼虫を加えます(合計30個の幼虫まで)。
    2. 水生システムにタンクを入れて、水の流れを開始しないでください。
  6. 幼虫に14dpfまで1日2回の粉末食品4mLを供給します。
  7. 6 dpfで、毎秒1点滴で水の流れを開始します。
    注:毎日の水流を確認し、それに応じて調整してください。
  8. 8 dpf で、ゆっくりと安定した流れに水の流れを増やします。
  9. 14 dpfで、粉末食品に加えて生きた塩水エビを供給します。

2. 1日目~2日目:幼虫の固定

  1. 目的のタイムポイントで幼虫のタンクを取り外します。
  2. ペトリプレートに20mLのシステム水を充填します。
  3. 細かいメッシュネットを使って幼虫をそっとすくい、水面に持ち込みます。
    1. 転写ピペットの先端を切り落とし、より広い開口部を与え、幼虫をペトリプレートに移します。大きなピペットの口は、いくつかの小さな幼虫またはいくつかの大きな幼虫を一度に移すことができる。
  4. 2 mLのトリケーヌ(2%、pH 7ストック)を加えて幼虫を固定化します。
    1. 幼虫が動かなくなった後、水の大部分を取り除き、10mLのトリケーヌを加えます。幼虫が安楽死するまで15分待ちます。
    2. 任意:8mmより長い少年の場合、解剖顕微鏡の下で(安楽死後)カミソリの刃で頭と尾を切り落とし、固定溶液の浸透を改善します。頭と尾を切断する前に、各動物の全長を記録し、独自のペトリプレートにそれぞれを分離してください。動物の測定方法については、ステップ3を参照してください。
  5. トリケーヌを20 mLの固定溶液(4%パラホルムアルデヒド、1%DMSO)に交換してください。ペトリプレートに蓋を戻し、煙のフードでゆっくりと揺れます。
    メモ: ロッキングプラットフォームを使用することが重要です。円運動を伴う揺れプラットフォームは、動物軸を湾曲させます。新鮮な(あらかじめ作られていない冷凍)固定溶液のみを使用してください。
    注意:固定溶液には、発がん性物質である可能性のあるパラホルムアルデヒドが含まれています。ヒュームフード(またはマスク)と手袋を使用して、粉末を測定します。
  6. 30分後、固定溶液を新しい固定溶液に交換します。
    1. 適切な廃棄のために別の廃棄物容器に使用された固定溶液を収集します。
    2. 幼虫を25mLの新鮮な固定溶液を含む50 mLチューブに移します。
    3. キャップがしっかりとして、4°Cで2日間ゆっくりと揺れ動かないようにしてください。利便性のために、より長くインキュベートすることが可能です。

3. 3日目:幼虫の測定

  1. ヒュームフードで、20 mLのPBSTで固定溶液を交換してください。
  2. 幼虫をペトリプレートに移します。
  3. 解剖顕微鏡の上に平らな定規を置き、定規の上にペトリプレートを置きます。
  4. まつげマニピュレータを使用して、各幼虫を定規に移動して、全長(鼻から尾端の先端まで)を測定します(図1)。
  5. 同じような長さ(例えば、5.0 mmと5.1mm)のいくつかの幼虫を1つの5.5 mLガラスバイアル(バイアルあたり最大10の幼虫)に組み合わせます。

4. 3日目~4日目:脱水症状

  1. PBSTを100%メタノールの4mLに交換してください。室温で5分間バイアルを揺らします。
  2. メタノールを新鮮なメタノールと岩に5分間交換します。もう一度繰り返します。
  3. バイアルは-20°Cで2日間保管してください。利便性のために、より長くインキュベートすることが可能です。

5. 5日目:水分補給

  1. バイアルを室温まで温めます。
  2. メタノールを75%メタノール/25%PBSTの4 mLに交換してください。室温で5分間のロック。
  3. ステップ5.2の溶液を50%メタノール/50%PBSTの4 mLに交換し、5分間ロックします。
  4. ステップ5.3の溶液を25%メタノール/75%PBSTの4 mLに交換し、5分間ロックします。
  5. ステップ5.4の溶液を4 mL PBSTに交換し、10分間ロックします。
  6. PBSTを4mLの新鮮なPBSTと10分間の岩に交換してください。もう一度繰り返します。

