ダクト:3D肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造

サマリー

二重樹脂鋳造マイクロコンピュータ断層撮影(ダクト)は、2つの管状システムの視覚化、デジタル化、セグメンテーションを同時に可能にし、臓器アーキテクチャの3D解析を容易にします。ダクトは、2つの放射不透明樹脂の 元生体 注入とそれに続くマイクロコンピュータ断層撮影スキャンと断層撮影データのセグメンテーションを組み合わせたものです。

要約

肝臓はヒトおよびマウスで最大の内臓であり、高い自己蛍光は全器官レベルでの器官の3次元(3D)アーキテクチャを評価するための重要な課題を提示する。肝臓アーキテクチャは、血管や胆道樹を含む樹脂で満たすことができる複数の分岐性内腔化構造によって特徴付けられており、それ以外の場合は肝細胞が豊富なパレンチマに高度にステレオタイプ化されたパターンを確立します。このプロトコルは、マイクロコンピュータ断層撮影、または「ダクト」を二重樹脂鋳造を行うためのパイプラインを記述する。ダクトは、2つの異なるラジ不透明な合成樹脂を持つ門脈と共通の胆管を注入し、続いて組織固定を伴う。1つのローブ、または肝臓全体を光学的なクリア剤でクリアすることにより品質管理は、適宜注入されたサンプルの事前スクリーニングを可能にする。ダクトパイプラインの第2部では、ローブまたは肝臓全体をマイクロコンピュータ断層撮影(microCT)スキャン、(半)自動セグメンテーション、およびポータル静脈および胆道ネットワークの3Dレンダリングに使用できます。MicroCT は、2 つの樹脂の 3D 座標データを得て、2 つのシステムの定性分析と、それらの空間的関係の定量的分析を可能にします。ダクトは、出生後および成人マウス肝臓に適用することができ、さらに他の管状ネットワーク、例えば、肺の血管ネットワークおよび気道に拡張することができる。

概要

オルガン樹脂鋳造は17^世紀 にさかのぼる技術^です。現代の樹脂鋳造の最初の例の1つは、解剖からヒト肝臓で行われた。肝内胆管はゼラチンと混合した造影剤で満たされ、続いてX線CTスキャン2による画像化を行^った。ダクト技術の目的は、3Dで2つの管状樹脂鋳造ネットワークを3Dで視覚化、デジタル化、解析することです。

ダクトは、単一システムの肝樹脂鋳造^{3、4、5、6、7、8} の広範な既存の知識に基づいており、2つのシステムの同時3D視覚化と分析に拡張^します。ダクトは、異なるコントラストの2つの放射不透明樹脂を混合し、これらの樹脂を2つの異なるネットワーク、特に共通の胆管およびポータル静脈に注入することによって、二重樹脂鋳造に単一樹脂鋳造を進んだ。ダクトは、出生後15日目(P15)の早い時期に再現可能な結果を有する若い出生後マウスに適用することができる。顕微鏡ベースのイメージング技術と比較して、主な利点は、ダクトが高速で、抗体を含まない、および肝臓組織の自己蛍光がイメージングを妨げないです。また、ダクトは、内腔化状態、内径、ネットワーク接続性、および灌流を記述する定量的データを提供する。管腔形成細胞の存在と、その事実上の形態形成の存在をチューブに区別することは、管内細胞が存在するが、アラジル症候群¹⁰の場合と同様に、チューブを形成しない器官を分析するために不可欠である。ダクトの主な欠点は、粘性があり、小口径(<5 μm)のチューブに入らない樹脂の限られた浸透です。ダクトは、動脈および静脈循環系、気道、肝外胆管、またはリンパ管などの注入入り口点を決定した後、任意の管状構造に適用することができる。したがって、肺や膵臓などの他の組織の全臓器アーキテクチャ分析を容易にする可能性があります。

MicroCTセグメント化された画像は、ImageJなどの市販のイメージングソフトウェアまたはカスタム書き込みパイプライン(MATLABなど)を使用して処理できます。樹脂注入された肝臓は、体積、長さ、分岐、単一システムのトート、2つのシステム間の距離、または分岐点依存(システム1がシステム2分岐に近接して分岐する)などの2つのシステム間の相互作用について、ネットワーク拡張および接続性または定量的に定性的に分析することができる。樹脂注入、マイクロCTスキャン、CTデータセグメンテーションを含むダクトパイプラインは、2つの管状システムの建築メカニズムの詳細な定量分析と組み合わせることで、動物モデルにおける肝臓全体分析の標準を提供することができます。

プロトコル

この研究に記載されたプロトコルは承認され、ストックホルムノラ・ジュルフェルセクセティスカ・ナムント(ストックホルム動物研究倫理委員会)の動物福祉規則と規制に従っています。本研究で使用された動物は、混合C3H/NおよびC57bl6Jバックグラウンドで野生型またはホモ接合型Jag1H268Q変異マウスであった。男性と女性の両方が研究に含まれていました。動物は出生後15日目に、または3〜8ヶ月の間に成人として使用された。

