方法論記事

多機能システムを用いたヒトがんおよび正常細胞における有形関連タンパク質の全光学機構調査

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DOI：

10.3791/62934

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2021年12月20日

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1Department of Electrical and Computer Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, 4Department of Radiation Oncology, College of Medicine, University of Florida, 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida

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この記事について

サマリー

本稿では、自動マルチチャンネルイメージングとメカノバイオロジカル解析を可能にし、Yes関連タンパク質(YAP)のメカノ感度を解明する統合多機能・ユーザープログラマブルシステムの活用方法に関する詳細な段階的プロトコルを提示する。

要約

生細胞の長期的な多機能イメージングおよび解析には、さまざまなハードウェアおよびソフトウェアプラットフォームの合理化された機能調整が必要です。しかし、異なるメーカーによって製造されたさまざまな機器を手動で制御することは、労働集約的で時間がかかり、取得したデータの精度、再現性、品質を低下させる可能性があります。したがって、自動、多機能、および長期の画像取得を可能にし、ほとんどの蛍光顕微鏡プラットフォームと互換性のあるオールインワンでユーザープログラマブルなシステムは、科学界に利益をもたらすことができます。本稿では、(1)マルチチャンネルイメージングの自動取得を可能にする「AMFIP(自動多機能統合プログラム)」と題した自家製ソフトウェアプログラムと、(2)定量イメージング解析と細胞牽引計算パッケージ群からなる、新しい統合ソフトウェアシステムを利用するための完全な動作プロトコルを紹介する。

この統合システムを適用して、CRISPR/Cas9で操作されたヒト正常細胞(B2B)および肺癌細胞(PC9)における、メカノ感受性Yes関連タンパク質(YAP)の空間時間分布と細胞拡散および牽引を含む細胞力学との間のこれまで知られていなかった関係を明らかにする。このシステムのマルチチャンネル制御と読み出しの機能を活用すると、結果は、(1)B2B正常細胞とPC9がん細胞は、細胞の拡散および遊走プロセス中のYAP発現、牽引、および細胞ダイナミクスの間に明確な関係を示す。(2)PC9癌細胞は、基質上に顕著な核周囲力を加える。要約すると、本稿では、YAPメカノ感度を解明するために、自動多機能イメージングおよび解析を可能にする統合ユーザプログラマブルシステムを利用する方法について、詳細な段階的プロトコルを提示する。これらのツールは、細胞生理学および病理学の文脈における多面的なシグナル伝達ダイナミクスの詳細な探査の可能性を開く。

概要

この方法の全体的な目標は、生細胞の全光学多機能イメージングおよび解析を可能にすることです。多機能光電子デバイスの自動調整を可能にするオールインワンイメージングプログラムは、労働集約的でエラーが発生しやすい手動操作を削減し、研究者が長期間の生細胞イメージングを行うために不可欠です1,2,3,4。しかし、生物医学研究コミュニティにおける既存の公共プログラムのほとんどは、限られた光電子デバイスにのみ適用されるか、異なる機器の調整のために追加のハードウェアを必要とする5,6,7,8,9。最近では、「自動多機能統合プログラム(AMFIP)」と題したオープンソースのソフトウェアベースのプログラムが開発され、マルチチャンネルおよびタイムラプスイメージングが可能になりました。AMFIPは、Java言語とμManager11,12のアプリケーションプログラミングインタフェース(API)に基づいて、カスタマイズされたJavaスクリプトを実行して、ニコンのものを含むがこれに限定されない複数の光電子ハードウェアおよびソフトウェアプラットフォームのソフトウェアベースの通信を実現するμManagerのプラグインとして開発されました。AMFIPの確立は、細胞挙動のプログラム可能で多機能な尋問の可能性を開きます。本稿では、AMFIPとデジタルイメージング解析および細胞牽引力顕微鏡を組み合わせた、統合された実験および計算システムを開発する。このシステムは、CRISPR/Cas9で操作されたヒト正常B2B(図1)および肺癌PC9(図2)細胞株における明確なYAP機構学の解明を可能にする。このシステムは、科学界に、すべてのイメージングシステムで利用できない、および/または互換性がない可能性のある追加の制御装置を購入する需要を回避する包括的なソリューションを提供します。

本稿で紹介するプロトコルでは、(1)AMFIPを適用して、mNEonGreen2タグ付きYAPを発現するCRISPR/Cas9遺伝子組み換え細胞株の両方に対して自動長期イメージングを行う方法を紹介します。(2)フィジーImageJ、MATLAB、およびOriginを組み合わせて、蛍光強度(図3および図4)、細胞変位場(図1Cおよび図2C)、および細胞牽引場(図1Dおよび 図2D)に基づくYAP核/細胞質(N / C)比の定量分析を行う。).この結果は、(1)生理学的に関連する機械的剛性を有する基板上で細胞が広がる最初の10時間の間に13,14,15,16,17,18、単一のB2B細胞のYAP N/C比が、単一のPC9細胞のそれと比較してより顕著な時間依存的な変動および変動を示すことを示唆している(図5および図6);(2)PC9がん細胞は、その核周囲領域において顕著な牽引力を生成する(図7)。このプロトコルに記載されている統合システムと方法論は、特定のタイプの細胞および光遺伝学的分子を超越しています。研究者は、このプロトコルを適用して、特定の生細胞尋問実験をカスタマイズし、細胞生理学および病理学の文脈における多面的なシグナル伝達ダイナミクスを解明することができる。

プロトコル

1. mNeonGreen21-10/11タグ付きYAPタンパク質を内因的に発現する安定なCRISPR/Cas9編集ヒト肺癌細胞株(PC9)およびヒト気管支上皮細胞株(Beas2B)の作製

  1. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、蛍光タンパク質mNeonGreen2の第11 鎖をコードするDNA配列を、高忠実度DNAポリメラーゼを用いて増幅する( 材料表参照)。
  2. 増幅したDNA配列をCRISPR-Cas9遺伝子編集系を用いてPC9およびB2B細胞株のYAPゲノム遺伝子座にノックインする。
    注:このDNA配列は、mNeonGreen2の鎖1〜10本を補い、蛍光を発する。YAP-mNeonGreen21-10/11 のゲノム配列マップ を補足図S1に示す。マップには、ラベル付けされたゲノム配列、ドナー配列、および mNeonGreen2 配列が含まれています。
  3. CRISPR/Cas9 で操作された mNeonGreen2 発現を落射蛍光顕微鏡で確認します ( 材料表を参照)。mNeonGreen2は、細胞が天然の遺伝子調節ネットワークのコンテキストでYAPを発現するたびにYAPにタグ付けされるため、CRISPR/Cas9で操作された両方の細胞における蛍光強度の存在を確認し、それを親細胞(対照)の蛍光強度と比較する。
    メモ:このプロトコルに従うには、(1)励起に488nmレーザー(47.5mW/mm2)、(2)蛍光測定に40倍対物レンズ(開口数(NA)= 0.95)とバンドパス発光フィルタ(ET525/50nm)、および(3)蛍光強度を測定、定量化、および比較するImageJソフトウェアを使用してください。
  4. CRISPR/Cas9編集細胞株からゲノムDNAを抽出することにより、mNeonGreen211の正しい組み込みを確認する。ゲノム挿入物に隣接するプライマーを用いてPCRを行い、配列決定を行い、正しいゲノムlocci19,20での挿入を確認した。
  5. CRISPR/Cas9遺伝子編集システムを使用してmNeonGreen211をノックダウンし、ステップ1.3で説明したのと同じ顕微鏡システムとイメージングパラメータを使用して、細胞の蛍光強度の減少を確認します。
    注:このステップは、蛍光強度の比較によってmNeonGreen211の正しい積分を確認する。 ノックダウンおよび親細胞のないCRISPR/Cas9で操作された細胞がコントロールとして使用されます。
  6. 蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)ソーティングにより、目的のタグ付きタンパク質を含む細胞を収集します。
    1. FACSソーティングのために細胞を調製するために、それらをトリプシン処理し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁する。
    2. 親細胞株のバックグラウンドレベルを超えるmNeonGreen2蛍光を有する細胞を、FACSソーティングの2回の濃縮ラウンドで収集する。
      注:ここで説明するCRISPR/Cas9編集細胞株を生成するためのタイムラインは、1〜2ヶ月程度です。すべての細胞株は、他の研究所が結果を再現できるように、要求に応じて一般に公開されています。