6. 5日目:プロテアーゼKダイジェスト

  1. PBSTをプロテナーゼK溶液2mL(20μg/mL、PBST中の1%DMSO最終濃度)に交換し、室温で30分間ロックします。
    注:6mmより長い幼虫は、より長いインキュベーション時間および/またはより高いプロテイナーゼK濃度を必要とします。正確な時間と濃度は経験的に決定する必要があります。6 mm より長い 0.5 mm ごとに 10 分のインキュベーション時間を増加させます。
  2. プロテイナーゼK溶液を4 mLのPBSTと10分間の岩石に交換してください。
  3. PBSTを4mLの新鮮なPBSTと10分間の岩に交換してください。もう一度繰り返します。
  4. PBSTを4mLの新鮮な固定溶液と1時間ロックに交換してください。便宜上4°Cで長くインキュベートすることが可能です。

7. 5日目:漂白

  1. 固定溶液を4 mLのPBSTと、室温で10分間ロックに交換してください。
  2. PBSTを4mLの新鮮なPBSTと10分間の岩に交換してください。もう一度繰り返します。
  3. 幼虫を6ウェルプレート(井戸あたり最大10回)に移します。
  4. PBSTを3mLの新鮮な漂白液に交換してください。
  5. 室温で揺れ、5分ごとに解剖顕微鏡で色素沈着を監視します。メサネフロスに沿って色素沈着の消失を探します (泳ぐ膀胱と腸に対する後ろ体).
    注:幼虫の長さは6mmまで、メゾネフロスを取り巻く色素沈着を漂白するのに最大20分かかります。幼虫の完全性を保つために必要以上に長く漂白しないでください。
  6. 幼虫をガラスバイアルに戻します。
  7. 漂白液を4 mLのPBSTに交換してください。10分間のロック。
  8. PBSTを4mLの新鮮なPBSTと10分間の岩に交換してください。もう一度繰り返します。
  9. PBSTを4mLの新鮮な固定溶液と1時間ロックに交換してください。便宜上4°Cで長くインキュベートすることが可能です。

8. 5日目:プレハイブリダイゼーション

メモ:70°Cで行うステップでは、バイアルの冷却を最小限に抑えるために迅速に作業することが重要です。

  1. 固定溶液を4 mLのPBSTと、室温で10分間ロックに交換してください。
  2. PBSTを4mLの新鮮なPBSTと10分間の岩に交換してください。もう一度繰り返します。
  3. PBSTをHyb-溶液の4 mLに交換し、室温で10分間揺れします。
    注意:Hyb-、Hyb+およびプローブの各溶液には、皮膚を刺激する可能性のあるホルムアミドが含まれています。これらのソリューションを処理するために手袋を使用してください。
  4. Hyb-を4 mLの新鮮なヒブと岩に10分間交換してください。もう一度繰り返します。
    1. 使用されたHyb-、Hyb+、プローブソリューションを別の廃棄物容器に回収し、適切な廃棄を行います。
  5. Hyb-をHyb+溶液の4 mLに交換してください。
  6. バイアルを一晩70°Cでインキュベートする。
  7. EGFP-フルオレセインプローブをHyb+の500 μLで1:100希釈し、70°CでO/Nをインキュベートします。
    注: プローブ合成の製造元の指示に従ってください。

9. 6日目:プローブハイブリダイゼーション

  1. バイアル内のHyb+溶液を予熱プローブに交換し、一晩で70°Cでインキュベートします。
    注意:6ミリメートルより長い幼虫は、インキュベーションの2日間を必要とします。
  2. 洗浄バッファー、2x SSCT、および 0.2x SSCT 溶液を 70 °C で一晩予熱します。

10. 7日目:プローブ洗浄

  1. プローブを4mLの予熱洗浄バッファーに交換し、70°Cで30分間インキュベートします。
    1. 使用済みプローブを別の廃棄物容器に回収し、適切な廃棄を行います。
  2. 洗浄バッファーを 4 mL の新鮮な洗浄バッファーに交換し、70 °C で 30 分間インキュベートします。
  3. 洗浄バッファーを予熱した2x SSCT溶液の4 mLに交換し、70°Cで15分間インキュベートします。
  4. 50 mL チューブに予熱0.2x SSCTの50 mLを加えます。
    1. チューブの上部にセルストレーナー(100 μm)を挿入します。細胞のストレーナーが停止するまでずっと押し下ろされていることを確認します。
    2. ガラスバイアルから幼虫を細胞ストレーナーに移します。幼虫が緩衝液に沈み、70°Cで2時間インキュベートするようにしてください。
  5. 50 mLの予熱0.2x SSCTを含む新しいチューブを準備します。
    1. ステップ10.4.2から0.2x SSCTの新しいチューブに細胞ストレーナーを移し、70°Cで2時間インキュベートします。
    2. ステップ 10.5 をもう一度繰り返します。