1. 二重樹脂注入

1. 準備
   1. 樹脂溶液を準備します。二重系樹脂注入の場合、ステップ1.1.2-1.1.4に記載されているように黄色と緑の両方の樹脂を準備します。
   2. 1マウスにつき希釈樹脂の1mLアリコートを準備します。
   3. イエローレジン:3:1希釈で透明希釈したイエローシリコーンゴム(高放射性pacity)を希釈し、注射用の黄色樹脂を調製します。
   4. グリーン樹脂:青いシリコーンゴム(検出不可能な放射性パシティ)と1:1希釈で透明希釈剤を混合し、ブルー樹脂を調製します。グリーン樹脂を生成するには、希釈した青色樹脂と希釈黄色樹脂を1:1の比率で混合します。色が均質になるまで、グリーン樹脂を完全に渦に入れる。
      注:ブルー樹脂は、マイクロCTでは検出できない非常に低い放射性pacityを有するため、異なる放射性pa00で2つの樹脂を作成するために黄色の樹脂で希釈する必要があります。
      注意: 樹脂には、発がん性物質である鉛クロメートが含まれている場合があります。それは火の中で有毒ガスを生成します。取り扱い、有害廃棄物として樹脂を処分します。
   5. ステップ 1.1.6-1.1.11 で説明されているように、チューブを使用して 2 つのインジェクション セット (射出セット #1 および射出セット #2) を準備します。
      注:成体マウス(>P30(出生後30日目)=P30-2年)の場合、一般的な胆管注入用注射セット#1(0.6mm外径のPE10チューブ)と注射セット#2(0.96mm外径のPE50チューブ)を使用して、ポータル静脈注入を行います。若い出生後マウス(P30まで)の場合は、胆管用とポータル静脈注射用の2つの#1注射セットを準備します(ポータル静脈が狭すぎてPE50チューブを収容するには注射セット#2はありません)。
   6. ●射出セット#1を用意するには、PE10チューブの30cmを切り、できるだけ薄くなるまで引っ張ってチューブの片端を手で伸ばす(図1A、B、直径約0.15mm、伸ばされていないPE10チューブ径は0.6mm)。
   7. 伸びた PE10 チューブの先端を斜めに切り、斜めの先端を作成します(図 1B)。
   8. PE10チューブの非伸ばされた端を30G針に接続します(図1A、インジェクションセット#1)。
   9. インジェクションセット #2 を準備するには、PE50 チューブの 30 cm を切断し、それを引っ張って管の一方の端を手で引っ張り、ポータル静脈に収まるほど薄くなるまで引き上げます (図 1A、B、約 0.7 mm、伸ばさない PE50 チューブ径は 0.96 mm)。
   10. 伸びた PE50 チューブの先端を斜めに切り、斜めの先端を作成します(図 1B)。
   11. PE50チューブの非伸ばされた端を23G針に接続します(図1A、射出セット#2)。
       注: 各インジェクション セットは、樹脂がシリンジとチューブで硬化するため、1 回の射出にのみ使用できます。マウスの一般的な胆管と門脈のサイズに基づいて、伸ばされ、ベベアされた先端のサイズを調整します。チューブの大きさやフィット感が不明な場合は、切開後、チューブが樹脂で満たされる前に、適切なダクトまたは容器にチューブを挿入します。チューブが広すぎて管/容器に収まらない場合は、さらに伸ばします。
   12. イオフルラン吸入(最初の4%の誘導チャンバーで、鼻コーンを使用して〜2%)によって動物を麻酔します。
   13. マウスが鼻コーンを通してイオブルランを呼吸している間、解剖パッドの換気ベンチにマウスを置きます。例えば、足の1つをつまむことによって、動物が研究所/IRB推奨の方法で意識不明であることを確認します。
       注意:イオブルランは吸入時に眠気やめまいを引き起こし、長期または繰り返し暴露を通じて心血管系および中枢神経系に損傷を引き起こす可能性があります。吸い込まないで下ろしてください。換気ベンチと換気の良い場所で物質を扱います。
       注:心臓灌流と互換性がある限り、別の麻酔方法を使用することができます。
   14. 動物が意識を失ったら、腹側に70%エタノールを吹き付けて毛皮からの干渉を防ぎます。
   15. 皮膚はさみを使用して、腹腔の中線から皮膚、筋膜、筋層を切断し、胸腔に切り抜いて内臓を露出させる。
   16. 胸骨を持ち上げ、両側の横隔膜と肋骨ケージを切断して心臓と肺を露出させる鉗子でxiphoidプロセスをつかむ。
   17. リブケージの左右のリブをはさみで切り取って、リブケージを取り外します。これは樹脂の漏出をもたらすので、肝臓を損傷しないように特別な注意を払ってください。
   18. ストレート鉗子を使用して、肝臓に向かって心臓を引っ張り、右心房を切り取ります。
   19. 蠕動性灌流ポンプに接続された蝶の針(23G)を左心室に挿入する。ハンクスバランス塩溶液(HBSS)とヘパリン(マウス体重1U/g)でマウスを経皮的に浸透させる。5 mL/分の灌流速度で3分間パーフューズします。
       注:マウスが正しく浸透している場合、内臓、特に肝臓が薄くなります。代わりに、肺が白くなっている場合、針は右心室に挿入され、再配置する必要があります。灌流後、マウスを剥離し、鼻コーンとイオブルランから除去することができる。
   20. イオフルランポンプをオフにします。
2. 樹脂注入 - 胆道系樹脂鋳造
   1. マウスを解剖顕微鏡に移動し、腹部を上に、実験者に向かって尾を動かし、実験者から離します。目的の解剖学的ランドマークは 図2Aに示されています。