2. PC9およびB2B細胞のメンテナンス

  1. 両方の細胞株を37°Cで5%CO2 の加湿組織培養インキュベーターに維持する。
  2. 10%ウシ胎児血清および100μg/mLペニシリン-ストレプトマイシンを添加した12mLのRPMI-1640培地を用いた75cm2フラスコ中の106個の内因的にタグ付けされたPC9およびBeas2B細胞を培養した。細胞コンフルエントが〜80%に達すると両方の細胞株を継代培養する。
  3. マイコプラズマ検出キットを使用して、3ヶ月ごとに両方の細胞株のマイコプラズマをテストし、すべてのメーカーの推奨プロトコルに厳密に従ってください。
  4. 細胞株を-80°Cの冷凍庫に保存する。
  5. 融解から<20継代である細胞株をすべての実験に使用した。

3. ハードウェア・ソフトウェア環境のセットアップ

  1. 実験のハードウェア環境のセットアップ
    1. 共焦点コントローラと倒立顕微鏡をコンピュータに接続します( 材料表を参照)。
    2. ソフトウェアプラットフォーム(材料表)をインストールします。
    3. 共焦点コントローラーと倒立顕微鏡の電源を入れます。次に、 要素を起動します。
    4. 「要素」でコンフォカル、レーザー、倒立顕微鏡のコントロールパネルを開きます。次に、電動ステージの動き、顕微鏡対物レンズの切り替え、レーザーラインの空間スキャンをテストして、3つのパネルが正しく機能しているかどうかを確認します。
  2. AMFIP のソフトウェア環境のセットアップ
    1. IntelliJ、Java Development Kit 14.0、μManager バージョン 2.0 ガンマ、および Fiji ImageJ をコンピューターにインストールします。
    2. GitHub からダウンロードした AMFIP プロジェクト (リンク: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) を IntelliJ で開きます。
    3. [設定]|をクリックします。コンパイラ|「アノテーション・プロセッサー」および「アノテーション処理を使用可能にする」にチェック・マークを付けます。
    4. [プロジェクト構造]|をクリックします。成果物を作成し、JAR ファイルを作成します。出力ディレクトリをμManagerディレクトリの下のmmpluginsに設定します。
    5. [プロジェクト構造]|をクリックします。ライブラリを作成し、μManagerディレクトリの下にmmpluginとプラグインを追加します。
    6. 「実行」ドロップダウンメニューの下にある「構成の追加」をクリックし、アプリケーションを作成します。
    7. ij と入力します。ImageJ をメインクラスに。
    8. VM オプションに「-Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true 」と入力します。
    9. μManagerディレクトリを作業ディレクトリに設定します。
    10. [ 実行 ]をクリックして、AMFIPプラグインでμManagerをアクティブ化します。
  3. μManagerを倒立顕微鏡に接続します。
    1. 倒立顕微鏡21 の適応ドライバを μManager ディレクトリに追加します。
    2. μManagerを開きます。[デバイス]|をクリックします。ハードウェア構成ウィザードを作成し、新しい構成を作成します。
    3. 「使用可能なデバイス」の下に Ti2 ドライバーを追加します。
    4. すべての周辺機器を選択し、新しい構成ファイルを保存します。
    5. μManagerを再起動し、 Micro-Managerスタートアップ設定のステップ3.2.4で設定ファイルを選択します。

4. ゲル調製

  1. ガラスカバースリップを3-アミノプロピルトリメトキシシランで室温(24°C)で7分間処理する。
  2. 脱イオン(DI)水を使用してガラスカバースリップをすすぎ、カバースリップを160°Cで20分間乾燥させます。
  3. ガラスカバースリップを0.5%グルタルアルデヒドで30分間処理し、DI水ですすいでください。
  4. アクリルアミド溶液、N,N'-メチレンビスアクリルアミド(ビス)溶液、および10mM HEPS緩衝生理食塩水に懸濁した蛍光ビーズを混合する。重合開始剤として10%(w / v)過硫酸アンモニウム溶液およびN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を使用する。ポリアクリルアミド(PAA)ヒドロゲルの所望の機械的剛性を達成するために、各成分の割合を、前述の確立されたプロトコルに従って変更する13,14。
    注:このプロトコルでは、2kPaゲル:アクリルアミド= 12.5%およびビスアクリルアミド= 6.5%;5kPaゲル:アクリルアミド= 12.5%およびビスアクリルアミド= 21.5%;40kPaゲル:アクリルアミド=12.5%およびビスアクリルアミド=31.5%。リストされているすべての%はボリューム・パーセンテージです。
  5. 35分後、固化したPAAヒドロゲルからガラスカバースリップを剥がし、ヒドロゲルを50mM HEPS緩衝生理食塩水で2回(毎回5分間)洗浄した。
  6. ヒドロゲル表面をヒドラジン - 水和物溶液で6時間処理する。
  7. ヒドロゲルを酢酸で30分間すすいだ。酢酸を除去し、PBSで30分間リンスする。
  8. フィブロネクチン溶液(PBS中50μg/mL)を過ヨウ素酸ナトリウムで30分間酸化する。
  9. ヒドロゲル表面を酸化フィブロネクチン溶液で被覆し、35分間待つ。
  10. PBSを加えてヒドロゲルを浸漬し、4°Cで保存した。 ハイドロゲルを含むすべてのペトリ皿をアルミホイルで覆い、ハイドロゲルへの光暴露を避けてください。

5. 細胞培養

注:無菌技術を用いて細胞培養を行う。

  1. ガラスカバースリップとPAAハイドロゲルを35 mmのガラス底シャーレに接着して、細胞播種およびイメージングプロセス中のゲルの物理的なドリフトを回避します。
    1. 滅菌された清潔なピンセットを使用して、調製したゲルを含むペトリ皿からカバースリップ(PAAヒドロゲルを上にして)を持ち上げます。
    2. ドライワイプを使用して、ガラスカバースリップの底面の水滴をきれいにします。
    3. 滅菌ピンセットを使用して、ガラスカバースリップを保持します。
    4. シアノアクリレート接着剤の小さな液滴(1〜5μL)を底面の2つの対角線の角に置きます。
    5. 滅菌済みのワイプを使用して、余分な接着剤を取り除きます。
    6. 滅菌ピンセットを使用して、ガラス底のペトリ皿のカバースリップを交換します。カバースリップの角をわずかに押して、接着剤の液滴がペトリ皿の表面と完全に接触するようにします。
    7. 蓋をペトリ皿に戻して、PAAヒドロゲル中のPBSの蒸発を最小限に抑えます。接着剤が固化してペトリ皿の中で乾燥するまで3分間待ちます。
    8. ペトリ皿に4mLのPBSを入れます。
    9. イメージングに使用したペトリ皿の残りのPAAヒドロゲルサンプルについて、上記のステップ5.1.1〜5.1.8を繰り返します。
    10. 75%エタノールを使用して、すべてのペトリ皿の外表面を滅菌し、組織培養バイオセーフティキャビネットに移します。紫外線を5分間オンにし、サンプルを滅菌します。
  2. 細胞をゲルの上面に播種する。
    1. 紫外線を消灯します。フラスコ(B2B/PC9細胞を含む)を37°Cのインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに取り出す。真空ポンプに接続されたピペットを使用してすべての培養液を吸引し、5mLのPBSを加えてフラスコを洗浄する。
    2. 2 mLの0.05%トリプシンを加えて、細胞をフラスコの底から剥離した。
    3. フラスコをインキュベーターに入れます。5分間待ちます。
    4. フラスコをバイオセーフティキャビネットに移す。8 mL の新鮮な培養培地をフラスコに加え、ピペットを数回上下させて細胞を均一に懸濁します。
    5. 細胞懸濁液の10 mLの全てを15 mLチューブに移し、300 × g で5分間遠心分離した。
    6. チューブの底にあるセルペレットを確認してください。チューブをゆっくりと水平に傾け、吸引ピペットを使用して、細胞ペレットに触れることなくチューブからすべての培養培地を除去します。次に、8 mLの新鮮な培養培地とピペットを数回上下に添加し、すべての細胞が培地と均質に混合されるまで加えます。
    7. 100 μLの細胞懸濁液(150 cells/μL)をゲル表面に沈着させ、5分間待つ。次に、4mLの新鮮な培養培地をペトリ皿にゆっくりと加える。新鮮な培地をゲルに直接加えないでください。
    8. シャーレを37°Cのインキュベーターに入れる。細胞がゲル表面に付着するのを待つ(B2B:0.5-1時間;PC9:4-5時間)。