11. 7日目:ブロッキング

  1. 幼虫を新しいガラスバイアルに移し、室温まで冷やします。
  2. 0.2x SSCTを67%0.2x SSCT/33%MABTの4 mLに交換し、10分間室温で岩石を取り替えます。
  3. ステップ11.2の溶液を33%0.2x SSCT/67%MABTの4 mLに交換し、10分間ロックします。
  4. ステップ11.3の溶液を4mLのMABTと10分間の岩石に交換してください。
  5. MABTを4mLの新鮮なMABTと10分間の岩に置き換えます。もう一度繰り返します。
  6. MABTを4mLのブロッキング溶液に交換し、一晩4°Cでインキュベートします。利便性のために、より長くインキュベートすることが可能です。

12. 8日目~9日目:抗体インキュベーション

  1. 抗フルオロセイン抗体を500μLブロッキング溶液で1:5,000希釈します。
  2. ブロッキング溶液を抗体溶液に交換し、4°Cで2日間インキュベートします。利便性のために、より長くインキュベートすることが可能です。
    1. 幼虫を攪拌するために1日2回バイアルを渦巻く。
      注:6ミリメートルより長い幼虫は、インキュベーションの1〜2日を必要とします。

13. 10日目~11日目:抗体洗浄

  1. 抗体溶液を4 mLのPBSTに交換し、10分間室温で岩石を取り替えます。
  2. PBSTを4mLの新鮮なPBSTと10分間の岩に交換してください。もう一度繰り返します。
  3. 幼虫を50mLチューブに移します。
  4. PBST2の40 mLを加えます。チューブを横に置き、一晩で4°Cで揺れます。
  5. PBST2を新鮮なPBST2の40 mLに交換し、一晩で4°Cでロックします。利便性のために、より長くインキュベートすることが可能です。
    注:6ミリメートルより長い幼虫は、洗濯の1〜2日を必要とします。

14. 12日目:染色

  1. 幼虫を6ウェルプレートに移します。
  2. PBST2を室温で3mLの染色バッファーと岩に5分間交換します。
  3. 染色バッファーを3 mLのフレッシュ染色バッファーと岩の5分間交換します。もう一度繰り返します。
  4. 染色液を3mLに交換してください。アルミホイルで覆い、次の数時間にわたって染色を監視します。
    1. 弱いシグナルを持つプローブの場合は、一晩4°Cでインキュベートし、染色液を新しい染色液と交換します。
  5. 所望の染色強度に達したら、3mLの停止溶液と30分間の岩石で染色液を交換してください。
  6. 停止液を3mLの新鮮な停止溶液に交換し、30分間ロックします。もう一度繰り返します。
  7. 幼虫を新しいガラスバイアルに移し、停止溶液を4 mLの新鮮な固定溶液に交換し、室温で1時間インキュベートします。便宜上4°Cで長くインキュベートすることが可能です。
  8. 幼虫を4°Cの暗闇の中で固定液に1年保存します。

15. 12日目:イメージング

  1. 固定溶液を4 mLのPBSTと、室温で10分間ロックに交換してください。
  2. 幼虫を6ウェルプレートに移します。
  3. PBSTを4mLの新鮮なPBSTと10分間の岩に交換してください。もう一度繰り返します。
  4. PBSTを50%グリセロール(PBST)の3 mLに置き換え、10分間ロックします。
  5. ステップ15.4の溶液を100%のグリセロールの3 mLに交換し、10分間揺らげない。
  6. 解剖顕微鏡を使用して、6ウェルプレートで直接幼虫を画像化するか、幼虫をうつ病スライドに移して複合顕微鏡で画像化します。まつげマニピュレータを使用して、幼虫の向きを変えます。

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結果

Tg(lhx1a-EGFP)トランスジェニックラインを用いて、このインサイチュハイブリダイゼーションプロトコルは、メサネフォロスの発生時に腎臓前駆細胞および種々のニーフロン構造を標識するのに有効であることを実証した。予想通り、中枢神経系もこのトランスジェニックライン(図示せず)で標識される。最初のメゾネフリック腎膜は約5.2mmで形成され、その後ろは、起こりやすい(図2A)、およびこの腎管の遠位管はEGFP10,12によって標識される。前駆星クラスタは、この段階以降(図2A-B、矢印の頭)に存在し、単一の前駆細胞も標識されています(図2C)。この方法は、腎臓の発達を研究する追加のツールを提供し、人間の腎臓を理解する光を当てるのに役立ちます。<...