   2. 腸を横に移動させることにより、下の大静脈(図2A)を見つけます。スプリングハサミを使用して、下の大静脈に小さな横切り切開を行い、肝血管圧の放出を可能にします(図2Bi)。
   3. 手順 1.2.4~ 1.2.6 で説明されているように、共通の胆管と門脈を公開します。
   4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して、腸と膵臓を右側(実験者)に移動します。
   5. PBS湿った綿棒を使用して肝臓の腹側を心臓に向けて反転させ、内臓表面およびヒラル領域を露出させます。
   6. 膵臓を横切って腸管に入る共通の胆管を見つけ出します(図2Bii、黄色い点線で輪郭を描いた一般的な胆管、黒い矢印はオディの括約筋を指しています)。
      注:PBSに散水して、肝臓が手順全体を通して湿っていることを確認してください。
   7. ストレート鉗子を使用して共通の胆管から周囲の組織(面積〜5mm)をクリアします。シルク縫合糸(サイズ4-0、0.17mm、長さ3~5cm)を共通の胆管(図2Bii)の下に配置し、共通の胆管(図2Biii)の周りにゆるいオーバーハンドの結び目を結びます。
      注:ヒラー領域とオディの括約筋の中間の結び目の領域を選択し、共通の胆管の周りに縫合糸が締め付けられた後、それがポータル静脈注入を妨げないように、ポータルの静脈からある程度の距離で。
   8. 春のはさみを共通の胆管に対して平らに持ち、オディの括約筋の隣に共通の胆管が膵臓と腸に入る場所で、共通の胆管に斜め切開を行います。(図2Biv)、黄色の点線は、黒い矢印で強調されたオディ領域の括約筋を囲む。
      注: これは重要なステップです。斜めのカットではなく、トランスバーサルカットを行い、切開を行います。胆管を切断しないでください。胆管全体を切断すると、チューブの挿入は非常に困難になります。
   9. 使用直前に、黄色樹脂の1mLを50μLの硬化剤と混合し(1mLシリンジを充填して空にして)、1mLルアーシリンジに樹脂-硬化剤混合物を充填します。
   10. 充填したシリンジをチューブ(セット#1)に接続します。チューブを完全に充填するためにプランジャーを押します。樹脂/硬化剤がチューブの先端から滴り落ちることを確認します。
       注: 最良の結果を得るには、シリンジとチューブの泡を避けて取り除きます。
   11. 鉗子を使用して、共通の胆管切開部の周りをまっすぐにし、一般的な胆管の開口部にチューブを挿入します(図2Bv)、ベベリング先端の最も長い端を胆管の後側に向かって下向きにします。この向きにより、樹脂が上向きのチューブ開口部をダクトに出すことができます(図2Bv)。
   12. シルク糸の結び目を締めて、共通の胆管内のチューブを固定します(図2Bvi)。
   13. 一般的な胆管に樹脂を注入します。胆嚢と個々の肝臓葉を観察します。
   14. PBS湿った綿棒で肝臓をマッサージし、樹脂を均等に広げます。樹脂で満たされた胆管の末端枝(野生型マウス)は、肝臓表面でかすかに見える。
       注:肝臓を埋めるために予想時間は30 -100 sです。
   15. 肝臓の表面に樹脂のドットが現れた場合(図2Ci、青い矢印)、または抵抗性が満たされたときに樹脂を注入停止します。
       注:樹脂硬化剤を添加した後、樹脂が硬化し始めるので、できるだけ速く作業してください。硬化剤の添加からの作業時間は約15分です。
   16. 一般的な胆管から引き出してチューブを取り外し、鉗子を使用してシルクノットを素早く締め、樹脂が漏れないようにします。絹の縫合糸の緩い端を切り取り、門脈注入を妨げないようにします。
   17. 樹脂と残りの樹脂を含むチューブを有害廃棄物に処分し、針を鋭利な廃棄物に入れる。
3. 樹脂注入 - ポータル静脈樹脂鋳造
   1. まっすぐな鉗子を使用して肝臓への入り口から約2cmの周囲の組織から門脈(面積〜5mm)を取り除く。絹の縫合糸(サイズ4-0、0.17 mm、3-5 cm)を門脈のクリアされた領域(図2Ci)の下に置き、ゆったりとしたオーバーハンド結び目を結びます(図2Cii)。
   2. 肝臓と結び目に遠位の門脈で縦切開を行います(図2Ciii)。
   3. 緑色樹脂1mLを50μLの硬化剤と混合し(1mLシリンジを充填して空にして)、1mLルアーシリンジに樹脂硬化剤混合物を充填します。
   4. 充填された注射器をチューブに接続します(>P30マウスの場合は#2、注: 最良の結果を得るには、シリンジとチューブの泡を避けて取り除きます。
   5. 鉗子を使用して、周囲の組織を実験者に向かって引っ張って門脈をまっすぐにし、容器の裏側に向かってベベリング先端の最も長い端を持つ管を挿入する(図2Ciii)。
   6. 絹糸を締めて、ポータルの静脈のチューブを固定します。
   7. ポータルの静脈に樹脂を注入します。血管が樹脂で満杯になっらっているのを観察する。PBSウェット綿棒で肝臓をマッサージし、樹脂を均等に広げます(図2Civ)。
   8. すべての血管が満たされている場合(門脈の端部が肝臓周辺で見える)、または抵抗が満たされたときに、樹脂の注入を停止します。
      注:硬化剤を添加した後、樹脂が硬化し始めるので、速く作業してください。硬化剤の添加による作業時間は、射出セット#1で約15分、射出セット#2で約25分です。
   9. ポータルの静脈からチューブを引き出してチューブを取り外し、鉗子を使用してシルクノットを素早く締め、樹脂が漏れないようにします。