6. 細胞イメージング

注:AMFIPは、異なるハードウェアおよびソフトウェアシステムと調整することにより、自動、マルチチャネル、および長期イメージングを可能にします:(1)AMFIPはμManagerを操作して、Ti2-E顕微鏡の電動ステージを複数の視野(FOV)に自動的に移動させ、モノクロカメラ(材料表)を介して明視野画像を取得します。(2)AMFIPは、カスタマイズされたJavaスクリプトを使用して Elements 内の複数のマクロファイルをアクティブにし、共焦点zスタックイメージングの自動操作と異なるレーザーチャンネル(405nmと488nm)の切り替えを実現します。

  1. 長期イメージングの環境を設定します。
    1. 環境チャンバーを倒立顕微鏡の電動ステージに置きます。CO2流量を160mL/minに設定し、チャンバーの温度を調整します(上部:44°C、浴:42°C、ステージ:40°C)。次に、40mLの精製水をチャンバーの浴中に加える。
    2. インキュベーターから細胞を入れたガラス底のペトリ皿を取り出し、それを環境チャンバーに入れます。
    3. 共焦点コントローラーと倒立顕微鏡の電源を入れます。光路を右に切り替え、μManagerで細胞が付着しているのを観察します。十分な細胞がゲルに付着している場合は、ペトリ皿をインキュベーターに戻します。ゲルに付着した細胞が十分でない場合は、B2Bについてはさらに30分間、PC9細胞については60分間、細胞インキュベーションを継続する。
    4. 粘着テープの2つの小さな部分を切断し、円形の穴の周りのチャンバーに貼り付けます。次に、テープに少し接着剤を塗ります(ペトリ皿が覆う部分のみ)。
    5. インキュベーターからペトリ皿を取り出す。次に、ペトリ皿をゆっくりとチャンバーに入れ、皿の底を接着剤と接触させます。
    6. ペトリ皿の蓋を1分間押して、接着剤がペトリ皿と完全に接触して固まるようにします。次に、ペトリ皿を水平に静かに押して、ペトリ皿がチャンバー内で動かないことを確認します。
    7. チャンバーの蓋を閉じます。
  2. 明視野イメージング用の画像取得パラメータを設定します。
    1. IntelliJを開き、ファイルElements_script.javaの93行目にパラメータT1(120秒など)を設定します。この値が、「1 つの視野 (FOV) の共焦点イメージングに使用される要素」のマクロの実行時間より大きいことを確認します。[実行] ボタンをクリックして、AMFIP IntelliJ プロジェクトを開始します。
    2. μManagerのメインインタフェースにあるライブおよびマルチDのAcq.ボタンをクリックします。次に、倒立顕微鏡の光路を明視野イメージング用に右に切り替え、10倍の対物レンズに切り替えて、発光ダイオード(LED)ライト(明視野イメージング用の光源、強度:5%)を開きます。
      1. 要素Ti2パネルの光路、顕微鏡対物レンズ、およびLEDランプボタンをクリックするか、顕微鏡の対応するボタンを手動で押します。
    3. XYジョイスティックとZ平面のノブを調整して、ペトリ皿上のゲルの正しい位置と焦点の合った面を見つけます。10倍の対物レンズを使用して、ゲルに結合した複数の単一細胞の適切なFOVを見つけます。
    4. 「多次元集録」ウィンドウの「複数位置(XY)」ボックスにチェック・マークを付けます。「位置リストを編集...」ボタンをクリックし、ポップアップ表示される「ステージ位置リスト」ウィンドウを確認します。次に、目標を40倍に変更し、LEDライトの強度を15%に増やし、XY電動ステージを再調整してFOVを見つけ、ステージ位置リストウィンドウのマークボタンをクリックして座標を記録します。
    5. 67 個の必要な FOV を記録します。「ステージ位置リスト」ウィンドウの「別名で保存...」ボタンをクリックして、座標を記録します。T1(ステップ6.2.1で定義されたパラメータ、例えば、120秒)を、多次元取得ウィンドウの[時間点]セクションのT1に画像取得の時間間隔に入力する。
  3. 2D-YAP画像とビーズ画像の画像取得を設定します。
    1. [エレメント]を開き、共焦点イメージング用のライトパスを右に変更し、LEDライトをオフにします。次に、[インターロックの削除]ボタンをクリックし、[FITC]ボックスをオンにしてFITCレーザーチャンネル(YAPイメージング用)をオンにします。
    2. 1/2ボタンをクリックしてスキャン速度を2秒あたり 1 フレームに調整し、Z平面のつまみを回転させて、接続されているセルのZ位置をすばやく見つけます。Z スタックの下限と上限を記録します。
    3. 上部のリボンの [ マクロ ] をクリックし、[マクロ] ドロップダウン メニューの [マクロ エディター ] を選択して、手順 6.3.2 の値を マクロ ファイルに入力します。
    4. DAPIボックスをチェックして、ビーズの集束Z位置を見つけて記録することにより、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール( DAPI )レーザーチャンネル(ビーズイメージング用)をオンにします。マクロエディタに移動し、記録された値を マクロ ファイルに入力します。
  4. AMFIPを使用して電動ステージを移動するタスクを設定します。
    1. μManagerに移動し、[プラグイン]|をクリックします。 AMFIP のグラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) を開くための自動化。[ポイントの追加]ボタンまたは[ポイントの削除]ボタンをクリックして、選択したFOVの正確な数を取得します。記録したFOVの座標を座標パネルに入力します。
    2. [合計実験時間] テキスト フィールドで 合計実験時間 を定義します。
    3. [追加時間 設定 ]ボタンをクリックし、電動ステージを各FOVに移動する時間間隔 T2 (30分など)を定義します。
    4. 要素のウィンドウサイズを最大化し、AMFIPのGUIを画面の右側にドラッグして、GUIがカーソルの自動操作を妨げないようにします。
    5. [入力]ボタンをクリックします。最初のマクロが終了したら、「多次元集録」ウィンドウの「集録!」ボタンをクリックします。
  5. 画像取得後に細胞を溶解する。
    1. 長期イメージングが完了したら、オートメーションプラグインウィンドウの一時停止ボタンと多次元取得ウィンドウの停止ボタンをクリックして、AMFIPタスクを停止します。
    2. 「エレメント」を開き、「ND 集録」ウィンドウの「上」ボタンと「下」ボタンをクリックして Z スタックイメージングを設定します(Z 範囲をビーズの Z 範囲よりも大きく設定します)。ライトパスを右に切り替えてLEDライトを開きます(強度:15%)。
    3. チャンバーとペトリ皿の蓋をゆっくりと慎重に取り外します。その間、視野図を監視してFOVのドリフトがないか確認します。
    4. プラスチックピペットを使用してドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液0.5mLをとり、プラスチックピペットをシャーレ内の培養培地の少し上に慎重に保持し、SDS溶液の1〜2滴を培養培地に加える。
    5. 明視野図のセルが溶解したら、ライトパスを左に切り替え、LEDライトを閉じて、[ インターロックの削除 ]ボタンをクリックします。
    6. Z スタックイメージングを実行します。イメージ スタックを保存し、Reference_N という名前を付け ます (N は各 FOV のシーケンス番号です)。
    7. 「多次元集録」ウィンドウの「複数位置(XY)」ボタンをクリックします。次に、次のFOVを選択し、[移動先]ボタンをクリックして、電動ステージを2番目のFOVに移動します。
    8. 各 FOV について手順 6.5.7 を繰り返します。