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ディスカッション

ここで説明する in situ ハイブリダイゼーション法は、メソネフォロスの開発を研究することを目的としています。しかし、腸、神経系、スケール、色素沈着などの変態中の他の組織や臓器の発達を研究するために適用することができます。プローブは、トランスジェニックラインの内因性遺伝子または蛍光マーカーに対して生成され得る。

幼虫は、本来の文脈で臓器や組織を観察するためにそのまま残ることは重要です。組織の完全性を保つためには、プロテアーゼK治療の時間を最小限に抑えることが重要です。酵素の新しいバッチごとに最良の処理時間を決定することが重要です。あるいは、アセトンは、組織完全性を改善するためにプロテナーゼKの代わりに使用することができる16。過度の漂白はまた、組織の完全性を低下させます。最小限の漂白と目がいくつかの色素沈着を保持できるようにすることは、手術中に幼虫を視覚化するのに役立ちます。組織の脆弱性の指標であるハイブリダイゼーションステップ中に目が落ちることは一般的です。DMS...

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開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

資金は、ペンシルベニア科学アカデミー、ペンシルベニア州生物学者の連邦、ペンシルベニア大学(大学院研究研究部、生物学部、シンシア・サシャク学部優秀生物学基金)によって提供されました。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインは、ニール・フクリード博士(ピッツバーグ大学)によって提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗フルオレセイン抗体ロシュ/シグマ-アルドリッチ11426338910
漂白液0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
ブロッキング試薬ロシュ/シグマ-アルドリッチ11096176001ブロッキング溶液に使用し、製造の指示に従って調製します
セルストレーナーフィッシャーサイエンティフィ 22-363-549100 &MU;m
E3 中5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% メチレンブルー
まつげマニピュレーターフィッシャーサイエンティフィックNC1083208幼虫の操作に使用
固定液4% パラホルムアルデヒド, 1% DMSO in PBS; 65°C;C粉末が溶解するまで振とうし、冷やした後にDMSOを添加
フルオレセインプローブ合成ロシュ/シグマ-アルドリッチ11685619910ガラス
バイアルッシャーサイエンティフィック03-338B
ハッチフライカプセル化アージェント
Hyb-溶液50%ホルムアミド、5X SSC、0.1% Tween-20
Hyb+溶液HYB-、5 mg/mL トルラ RNA、50 ug/mL ヘパリン
MAB (10X)1 M マレイン酸、1.5 M NaCl、pH 7.5
MABT1X MAB、0.1% Tween-20
マレイン酸Sigma-AldrichM0375
パラホルムアルデヒドSigma Aldrich158127
PBS (10X)8% NaCl、0.2% KCl、1.44% Na2HPO4、0.24% KH2PO4
PBST1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST21X PBS, 0.2% Tween-20
粉末食品スピルリナとハッチフライのカプセル化をそれぞれ2gずつ50mLの魚類システムに混ぜ、よく振る
プロテイナーゼKSigma-AldrichP5568幼虫の透過処理に使用
プロテイナーゼK溶液20 μg/mL、PBST
スピルリナ微粉末Argent
SSC (20X)3 M NaCl、0.3 M 無水酢酸ナトリウム、pH 7、オートクレーブ
SSCT (0.2X)20X SSC から希釈、0.1% Tween-20
SSCT (2X)20X SSC、0.1% Tween-20
染色バッファーから希釈100 mM Tris pH 9.5、50 mM MgCl2、100 mM NaCl、0.1% Tween-20
染色液200 μg/mL ヨードニトロテトラゾリウム塩化物、200 μg/mL 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸二ナトリウム塩、染色緩衝液
中 停止溶液1 mM EDTA、pH 5.5、PBST
トルラ(酵母)RNASigma-AldrichR6625
TricaineSigma AldrichE105212%、pH 7
洗浄緩衝液50% ホルムアミド、2X SSC、0.1% Tween-20
ック フィ

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