   10. 樹脂と残りの樹脂を含むチューブを有害廃棄物に処分し、針を鋭利な廃棄物に入れる。
4. 肝臓解剖と固定
   1. 周囲の組織と横隔膜から肝臓全体を切り取ることによって、肝臓全体を解剖します。
   2. 肝臓の変形を防ぐために、腹側を上に向け、側側を円錐管の壁に置いた空の50 mL円錐形のチューブに肝臓全体をそっと置きます。円錐形チューブを4°Cで水平に一晩保管し、樹脂が完全に硬化するようにします。
      注:肝臓に合う大きさの容器は、50 mLの円錐形チューブの代わりに使用することができます。平底容器を使用すると、肝臓が変形しない可能性が高くなります。
   3. 肝臓を個々の葉に分ける。マイクロCT解析(1.4.4-1.4.5)または品質管理(1.4.6-1.4.8)に使用されるローブを選択します。必要に応じて、個々のローブにそれを分離することなく、光クリアリングとmicroCTの両方のために肝臓全体を使用してください。
      注:胆道系と血管系の肝臓アーキテクチャは、各葉で異なっており、したがって、一致したローブ分析が必要です。光学的な清算はマイクロCTスキャンに干渉せず、後でマイクロCTでの品質管理に使用されるローブをスキャンすることができる。逆に、マイクロCTでスキャンされたサンプルは、後で光学的に比較のためにクリアすることができます。肝臓全体の分析は、このように可能です.野生型マウス(C3H/C57bl6遺伝的背景)では、適切な内側葉が最初に樹脂注射によって充填され、最も再現性の高いマイクロCT分析に適したローブとなる。左横葉は最大のローブであり、注射品質を事前にスクリーニングすることは容易である。品質管理とマイクロCTスキャンに使用されるローブ(または肝臓全体)の選択は、動物モデルと研究の質問に依存します。
   4. 換気フードで、4%ホルムアルデヒド溶液(チューブあたり10-20 mL)を調製します。マイクロCTに使用するローブを4°Cで一晩4%ホルムアルデヒドで固定し、その後PBS(1管あたり10-20 mL)で1回洗浄します。
   5. 別の容器にホルムアルデヒド廃棄物を収集します。肝臓葉をPBSで4°Cに保ち、短期保存期間は、エタノールを70%エタノールで長期保存します。セクション 2: マイクロコンピュータ断層撮影に進みます。
      注意:ホルムアルデヒドは、飲み込んだり、吸入したり、皮膚に接触したりすると急性毒性を引き起こします。ホルムアルデヒドは可燃性の液体と蒸気です。それは重度の皮膚の火傷や目の損傷を引き起こします。アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。吸入した場合(濃縮または粉末中)、致命的。呼吸刺激を引き起こす可能性があります。遺伝的欠陥を引き起こす疑いがある。癌を引き起こす可能性があります。臓器(目、中枢神経系)に損傷を与えます。予防的な声明 - 熱、熱い表面、火花、開炎、およびその他の点火源から遠ざけます。禁煙。保護手袋と防護服を着用してください。こぼれた場合は、汚染されたすべての衣類を直ちに脱ぐ。皮膚と接触した場合:汚染された領域を水ですすいでください。吸入した場合:新鮮な空気に人を削除し、快適であれば呼吸を監視します。すぐに毒センター/医師を呼び出します。目の場合:数分間水で目をすすいでください。存在し、可能であれば、コンタクトレンズを取り外します。
   6. 品質管理のために、残りのローブ(少なくとも1つ)を50%メタノール(脱イオン水と混合)で最低4時間固定し、室温で揺れ動き、続いて室温で100%メタノールを一晩揺らします。メタノール廃棄物を別の容器に回収する。
      注意:メタノールは、飲み込んだり、吸入したり、皮膚に接触したりすると急性毒性を引き起こします。メタノールは可燃性の液体と蒸気です。保護手袋と衣服を着用してください。取り扱い時の呼吸を避け、火や熱から遠ざけてください。使用後は肌を十分に洗ってください。こぼれた場合は、直ちに汚染された衣類を脱ぐ。水で皮膚をすすいすります。吸入した場合:新鮮な空気に人を取り除き、呼吸のために快適に保ちます。吸入、飲み込まれた、または暴露された場合は、毒センター/医師を呼び出します。
   7. 換気フードで、ベンジルアルコールとベンジルベンゾエート(BA:BB、1:2)(ローブあたり5-10 mL)溶液を調製します。
   8. BABB溶液を含む15-または50-mLポリプロピレンチューブ(ローブの大きさに応じて)に肝臓のローブを入れる。透明になるまで室温で揺れ動かせます。このステップは、ローブの大きさに応じて2〜16時間かかります。
      注意:BABBソリューションは、プラスチックの特定のタイプを溶解します。ポリプロピレンチューブやガラス容器にサンプルを保管しても安全です。
      注意:ベンジルベンゾアートは、飲み込むと急性毒性を引き起こす可能性があります。それは長期的な効果を伴う水生生物に有毒である。予防的な注意事項:取り扱い後に皮膚を十分に洗います。飲み込んだり、皮膚に触れたり、吸入したりすると有害です。煙/蒸気を吸い込まないでください。取扱い後は手を十分に洗ってください。本製品を使用する際は、飲食・喫煙はご利用ください。飲み込んだ場合 - 体調が悪い場合は毒センター/医師を呼び出します換気された領域で使用してください。こぼれを集める。許可された廃棄物処理プラントに内容物/容器を処分する。
   9. 射出の品質を検査します。適切に注入された肝臓のみをmicroCTでスキャンする必要があります。.