7. YAPのN/C比の測定

  1. 画像解析を実行し、フィジーImageJソフトウェアを使用してYAP N / C比を測定します(図4)。
    1. フィジーイメージJを開きます。μManagerによって集録されたすべてのFOVの明視野画像スタックをインポートします。
    2. [画像] ドロップダウン メニューを開き、[スタック] |ツールの|スライスキーパー。次に、FOVごとに明視野画像スタックをエクスポートします。
    3. FITCチャンネルの蛍光画像をインポートし、同じFOVの明視野画像とオーバーレイします。これを行うには、蛍光画像を選択し、[ オーバーレイ] を選択|画像を追加... (追加する画像:明視野画像;XおよびY位置は、異なるカメラによって取得された明視野画像のサイズに依存する。不透明度:60-70)。
    4. [解析]ドロップダウンメニューを開き、[測定値の設定]を選択します。[領域]を選択します。積分密度と平均グレー値。
    5. ImageJのメインインターフェイスにある フリーハンド選択 ボタンをクリックします。
    6. 細胞体の輪郭と目的の核を描きます。次に、[|の分析]をクリックします。キーボードのMボタンを測定または押します。
    7. ポップアップする [結果 ]ウィンドウを確認します。 [面積] 列の下の値は選択した領域の領域(μm2)を表し、 IntDen 列の下の値は選択した領域の蛍光強度を表すことに注意してください。
    8. YAP N/C 比は、次の式 (1)、(2)、および (3) を使用して計算します。
      figure-protocol-1 (1)
      figure-protocol-2 (2)
      figure-protocol-3 (3)
      ここで、Inuc と Icel は核と細胞体の相対強度を表し、Anuc と Acel は核と細胞体の面積を表します。R は YAP N/C 比です。
    9. ダイポール牽引力とペリセル/ペリ核変位の将来の計算のためにアウトラインを保存します。これを行うには、[ |の分析] をクリックします。ツールの|XY 座標を保存...

8. トラクションフィールドの測定

  1. フィジーImageJプラグイン22,23を介して牽引力顕微鏡を適用します。
    1. フィジーイメージJを開きます。
    2. FOV のビーズのイメージスタックをインポートします。
    3. ビーズの最も明確な分布を示すスライスを選択し、[画像]をクリックして抽出 |スタック|ツールの|スライスキーパー。
    4. 同じ FOV の参照のイメージ スタックをインポートします。
    5. 手順 8.1.3 のスライスと同じ明るさとコントラストのスライスを選択します。次に、それを参照画像として抽出します。
    6. 画像|の選択スタック|ツールの|連結して、手順 8.1.3 と 8.1.5 の 2 つのスライスを結合します (最初のスライスとして参照イメージを選択します)。
    7. プラグイン|の選択テンプレートマッチング|スライスをスタックまたはプラグインに整列させる |2つのスライスを整列させる手ぶれ補正。
    8. 画像|の選択スタック|画像にスタックします。次に、[画像|]を選択します。ルックアップ テーブル |[緑] をクリックして最初のスライスの色を緑に変換し、[画像] を選択|ルックアップ テーブル |赤: 2 番目のスライスの色を赤に変換します。
    9. 画像|の選択カラー|チャンネルを結合して、2 つの画像を結合します。
    10. 画像を同じFOVの明視野画像と重ね合わせ、この重なり合った画像を使用してビーズの変位を観察します。
    11. プラグイン|の選択PIV |反復的なPIV(ベーシック)....尋問ウィンドウのサイズを 128/256 に設定します。64/128;32/64(尋問ウィンドウあたり少なくとも4つのビーズ)。相関しきい値を 0.6 に設定します。
    12. [OK]をクリックします。計算が終了したら、ビーズ変位の生データを含むテキストファイルを、ユーザーが作成した通常のフォルダに保存します。
    13. プラグイン|の選択FTTC |FTTC を選択し、ステップ 8.1.9 でテキスト・ファイルを選択します。
    14. ピクセルサイズ(μm)、ゲルのヤング率(パスカル)、実験に基づくプロット幅と高さ、ビーズの画像を入力します。
    15. [ OK ]をクリックして、牽引力の生データを含むテキストファイルを、ステップ8.1.12のテキストファイルと同じディレクトリに自動的に保存します。
  2. グラフ化ソフトウェア(材料表)を使用して、複数のセルについて同じスケールで牽引場をプロットします(図1B,Cおよび図2B,C)。
    1. 牽引力の生データを含むテキストファイルをスプレッドシートに挿入します。
    2. 新しいシートを作成し、最初の行に牽引の Y 座標を入力し(高い値から低い値に配置)、最初の列に X 座標を入力します(低い値から高い値に配置)。
    3. 生データから各座標に牽引力の値を入力します。
    4. ステップ 8.2.2 のシートを *.csv ファイルとして保存します。
    5. オリジンを開きます。
    6. [ファイル|]をクリックします。ステップ 8.2.4 で *.csv ファイルを開いてインポートします。すべてのセルを選択し、[プロット]|をクリックします。輪郭|輪郭 - カラー塗りつぶし。
    7. 「プロット: plotvm」ウィンドウで、列全体で「Y」を選択して、Y値を最初の行に、X値を最初の列に自動的に設定します。次に、タイトルに名前を付けて[OK]をクリックします。
    8. ポップアップするグラフウィンドウで、 ヒートマップをダブルクリックします。
    9. 「カラーマップ/等高線」ウィンドウで「レベル」をクリックします。次に、スケールレベルを妥当な範囲(この分析では0300)に変更し、[OK]をクリックします。
    10. [行]をクリックし、[メジャーレベルでのみ表示]のチェックを外し、[すべて非表示]をオンにします。次に、[OK]をクリックします。
    11. グラフを右クリックし、[グラフの エクスポート...] を選択して、 指定したパスに画像を保存します。
  3. MATLAB を使用して、ダイポール セルの牽引力を計算します。
    1. 牽引生データテキストファイル(ステップ8.1.12から)とセル境界関心領域(ROI)座標ファイル(ステップ7.1.9から)をステップ8.1.12で定義した同じフォルダに保存します。AMFIP パッケージ内のすべての MATLAB ファイルをこのフォルダーに転送します。
    2. MATLAB を開きます。ステップ8.1.12で定義したフォルダを開き、ステップ8.3.1でこのフォルダに転送したダイポール牽引関数ファイルabsdipole.mを開きます。
    3. ステップ8.3.1の2つのテキスト/ csvファイルをMATLAB作業スペースに読み込み、2つの変数( 牽引 と roiなど)に行列を割り当てます。
    4. 関数 absdiple (traction,roi) を実行します。
      注: 出力の最初の列は、nN (ナノニュートン) 単位の双極子牽引力です。出力の第2列は、横軸に対するダイポール牽引力の角度である。