2. マイクロコンピュータ断層撮影

1. サンプル準備
   1. 100mLの蒸留水と1gのアガロース粉末を混合して、1%のアガロースゲルを調製します。混合物を電子レンジに入れ、アガロース粉末が溶解するまで溶液を沸騰させます。
   2. 肝臓試料への熱的損傷を避けるために、1%アガロースゲルを〜40°Cに焼戻す。
   3. 目的のローブを15 mL円錐形チューブに入れ、1%アガロースゲルでチューブの総容積の約2/3に充填します。このステップはCT測定の間の望ましくないサンプルの動きを最小にする。
2. CT測定
   メモ: 次の手順は CT デバイスに依存しており、CT デバイスや製造元によって特定の設定と動作が異なる場合があります。このプロトコルでは、使用されるマイクロコンピュータ断層撮影スキャナは、ナノフォーカスX線管(180kV/15 W)とフラットパネルダイナミック41|100(4048 px x 4048 px、ピクセルサイズ100mm、ビニング2)を搭載していました。
   1. サンプルを用いて15 mL円錐管をCT装置の回転ステージに取り付け、少なくとも1時間測定室に熱的に適応させます。
   2. サンプルが熱的に調整されたら、視野(FOV)で中央に配置します。
   3. ソースサンプルとサンプル検出器の距離(SSD、SDD)を最適化して、成人マウス肝臓サンプルの場合は12μm、
   4. 検出された信号の十分なレベルに達するために、CTデバイスメーカーの推奨に従って、取得パラメータ(すなわち、電圧と電流、露出、ビニング、平均を加速)を設定します。これらのパラメータは、CTデバイスに依存するだけでなく、サンプルに依存するものであり、各サンプルに対して最適化する必要があります。ハンケオバ^ら9では、80kV加速電圧、160μA加速電流、400ms露光時間、2000画像の設定が行われました。
   5. CT測定を開始します。専用の断層再構成ソフトウェアを使用して、CTデータを再構築します。

3. 分析とデータのセグメンテーション

注: 次の手順は、イメージ処理ソフトウェアに依存します。使用するソフトウェアによって、設定やアクションが異なる場合があります。

1. CT データを読み込む: ファイル>インポート>コマンドを選択します。さらに選択は、処理される CT データの特定の形式に依存します。
2. 上部パネルの[ 表面決定] 関数を使用して、グローバルしきい値を使用してデータ内の樹脂をセグメント化します。ダイアログウィンドウで、赤い「等値」線の位置を樹脂で満たされた容器のみをセグメント化するように設定することで、ヒストグラム評価でしきい値を決定します(すなわち、提示された「プレビューパネル」の黄色い線に囲まれた)。
3. 左側のパネルで、 ボリューム/CAD/メッシュから ROI を作成 するモジュールを選択して、樹脂充填容器の対象領域(ROI)を作成します。ダイアログウィンドウで、[ ソリッドから ROI を作成]オプションを使用して、処理されたボリュームの名前を選択して確認します。
4. この ROI のバックグラウンド領域におけるノイズ クラスタの誤ったセグメンテーションを排除します。右側のパネルでこのROIをマークし、右クリックしてモジュール スプリットROIを選択します。
5. ダイアログ ウィンドウで、すべてのノイズ パーティクルを除外する最小体積 [ボクセル] パラメータを設定します 。
6. 例えば、空気泡や樹脂漏出の存在など、樹脂キャストROIにアーティファクトを含まない、滑らかで連続的で固体の運河マスクを作成します。
7. 左側のパネルで スムージング モジュールを使用し、[ スムージング強度] パラメータを 1 または 2 に設定します(個々のデータによっては、値が大きいほどモデルの変形が発生する場合(特に微細な構造を扱う場合)を指定します。必要に応じて、このプロセスを 2 回実行します (図 3C)。
8. セグメント化された樹脂マスク内の個々の管状システムを識別し、分離します。
   1. CT データの強度値が高い、より吸収性樹脂 (共通の胆管注入に使用される黄色の樹脂) を充填したシステムに対して別の ROI を作成します。ステップ 3.2 で説明されている手順に従います。(図 3Di)。
   2. 新しい ROI と樹脂マスク ROI をマークし、右クリックして [ROI を減算(S)]を 選択し、樹脂マスク ROI から新しい ROI を減算して残りの管状システムの新しい ROI を作成します(図 3Dii、iii)。
9. 異なるソフトウェアでの後続処理のために、オペレータの好みに基づいて、両方の管状システムの結果のROIをさまざまな形式でエクスポートします。さらに、結果の ROI をボリューム・グラフィックス・ソフトウェアで処理し、最終的な視覚化をイメージまたはビデオの形式でエクスポートします。

結果

何をすべきか
正常な二重樹脂注入は、両方の肝胆管と門脈脈管が十分に充填されている場合に達成されます。品質管理ステップとして、1つのローブ(例えば、左横葉)をクリアすると、注入に成功し、続いて目的のローブのイメージングが可能になります。光学的にクリアされたローブはmicroCTを使用して後でスキャンすることができます。したがって、肝臓全体を光学的にクリアすることが可能です。よく注入されたマウス肝臓では、肝臓周辺と樹脂が側枝に見えるまで、門脈血管系を樹脂で満たすべきであり(図4)、このアーキテクチャはマイクロCTスキャンおよびセグメント化されたデータで忠実に再現される。さらに、よく注入された肝内胆管は、周辺にほぼ及ぶ主要な門脈枝の隣に見えるようにする必要があり、樹脂は主要な側枝に見える必要があります。制御ローブが品質管理ステップを通過した場合、対象となるローブ(光学的にクリアされたものを含む)はmicroCTでスキャンすることができます。P15マウス(図4A、B)および成人マウス(図4C,D)について、よく注入された肝臓からのセグメント化されたデータの結果が示されている。

やらないこと
インタクト肝臓組織は、注射を成功させるための前提条件です。誤って肝臓組織をニックしないように腹腔と横隔膜を切断するときに余分な注意を払ってください。この処置の間に肝臓に物理的な損傷がある場合、樹脂は、ポータル静脈注射中に漏れ出す可能性が非常に高い(図5A)。肝臓が物理的に損傷を受けている場合、血管系の良好な注射を達成することはできません。

一般的な間違いの1つは、視覚化や分析のための課題につながる可能性のある樹脂で肝臓を不足しています。システム不足の原因の1つは、注射が完了する前に針やチューブの先端で樹脂が早期に硬化することである(図5B、青い矢印、ブラケットは大きな泡を示す)。1つの動物に1つの注入セットを使用し、硬化剤を樹脂に添加した後に速く働くことをお勧めします。注入中に樹脂が硬化した場合(これは半分充填されたシステムで観察され、ここでは半分充填されたポータル静脈血管構造で例示される)チューブを取り除き、チューブの先端を切断し(常に斜めに斜めにして斜めの先端を作成する)、プランジャーを押します。樹脂が再び滴下し始めた場合は、慎重にチューブを挿入し直し、縫合糸で固定します。樹脂が針に固まった場合は、チューブを完全に交換し、樹脂(気泡を避ける)で満たし、チューブを慎重に再挿入し、縫合糸で固定します。組織がより脆弱であるため、特に若い出生後マウス図5C、青い矢印は末端枝に見える血液を示す)。これは、血管の先端が樹脂の代わりに血液で満たされたときに観察することができる。これを避けるために、注射前に門脈(肝臓外)に血液が含まれていないことを確認してください。肝臓の不充満の第3の原因は、チューブが肝臓に深く挿入されすぎて、葉の1つに向かって枝に入る場合である。これを防ぐために、肝臓への入り口から最低0.5cmでチューブを挿入します。

逆に、一方または両方のシステムが樹脂で過剰充填される(図5D)。注射を通して肝臓を視覚的に監視する必要があります。.樹脂を使用した胆道系の鋳造は、樹脂充填ダクトが肝臓表面にかすかに見えるだけなので、ポータルの静脈の樹脂鋳造よりも難しく、システムがほぼ満杯になり、いつ停止するのかどうかを評価することは困難です。小さな黄色の樹脂の点が肝臓表面に現れると(図2Ci、青い矢印)、これは胆道系が完全に充填され、樹脂がダクトから漏れ始めていることを示す。マイナー樹脂漏れは、microCTデータセグメンテーション中に手動で修正することができます(図5D、右パネル)。

射出圧力が高すぎると、血管やダクトが破裂し(図5E)、不可逆的に損傷を与える容器またはダクトアーキテクチャが発生する可能性があります。肝臓はマイクロCTスキャンや分析には適していません.樹脂の過剰充填を避けるには、各マウスモデルでの射出に使用される適切な容積と圧力を最適化します。有毒な食事、遺伝子組み換え、または胆道系や静脈系に影響を与える肝臓損傷、または肝臓の硬直に挑戦されたマウスを扱う場合、注入圧力および量は体積として調整する必要があり、圧力は野生型マウスと異なる場合があります。このプロトコルは、2つのシステムの手動注入を記述しますが、注入圧力を標準化するためにポンプに注射器を接続することが可能です。気泡は、管状ネットワークのまばらな充填につながるもう一つの非常に一般的な注入アーティファクトです(図5F-H、青い矢印)。気泡の形成を避けるために、注射器とチューブに気泡が含まれていないこと、樹脂で完全に充填されていること、そして注入前に樹脂がチューブの先端から滴り落ちることを確認してください。microCTデータ上でマイナスの領域として表示される小さな気泡は、処理後のステップで手動で修正できますが、これは面倒です。

新鮮なのは最高です
新鮮な黄色の樹脂を使用することは重要な要因であり、2つの樹脂のコントラストとmicroCTデータセグメンテーションに大きな影響を与えます。開けたばかりの樹脂を使用する場合(図6A)黄色の樹脂注入胆管(明るい白色)と緑色の樹脂注入門脈(明るい灰色)との対比が明確に異なる。新鮮な樹脂を注入した肝臓は、自動化されたグローバル閾値を使用して簡単に処理されます。長期保存すると樹脂が沈殿し、コントラストが薄くなります。3ヶ月の貯蔵後、コントラストは、まだ胆道(図6B)とポータル静脈を区別するのに十分であり得るが、沈殿は、充填された門脈(図6B、青い矢印の向き)で不均一な不透明度として見える2つの樹脂の混合に影響を与える。異種のコントラストは、自動しきい値に悪影響を及ぼし、手動による修正が必要となり、処理時間が長くなります。樹脂が6ヶ月以上古い場合、コントラストだけでは、黄色注入された胆管と緑注入された門脈を区別できない点まで劣化している(図6C)。この場合、胆管と門脈は、直径とヒラ領域内の位置に基づいて手動でセグメント化され、マイクロCTデータ全体にわたって手動で従う必要があります。この手順は非常に時間がかかり、最善の回避です。