結果

細胞拡散中のCRISPR/Cas9遺伝子操作されたPC9がんおよびB2B正常細胞における明確なYAP分布およびダイナミクス
2、5、40kPaのPAAゲルおよびガラスカバースリップ上の単一のB2BおよびPC9細胞におけるYAP分布の代表的な蛍光画像を図1Aおよび図2Aに示す。B2B細胞におけるYAPの核局在は基質剛性の増加とともに増加したが(図1A)、一方、PC9細胞は、剛性が変化する基質上の核および細胞質において同様のYAP濃度を示した(図2A)。5kPaヒドロゲル基質上の単一、拡散B2BおよびPC9細胞(細胞が基質に付着した後0時間目から10時間目まで)におけるYAP分布の代表的な蛍光画像を、それぞれ図1Bおよび図2Bに示す。B2Bセルは、YAP N/C比の低下とともに時間の経過とともに拡散面積を単調に増加させ(図1B)、PC9細胞は10時間の拡散プロセスを通して比較的変化しない細胞拡散面積、配向、およびYAP N/C比を維持しました(図2B)。早期拡散の10時間の間、代表的なB2B細胞は基質表面を恒常的に変形させ、細胞領域全体にわたって時間進化する細胞牽引力を適用した(図1Cおよび図1D)。

対照的に、代表的なPC9セルは、細胞体の両端で変位と牽引力しか発現せず、その牽引力は7.5時間後に減少した(図2Cおよび図2D)。初期の拡散段階でのB2BおよびPC9細胞のより多くのタイムラプス画像および牽引測定は、補足図S2および補足図S3に提供される。PC9細胞ダイナミクスの他の様式も観察された(図6)。これらの異なる拡散特性と並行して、B2BおよびPC9細胞は、明確なYAP分布およびダイナミクスを示した(図3)。5kPaゲル上で、B2B細胞中のYAPは、0時間目に核内で濃縮され、10時間目に細胞体全体にわたってより均質に分布するようになった。しかしながら、PC9細胞は、拡散プロセスの10時間全体にわたって、核および細胞質におけるYAPのより均質な分布を示した。B2B細胞およびPC9細胞におけるYAP活性および転座を定量的に分析するために、図4に記載したアルゴリズムを用いてYAP N/C比を計算した。

明確なYAPダイナミクスをさらに調べるために、YAP N/C比、細胞/核面積、および複数の単一B2B細胞(n = 10)およびPC9細胞(n = 5)の牽引力の時間的変化を比較した(図5)。B2B細胞の平均YAP N/C比は、2.54 ± 0.22から1.79 ± 0.21に低下することがわかった(n = 10; p = 0.0022**; 図5A)、PC9細胞の平均YAP N/C比は1.92から0.26±1.57±0.07に変化した(n = 5;p = 0.187(有意ではない(ns)); 図5A)。B2B細胞の平均双極子牽引力は、256.17 ± 123.69 nNから287.44 ± 99.79 nN(p = 0.7593 (ns)に変化した。 図5B)。PC9セルの平均双極子牽引力は、141.19 ± 33.62 nNから168.52 ± 73.01 nN(p = 0.7137 (ns)に変化した。 図5B)。B2B細胞の平均細胞広がり面積は、613.89 ± 102.43 μm2から 942.51 ± 226.71 μm2 (p = 0.0512 (ns)に増加した。 図5C)。

PC9細胞の平均細胞広がり面積は、495.78 ± 97.04 μm2から 563.95 ± 89.92 μm2 (p = 0.5804 (ns)に変化した。 図5C)。B2B細胞の平均核広がり面積は、181.55 ± 36.18 μm2から 239.38 ± 43.12 μm2 (p = 0.1217 (ns)に増加した。 図5D)PC9細胞の平均核広がり面積は、133.31 ± 30.05 μm2 から151.93 ± 22.49 μm2 (p = 0.5944 (ns)に変化した。 図5D)。これらの結果は、(1)B2B細胞が恒常的に基質剛性依存性YAP N/C比を示すことを示唆している。(2)B2B細胞の牽引力がPC9細胞の牽引力よりも高い。(3)B2B細胞とは対照的に、PC9細胞は、10時間の拡散プロセス中に細胞面積の限られた増加およびYAP N / C比の変化を示す。

YAP分布とダイナミクスのB2B細胞の遊走状態との相関
すべてのB2B(n=10)およびPC9(n=5)細胞のYAP N/C比および双極子牽引力を、細胞拡散面積および核拡散面積の関数として比較した。PC9細胞のYAP N/C比と双極子牽引力は、その小さな細胞および核の広がり面積範囲と明確に相関していませんでした(図6)。対照的に、B2B細胞のYAP N/C比と双極子牽引力は2つの異なる傾向に従っているように見え(図6Aと図6C)、この実験で共存するB2B細胞の2つのグループが存在する可能性が示唆された。第1群では、YAP N/C比と双極子牽引力は、細胞拡散面積の拡大とともに増加し、~1000μm2で最大値に達しました(図6Cおよび図6D、黄色の破線で示されています)。第2群では、YAP N/C比と双極子牽引力は、細胞広がり面積の拡大とともにより遅い速度で増加し、細胞広がり面積が増加し続けるとほぼ一定の値を維持する(図6C、D、緑色の破線で示す)。

PC9がん細胞は核周囲領域にトラクションを発生
単一の、拡散したPC9細胞は、培養の6時間目 から出発して、核周囲領域で基質を置換する(図7C)。細胞牽引によって引き起こされる核周囲変位を可視化するために、我々は基質から細胞を除去する前(赤)と後(緑)に撮影された蛍光ビーズの画像を重ね合わせた(詳細はプロトコルのセクションを参照)。変位のないビーズは、重なり合った画像では黄色、つまり赤と緑の色が追加されます。対照的に、細胞牽引のために静止位置から変位したビーズは、分離された緑色と赤色を示す。

特に、PC9(図7C、D)およびB2B(図7E)細胞の両方で、ビーズの変位が細胞境界のものに加えて、細胞質および核内で観察された。核周囲の変位を強調するために、線形弾性理論のBoussinesq方程式を使用して、セル境界での仮想双極子力によって生成される2D理論上の変位(図7Bの黒い破線)を予測します24。この理論曲線を、同じ軸に沿って測定した実際の基板変位(図7Dの白い破線)と比較すると、核内の実際の変位は理論値(図7B)の1.5〜8倍大きいことが分かり、核周辺領域における牽引力の存在が示された。