図1:樹脂鋳造用の射出セット (A)注射セット#1は、30Gの針とPE10の長さから30cmのチューブを含む。射出セット#2は、長さ約30cmの23G針とPE50チューブで構成されています。(B) チューブの先端を伸ばして斜め切り、斜めの先端を作成します。AとBの定規はセンチメートル定規で、大きな増分は1cm、中間増分は5mm、マイナーインクリメントは1mmです 。

図2:二重樹脂鋳造フローチャート (A)マウス静脈循環循環系と心臓を示す図表は、灌流前に切り取るべき右心房と、循環系から血液を洗い流すために針を挿入する必要がある左心室を示す。下の大静脈は、血管圧を緩和するために腎臓の下で切断されるべきである。(B) 胆管樹脂注入フローチャート。(i) IVC を切断する場所を示す (A) のズーム画像。(ii) 肝臓ヒラル領域からオディの括約筋(黒矢印)までの共通胆管(黄色の点線)を、クリアされた共通胆管の下に縫合糸を有する画像。(iii) 共通の胆管のまわりの緩いオーバーハンド結び目のための適した位置。(iv)黄色の点線と黒い矢印はオディの括約筋にラベルを付け、切開の斜めの角度と斜めの角度切開後の開口部がどのように現れるかを示す。(v) 挿入時にPE10チューブベベル開口部(上向き)の向きを示す回路図。(vi) 黄色樹脂の注射の外観;樹脂は、ゆるやかに結ばれた結び目を簡単に渡す必要があります。IVC、下の大静脈。CBD、一般的な胆管。(C) ポータル静脈樹脂注入フローチャート。(i) 緑色の点線は、ハイラー領域からのポータル静脈を示します。青い矢印は、過剰充填された胆道システムにラベルを付けます。(ii)ポータル静脈のまわりの緩いオーバーハンド結び目のための適した場所。(iii) 挿入時にベベル開口部(上方)を示す回路図。(iv) 緑色樹脂と黄色樹脂の注射時の肝臓の外観;肝臓周辺の樹脂で満たされた血管に注意してください。PV、ポータル静脈。 図2a は Biorender.com で作成されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ボリュームグラフィックスソフトウェアでのマイクロCTデータ処理. (A)表面決定、(i)過大評価された等価値(現在の選択のプレビューは黄色で示されている)、(ii)過小評価された等値、(iii)ポータル静脈および胆管の適切な表面決定のための等値の最適選択。(B)表面決定によって作成された対象領域(ROI)を分割し、(i)ダイアログウィンドウに1つのセグメント(最大のセグメント)のみが残るほどの高さの値を設定し、(ii)黄色のフレームでは小さい(除外された)粒子が示される。(C)データの表面スムージング、(i)平滑化機能が左側のパネル上にあり、(ii)平滑化強度を1(最大2)に設定し、新しい平滑化ROI、(iii)平滑化データを作成する。(D)個々の管状システムの分離、(i)表面決定関数で、バイリアリー系のみが選択に含まれるように等値を設定し(現在の選択のプレビューは黄色で示されている)、(ii)両方のシステムのROIと両方のシステムのROIを両システムのROIと両システムのROIから減算胆道系ROIにマークし、 (iii)灰色で示される門脈、胆道系は緑色で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:よく注入された胆管(BD)およびポータル静脈(PV)システム.(A)2つの系に2つの樹脂を注入した15日目(P15)の肝臓の右内側葉(RML)を光学的にクリアした。スケールバー 1 mm. (B) (A) に示す P15 RML の 3D レンダリング(A)は、緑の白と胆道系のポータル静脈血管構造を描いた。スケールバー1mm(C)2つのシステムに2つの樹脂を注入した成体肝臓のRMLを光学的にクリアした。(C)に示す大人のRMLのスケールバー1 mm(D)3Dレンダリングは、緑の白と胆道系のポータル静脈構造を描いた。H = ハイラー、P = 周辺。スケールバー1mmパネルA、B、Dは、ハンケオバら9の許可を得て適合^{している。}この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:二重樹脂の肝臓注射の一般的な課題である (A)画像は、腹腔の最初の開口部の間に誤ってニックされた肝臓を示しており、樹脂が切り傷(青い矢印頭)を通して漏れている。(B)樹脂硬化によるポータル静脈システムの注入が不十分。青い矢印は空の端子の枝にラベルを付け、赤い括弧は大きな泡をラベル付けします。スケールバー 1 mm. (C) 心筋灌流が悪いため、ポータル静脈システムが不十分に注入されました。青い矢頭は、末端の枝に見える血液をラベルします。スケールバー 1 mm(D) 樹脂の分離されたボールによって明らかに過剰充填胆道システム。左側のパネルには光学的にクリアされた肝臓が表示され、右側のパネルには 3D microCT レンダリング イメージが表示されます。青い点線の輪郭は、拡大領域を表しています。黒い矢印は、マイクロCTスキャン後の光学クリアリング中に損傷を受けた肝臓の一部にラベルを付けます。スケールバー 1 mm(E) 樹脂注入時の高圧は、青い矢印でマークされたポータル静脈の破裂を引き起こす可能性があります (このパネルの動物は、Jag1H268Q変異を運びます).スケールバー 1 mm. (F) ポータル静脈注入中に樹脂内の泡 (青矢印) および (G) 胆道系注入 (青矢印) ( H) 気泡のマイクロCT スキャン (青い矢印ヘッド) 、不十分に充填された端子枝 (赤いブラケット) および樹脂漏れ (黄色の矢印ヘッド) この 図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