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図1:剛性が変化する基質上および早期拡散中のB2B正常細胞のYAP発現/分布、基質変位場、および牽引場の変化。 (A)2、5、および40kPaのPAAゲルおよびガラスカバースリップ上に播種したB2B細胞のYAP発現は、細胞-基質間の初期付着から60時間後である。(B)B2B細胞を5kPaのPAAゲル上に播種し、最初の細胞-基質付着後10時間にわたって画像化した。YAP発現は、緑色蛍光強度で表される。注:核内のYAP強度は徐々に減少しますが、時間の経過とともに細胞質内のYAP強度よりも高いままです。カラーバーは、(A)および(B)におけるYAP式(緑=高式、黒=低式)のレベルを示す。(c)セル位置における基板変形(明視野画像と重なり合う)は、各時点における変位視野で表される。変位方向及び大きさは、それぞれ矢印方向及び色で示されている。変位は、セル広がり面積が大きくなるにつれて、B2Bセル本体の端部で大きくなる。カラーバーは変位の大きさを示します(真紅 = 高い大きさ、黒 = 低い大きさ)。(d)変位フィールドから算出した牽引フィールド(明視野画像と重なり合う)。牽引力はB2B細胞の境界に集中している。白と黄色の点線の輪郭は、それぞれ細胞と核の境界を示しています。カラー バーは、牽引力の大きさを示します (真紅 = 高い大きさ、黒 = 低い大きさ)。スケールバー = 20 μm。略語: YAP = はい関連タンパク質;PAA = ポリアクリルアミド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:剛性が変化する基質上および早期拡散中のPC9癌細胞のYAP発現/分布、基質変位場、および牽引場の変化。 (a)最初の細胞-基質付着から65時間後に2、5、および40kPaのPAAゲルおよびガラスカバースリップ上に播種したPC9細胞のYAP発現。(B)PC9細胞を5kPaのPAAゲル上に播種し、最初の細胞-基質付着後10時間にわたって画像化した。YAP発現は、緑色蛍光強度で表される。注: YAP 強度は 1.5 時間以降は頭打ちになります。カラーバーは、(A)および(B)におけるYAP発現(緑色=高発現;黒=低発現)のレベルを示す。(C)細胞位置における基板変形(明視野画像と重なり合う)は、各時点における蛍光ビーズ変位場によって表される。変位方向及び大きさは、それぞれ矢印方向及び色で示されている。PC9セルによって引き起こされる変位フィールドは、B2Bセルによって引き起こされる変位フィールドよりも小さい。10時間の拡散プロセスを通して、PC9セルの面積はほぼ一定に保たれます。カラーバーは変位の大きさを示します(真紅 = 高い大きさ、黒 = 低い大きさ)。(d)変位フィールドから算出したトラクションフィールド(明視野画像と重なり合う)。この代表的なPC9セルによって生成される牽引力は、6時間目から10時間目に徐々に減少する。白と黄色の点線の輪郭は、それぞれ細胞と核の境界を示しています。カラー バーは、牽引力の大きさを示します (真紅 = 高い大きさ、黒 = 低い大きさ)。スケールバー = 20 μm。略語: YAP = はい関連タンパク質;PAA = ポリアクリルアミド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:拡散初期の段階でのB2B細胞およびPC9細胞におけるYAP分布。 (A)B2B細胞のYAP強度は、0番目 および10番目の 時間で割り当てられた赤色軸に沿って測定され、(B)0番目の 時間において、YAP強度は核と細胞質との間の劇的な濃度差を示す。10時間目に は、YAP強度は細胞体全体にわたってより均質になる。(C)PC9細胞のYAP強度は、割り当てられた青色軸に沿って0番目 および10時間目に 測定される(D)0時間 において、核内のYAP強度は細胞質内のそれよりも高く見えるが、その差はB2B細胞ほど顕著ではない。10時間目 でも、核内のYAP強度は依然として細胞質内のそれよりもわずかに高く、0時間目 と同様の変動傾向を示す。スケールバー = 20 μm (A, C)。略語: YAP = はい関連タンパク質。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:YAP N/C比の測定 (1)フィジーImageJを適用して原子核の輪郭を描き、その2D投影面積アヌクを測定します。(2)イヌック核内部の蛍光強度を測定する。(3)細胞本体の輪郭を描き、その投影面積を加速度で測定する。(4)細胞内の蛍光強度を測定する Icel.(5)YAP核密度Dnuc、YAP細胞質密度Dcyto、およびそれらの比R:Dnuc=Inuc/Anucを計算する。Dcyto=(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc);R=ドヌック/ドサイト。カラーバーは、YAP 式のレベルを示します (緑 = 高式、黒 = 低式)。スケールバー = 20 μm。略語: YAP = はい関連タンパク質;N = 核;C = 細胞質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:細胞拡散中のPC9がんおよびB2B正常細胞における明確なYAP発現、細胞/核形態、および細胞牽引。 (A) YAP N/C比は、単一細胞拡散の最初の10時間の間に変化する。B2B細胞(赤色列;n = 10)の平均YAP N/C比は2.54 ± 0.22 ± 1.79 ± 0.21 (n = 10; p = 0.0022**)に変化し、PC9細胞(青色列;n = 5)の平均YAP N/C比は1.92 ± 0.26から1.57 0.07(p = 0.187 (ns))に変化した。(B) 時間の関数としての平均双極子牽引力。B2B細胞の平均双極子牽引力は256.17 ± 123.69 nNから287.44 ± 99.79 nN(p = 0.7593 (ns))に変化し、PC9細胞の平均双極子牽引力は141.19 ± 33.62 nNから168.52 ± 73.01 nN(p = 0.7137 (ns))に変化した。(C) 時間の関数としての平均セル面積。B2B細胞の平均細胞広がり面積は613.89 ± 102.43 μm2から942.51 ± 226.71 μm2(p = 0.0512 (ns))に増加し、PC9細胞の平均細胞広がり面積は495.78 ± 97.04 μm2 ± 563.95 (p = 0.5804 (ns))に変化した。(D)時間の関数としての平均核面積。B2B細胞の平均核広がり面積は181.55 ± 36.18 μm2から239.38 ± 43.12 μm2(p = 0.1217 (ns))に増加し、PC9細胞の平均核広がり面積は133.31 ± 30.05 μm2から151.93 ± 22.49 μm2(p = 0.5944 (ns))に変化した。略語: YAP = はい関連タンパク質;N = 核;C = 細胞質;ns = 有意ではない。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:YAP N/C比と、細胞と核の広がり面積の関数としての双極子牽引力。B2B細胞(n=10)およびPC9細胞(n=5)のYAP N/C比および双極子牽引力は、基板に付着した後の6時間目から10時間目まで算出される。(A)細胞拡散面積の関数としてのYAP N/C比。B2B細胞のYAP N/C比は1.16から2.53まで変化し、PC9細胞のYAP N/C比は1.27から1.88まで変化する。B2B細胞の細胞拡散面積は391.94μm2から1986.40μm2まで変化する。PC9細胞の細胞広がり面積は、284.46μm2~830.12μm2の範囲である。(B) 原子核拡散面積の関数としてのYAP N/C比。B2B細胞の核広がり面積は107.09 μm2から514.28 μm2まで変化する。PC9細胞の核広がり面積は58.03μm2~259.65μm2の範囲である。細胞拡散領域(C)および核拡散領域(D)の関数としてのB2B細胞の双極子牽引。拡散および非遊走性のB2B細胞は、より高い牽引力(47.50nNから1051.48nNまで)を示し、細胞および核面積は低い。B2B細胞は、拡散および遊走している間、より低い牽引力(105.80nNから310.28nNまで)を示し、細胞および核面積の範囲が広い。略語: YAP = はい関連タンパク質;N = 核;C = 細胞質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:正常B2B細胞およびがんPC9細胞における核周囲置換。 (a)基板中のビーズ変位から測定した核周囲および細胞周囲変位の概略側面図。(B)PC9セルの下の基板変位をセル軸に沿って測定する( 7Dの白い破線)。セル境界での双極子力によって生成される理論的な変位は、Boussinesq方程式(黒い破線の曲線)によって示されます。(C)及び(D)貼付後6時間目 におけるPC9細胞について蛍光ビーズ画像(赤色)及び無い(緑色)細胞を重ね合わせた画像(上面図)。黄色(赤と緑の色の正確な重なり合い)ビーズは、変位がないことを示します。分離された緑色と赤色のビーズ(黄色の矢印で示される)は、核周囲の変位を表す。黄色の矢印は、核の周囲に位置するこれらの収縮した核周囲斑点を示す。(E)細胞-基質付着後1.5時間 目にB2B細胞によって生成される核周囲変位。スケールバー = 10 μm (C–E)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:YAP-mNeonGreen21-10/11のゲノム配列マップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:早期拡散中のB2B正常細胞のYAP発現/分布、基質置換場、および牽引野の変化。(A, D, G, J, M)B2B細胞を5kPaのPAAゲル上に播種し、最初の細胞-基質付着後10時間にわたって画像化した。YAP発現は、緑色蛍光強度で表される。注:核内のYAP強度は徐々に減少しますが、時間の経過とともに細胞質内よりも高いままです。カラーバーは、(A、D、G、J、M)におけるYAP式(緑=高式、黒=低式)のレベルを示します。(B, E, H, K, N) セル位置における基板変形(明視野画像と重なり合う)は、各時点における変位場で表される。変位方向及び大きさは、それぞれ矢印方向及び色で示されている。変位は、細胞広がり面積が大きくなるにつれてB2B細胞体の周囲で大きくなる。カラーバーは、(B、E、H、K、N)の変位の大きさ(真紅=高等級、黒=低等級)を示します。 (C, F, I, L, O) トラクションフィールド(明視野画像と重なり合ったもの)は、トラクションフォース顕微鏡を用いて変位フィールドから算出した。牽引力はB2B細胞の周囲に集中している。カラーバーは、(C、F、I、L、O)の牽引マグニチュード(真紅=高マグニチュード、黒=低マグニチュード)を示します。スケールバー = 20 μm。略語: YAP = はい関連タンパク質;PAA = ポリアクリルアミド。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:早期拡散中のPC9癌細胞のYAP発現/分布、基質置換場、および牽引野の変化。(A, D, G, J) PC9細胞を5kPaのPAAゲル上に播種し、最初の細胞-基質付着後10時間にわたって画像化した。YAP発現は、緑色蛍光強度で表される。注:核内のYAP強度は徐々に減少しますが、時間の経過とともに細胞質内のそれと類似またはわずかに低いままです。カラーバーは、(A、D、G、J)におけるYAP式(緑=高式、黒=低式)のレベルを示します。(B, E, H, K) セル位置における基板変形(明視野画像と重なり合う)は、各時点における変位場で表される。変位方向及び大きさは、それぞれ矢印方向及び色で示されている。この変位は、細胞広がり面積が大きくなるほどPC9細胞体の周辺部で大きくなる。カラーバーは、(B、E、H、K)の変位の大きさ(真紅 = 高い大きさ、黒 = 低い大きさ)を示します。 (C, F, I, L)変位フィールドから算出したトラクションフィールド(明視野画像と重なり合う)。牽引力はPC9細胞の周囲に集中している。カラーバーは、(C, F, I, L)の牽引力の大きさ(真紅 = 高い大きさ、黒 = 低い大きさ)を示します。スケールバー = 20 μm。略語: YAP = はい関連タンパク質;PAA = ポリアクリルアミド。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

イメージングプロセス(ステップ6.3)は、蛍光画像が有効な定量結果を得るために十分に良質であることを保証するために重要です。蛍光タンパク質またはビーズの Z スタック画像は、サンプルがまたがるすべての Z 位置の焦点内画像を含めるのに十分な大きさの z 範囲を持つ必要があります。もう1つの重要なステップは、細胞を溶解した後の蛍光ビーズの基準画像を収集することである(ステップ6.5)。ステップ6.3で参照画像を同じ位置で撮影する必要があるため、シャーレ、環境チャンバ、顕微鏡間で相対的な変位を誘発しないでください。溶解ステップを実行する研究者は、ペトリ皿の蓋を取り外し、適用される機械的摂動が環境チャンバ内の皿の位置を変更するのに十分な大きさではないことを確認するように注意しなければならない。

実験中に発生する可能性のあるいくつかのエラーを解決するための解決策を以下に示します。手順 6.4 で Enter をクリックしてもマクロがアクティブにならない場合は、画面の左下の領域が [要素] 以外のウィンドウによって占有されている可能性があります。このような場合は、ウィンドウの左下の領域をクリアして、 Elementsでマクロをアクティブにする必要があります。もう1つの一般的なエラーは、明視野画像が黒く表示されることです。この問題は、蛍光画像と明視野画像の取得間の時間間隔が不十分であることが原因です。蛍光画像化の時間カウントにおけるわずかな遅延は、時間の経過とともに蓄積し、かなりの遅延を引き起こし、明視野画像化を妨害し得る。1つの解決策は、すべての位置の1つの撮像サイクルの持続時間を、連続した運動の開始間の時間間隔よりも短く(等しくない)ように調整することである。この操作により、時間カウントが更新され、各イメージングサイクルの開始時の累積誤差が排除されます。

この全光学的尋問技術は、(1)ニコンを含むがこれに限定されない幅広いハードウェア/ソフトウェア、(2)ゼラチン、PEG、マトリゲル、コラーゲンIゲルを含む多様なタイプの検証済みヒドロゲルシステム、および(3)研究者のさまざまなニーズに基づいてプログラム可能なカスタマイズをサポートします。しかし、市販の顕微鏡で最下位レベルの制御機能が利用できない場合、AMFIPを使用した機能のカスタマイズが困難になります。この手法のもう 1 つの制限は、XY 平面とフォーカス (Z) 平面の両方でのサンプルの空間ドリフトです。この制限は画像の後処理中に克服できますが、サンプルのリアルタイムドリフトを補正するためにオートフォーカス機能を改善することが不可欠です。この改善により、イメージングプロセスのスループットが向上し、実験中のドリフトによって引き起こされる潜在的な誤差が減少します。

YAPなどのメカノトランスデューサは、有望ながん治療法の開発のための新しい治療標的として役立つ可能性があります25,26,27。新たなデータは、YAPが癌細胞の増殖および浸潤を促進することを示唆している。力学によって誘導された細胞質から核へのYAP転座は、細胞遊走、増殖、浸潤、およびアポトーシスに関連する遺伝子の転写を活性化し、異常な細胞挙動をもたらす28、29、30、31。この研究は、2つの典型的なヒト肺癌と正常細胞株におけるYAP N/C比と細胞力学の潜在的な相関関係を探ることを目的としていた。10時間の細胞拡散期間中、PC9細胞は核および細胞質において同様のYAP濃度を示す(図3Dおよび図5A)。B2B細胞は、細胞質内よりも核内でより高いYAP濃度を示す(図3Cおよび図5A)。初期の拡散段階で発見されたこの関係は、正常細胞と癌細胞の間で核内のYAP濃度を比較する公表された知見の大部分とは異なる。必ずしも初期の拡散段階にあるわけではないが、ほとんどの公表された知見は、YAPが正常細胞の核よりも癌細胞の核に集中していることを示している27,28。乳がんに関する1つの研究のみが、YAPが細胞質内でより集中していることを示す例外32を報告しており、これは肺がんPC9細胞で行われた現在の観察と一致しています。著者らの知る限りでは、この研究はヒト肺がん細胞株において低いYAP N/C比を示した最初の研究である。著者らは、PC9細胞においてYAP N/C比が安定している理由は、細胞/核の広がり面積の変動が小さく、PC9細胞の広がりの初期段階での牽引力が低いためかもしれないという仮説を立てている。PC9およびB2B細胞における低YAP N/C比の根底にある分子機構の解剖は進行中である。

拡散の最初の10時間の間に、これら2つの細胞株は、YAP N/C比、細胞牽引、および広がり領域の間に明確な関係を示す(図5)。B2B細胞の場合、より高いYAP N/C比は、より高い細胞および核広がり面積と相関しており(図6A,B)、これは他の正常細胞の報告されたデータと一致している33。興味深いことに、この関係の発生傾向は、記録されたすべてのB2B細胞に一般的に見られるが、この関係の2つの異なる程度(高低)が見出される。同時に拡散および遊走するB2B細胞は、より高いYAP N/C比(2.05 ± 0.32)で、より低い牽引力およびより高い細胞および核拡散面積を示す。広がり、同じ位置にとどまるB2B細胞の場合、それらはより高い牽引力を示し、より低いYAP N / C比(1.74 ± 0.21)でより低い細胞および核広がり面積を示す。これら2つの関係度は、分岐した散在するデータグループに示されています(図6C、D)。文献で報告されているように、胚性線維芽細胞NIH 3T3細胞などの静止正常細胞は、遊走性細胞よりも高い牽引力を有する34。この論文で報告されたデータは、拡散および非遊走B2B細胞が拡散および遊走B2B細胞よりも高い牽引力を印加することを示唆しており、非遊走細胞が基板上で安定化するためには高い牽引が必要であることを示唆している可能性が高い。

さらに、これらのデータは、静止した正常なB2B細胞がより高い核周囲力を生成することを示しているが、他の研究者によって行われた以前の研究は、静止細胞の周囲で生成されたより高い細胞牽引力のみを報告した34,35,36,37。著者らは、実験における移住の本質的な傾向の違いが、これらの矛盾した結果を引き起こす可能性があると考えている。公表された実験では、正方形のマイクロパターニングが、単一細胞の拡散を閉じ込め、遊走を阻害するために使用されていた。細胞が遊走する傾向を有していたかどうかは不明である。遊走性細胞は細胞の周辺で高い牽引力を示すことが多いため38、遊走する傾向のある細胞は、遊走が制限されていても依然として高い周辺牽引力を維持する可能性が高い。本研究では、静止細胞はいかなるマイクロパターンによっても制限されないが遊走しないことから、細胞が非遊走状態を維持する傾向があることを示している。別の可能性は、マイクロパターンによって規定されるセル形状が、焦点接着および牽引力39の分布に影響を与え得ることである。本研究の結果は、マイクロパターニングを閉じ込めることなく生成され、静止細胞の力分布を元の形状で表したものである。

著者らの知る限りでは、正常細胞(マウス胚性線維芽細胞)における核周囲力の発見を具体的に報告した出版物は1つだけであり、核全体に広がるアクチンキャップによって引き起こされる可能性がある40。YAP細胞質から核への転座は、核周囲力の増加と相関している40。関連文献を徹底的に検索しても、癌細胞における核周囲力またはアクチンキャップを報告する出版物は得られなかった。黒色腫癌細胞に関する間接的な研究は、アクチンリム(周囲に位置するが核を覆っていない別の核周囲アクチン組織)が細胞遊走速度を低下させることを実証し41、間接的に核周囲力の存在を示唆した。しかし、直接的な実験データは報告されていない。この研究で、著者らは、PC9細胞とB2B細胞の両方が核周囲の変位と牽引力を示すことを見出した。核周囲勢力の生成メカニズムとその影響は、依然として議論の余地がある。正常細胞では、アクチンキャップが核の形態とクロマチン組織の調節42、核骨格と細胞骨格(LINC)複合体43のリンカーを介して核への局所接着からの機械的シグナルの伝達、および細胞の遊走の調節に役割を果たすことが報告されました44。ラミンA / Cは、アクチンキャップ40、41、42、43、44の形成および破壊に関連している。しかしながら、アクチンキャップが核周囲力を発生させると主張する報告は、アクチンリム40の潜在的な役割を考慮していなかった。癌細胞において、ラミンAの過剰発現はアクチンリムの形成を促進し、癌細胞の遊走を制限する。ラミンBの過剰発現はアクチンリム形成を減少させ、遊走を促進する。核前後の力は、核周囲アクチン組織の存在とラミンAの効果のために、このプロセスに関与している可能性がある。しかし、この研究の結果は、測定された核周囲力またはアクチンキャップの挙動の証拠を示さなかった。したがって、本研究におけるPC9細胞における核周囲力の発見は、肺癌細胞における核周囲力および変位を示す最初の報告である。著者らは現在、CRISPR/Cas9で操作されたPC9細胞とB2B細胞における核周囲力の分子メカニズムと機能を調べている。

この論文で実証されている全光学機械生物学の尋問を超えて、統合された多機能システムは、生命系における無数の他の重要な生理学的および病的生物学的信号を光学的にプローブするために適用することができる。例えば、著者らの研究室は最近、膜電圧指示器QuasAr2(励起:640nm;発光:660nm-740nm)、膜電圧脱偏光子CheRiff(励起:488nm)、および膜電圧過偏光器eNpHR3(励起:590nm)の3つの光応答性膜タンパク質を共発現する複数の安定形質導入ヒト癌細胞株を確立した。これら3つの機能性タンパク質は、スペクトル直交レーザーラインによってクロストークフリーで活性化することができ、膜電気生理学の全光学的双方向シグナル伝達(読み出しおよび制御)を可能にする。著者らは、統合されたオプトエレクトロニクスシステムと手動パッチクランプを使用して、単一のヒトがん細胞および多細胞腫瘍スフェロイドにおける膜電圧(Vm)の全光学制御および読み出しを検証した。全光学電気生理学の調査は、癌細胞における以前はアクセスできなかった生体電気の詳細な探査の可能性を開き、腫瘍生物学を新しい軸から進歩させるのに役立つかもしれない。

開示事項

宣言する利益相反はありません。

謝辞

このプロジェクトは、UF Health Cancer Center(X. T. and D. S.)のCancer Pilot AwardとGatorade Award Start-up Package(X. T.)によって財政的に支援されています。著者らは、ジョナサン・リヒト博士(UFHCC)、ロルフ・レンヌ博士(UFHCC)、イ・ジヒョン博士(生物統計学、UF)、ヒュー・ファン博士(MAE、UF)、ウォーレン・ディクソン博士(MAE、UF)、ガトゥ・スバシュ博士(MAE、UF)、マーク・シェプラク博士(MAE & ECE、UF)、マリサ・サルンティノラノント博士(MAE、UF)、スコット・バンクス博士(MAE、 UF)、マシュー・トラウム博士(MAE、UF)、デイビッド・ハーン博士(アリゾナ大学)、ワン・ウェイホン博士(オラクル・コーポレーション)、ユフア・タン博士(香港理工大学)、ニコンのサポートチーム(ホセ・セラノ・ベレス博士、ラリー・コルドン博士、ジョン・エクマン博士)。著者らは、Tang's、Siemann's、Guanの研究所のすべてのメンバーと、UFのMAE & ECE & Physics & Radiation Oncology Departmentsのすべてのスタッフからの寛大で効果的な支援に深く感謝している。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(3-アミノプロピル)トリエトキシシランSigma-aldrich440140
0.05% トリプシンコーニング25-051-CI
75 cm2 フラスココーニング430641U
8 卓上遠心分離機サーモ75007210
A1R 共焦点システムニコンHD25
酢酸Sigma-aldrich695092氷河、ACS試薬、≥99.7%
BEAS-2B (B2B) cellsSigma-aldrich95102433human epithelial cells from lung tissue
Carboxylate-modified MicrospheresInvitrogenF8797
Culture medium (RPMI-1640)Gibco11875093
Desktop ComputerDell2018with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZBTokaiヒットTIZB
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco26140
フィブロネクチンヒトタンパク質、血漿Gibco33016015
Fiji ImageJNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation1.53k
ガラス底ペトリ皿MatTekP35G-1.5-14-C
HEPES バッファード生理食塩水Sigma-aldrich51558
Hydrazine hydrate solutionSigma-aldrich53847
IntelliJ IDEAJetBrains2020Java development platform
Java Development KitOracle14.0
KimwipeKimtech Science3066-05
MATLABMathWorks2020b
モノクロ カメラFLIRBFS-U3-70S7M-C
MycoAlert マイコプラズマ検出キットLonzaLT07-218
N,N′-メチレンビスアクリルアミド溶液Sigma-aldrichM1533
NIS-Elements ソフトウェアプラットフォームNikon4.50ソフトウェアプラットフォーム
OriginLabOriginPro 2017 (Learning Edition)データ分析グラフ作成ソフトウェア
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140122
PC9 細胞Sigma-aldrich90071810ヒト腺癌細胞  肺組織から
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco10010023
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England Biolabs F-553S高忠実度 DNA ポリメラーゼ
スコッチテープスコッチ粘着テープ
ドデシル硫酸ナトリウム溶液Sigma-aldrich05030
瞬間接着剤ゴリラシアノアクリレート接着剤
Ti2-E 倒立顕微鏡ニコンMEA54000
TI2-S-SE-E エンコーダ付き電動ステージニコンMEC56120
μManagerバージョン 2.0 ガンマオープンソース顕微鏡ソフトウェア (https://micro-manager.org/)

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