図6:差動樹脂コントラスト(A)開きたばかりの黄色い樹脂は、樹脂注入されたポータル静脈(灰色)と胆管(白)を区別するのに十分なコントラストを生成する。(B)黄色の樹脂の3ヶ月間の貯蔵は、不均一な不透明性をもたらす樹脂の沈殿をもたらす(灰色白い門脈、青い矢印)。(C) 黄色樹脂の長期保存(>6ヶ月)は、門脈(灰色)と胆管(灰色)の間のコントラストを減少させる。スケールバー100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

いくつかの重要なステップは、サンプル調製からCTデバイスのパラメータまで、ダクトの成功を決定します。最良の結果を得るためには、コントラストがよく、十分に注入され、バブルフリーの樹脂を使用して、3Dデータ、画像、およびムービーを取得するために、自動しきい値による簡単なデジタル処理を可能にする必要があります。トレーニングとこのプロトコルに従うと、注射の90%が成功し、再現可能なデータになります。2つの注入システム間の最もよい対比を達成するために、新鮮な黄色の樹脂を使用することが重要です。黄色の樹脂は非常に強い放射性pacityを有し、青色樹脂は検出不能な放射性pa00を有する。トップの結果は、新しい黄色の樹脂ボトルを開けた後、最初の3ヶ月以内に達成されます。時間が経つと樹脂が沈殿し、長期保存(>6ヶ月)後、黄色と緑色の樹脂はCTスキャンで区別できなくなります。コントラストの悪い画像には、2 つのシステムの広範で時間のかかる手動トレースとセグメンテーションが必要です。次に、よく伸ばされたチューブは、成人マウスの共通胆管および出生後マウスの共通胆管および門脈に適合するために不可欠である。注入のエントリ ポイントは注意して作成する必要があります。共通の胆管が横切って切り開かれる場合、周囲の組織から剥離する可能性が高く、チューブの正常な侵入を防ぎます。このステップは、共通の胆管が引き込まれ、周囲の組織から切り離された場合に「カール」する出生後マウスにとって特に繊細であり、チューブの挿入は非常に困難です。一般的な胆管の入り口および注入は、いくつかの練習を必要とするかもしれません.樹脂とのチューブを準備しながら、注入全体, 気泡は、CT画像に負のスペースを作成し、時間のかかる手動補正を必要とするので、バブルの形成を避けます.これは樹脂の広がりを容易にするので、注入手順中と後に濡れた綿棒で表面を転がすことによって肝臓を穏やかにマッサージすることが重要です。注入とチューブの除去が完了した後、シルクの縫合結糸は迅速かつ慎重に締め付ける必要がありますので、樹脂は完全に重合する前に肝臓から流れ出ません。マイクロCTイメージングを成功させるには、サンプルをアガロースで適切に固定し、CTデータ内の動きアーティファクトを排除するために熱的に適合させる必要があります。取得設定も重要な重要なのです, 微細な構造を解決するために適切な空間解像度に到達するために最適化する必要があります.

注射手順の技術的な変更は、若いマウスでの注入を達成するために行うことができます.現在、若いマウス肝臓の樹脂鋳造は、十分に薄いチューブの入手可能性によって制限されており、PE10は市販のチューブの中で最も小さいものである。谷水らは、ガラス毛細血管11を用いて胚性17日目(E17)共通胆管にカーボン^{インクを注入}することに成功した。したがって、ガラスキャピラリーを介して樹脂を送達できるかどうかの将来のテストは興味深いでしょう。さらに、管管は肺9の気道や肺動脈血管系などの他の管状システムを注入するように適応^した。二重樹脂注入はまた、他の市販の樹脂と一緒に使用するように変更することができ、またはこのプロトコルは、カーボンインクを注入するために使用することができます。

ダクトパイプラインの主な制限要因の1つは、樹脂粘度です。ダクトは直径5μm以上の管状構造の樹脂鋳造にのみ使用できます。このデータセットでは、樹脂は5μm9の最小径のチューブを貫通することができました。このサイズ制限は、細かい管と小さな毛細血管の分析を妨げる。さらに小口径の容器にダクトパイプラインを進めるために、他の市販の樹脂をテストする必要があります、または新しい低粘度の放射不透明剤の開発は、ルーメンの浸透を改善することができます。

ハンケオバら9^では、ダクトは他の2つの一般的に使用される技術、二重炭素インク注射、続いて組織クリアリングおよび標準的な写真撮影、およびα平滑筋細胞アクチンと胆管を有する血管をサイトケラチン7で染色したiDISCO+と比較し、続いて3D imaging9を行った。ダクトは、二重分析(高い肝臓自家蛍光のためにiDISCO+にとって困難であった)、3Dイメージング、および定量化(カーボンインク注入では不可能)、および内腔化(ダクトは内部ルーメンアーキテクチャとシステム灌流のデータを提供する)の点で他の2つの方法を上回った。前述のように、ダクトの主な制限は、注入および分析できる最小ルーメンサイズ(5μm限界)であり、カーボンインクインジェクションとiDISCO+の両方が優れたパフォーマンスを発揮したパラメータである。ダクトは、各注入システムの分析を個別に可能にし、また2つのシステム間の建築関係を研究するために二重3D調査を容易にするので、単一システム樹脂鋳造^3,5,6よりも優れています。

ダクトは、3Dで任意の2つの管状ネットワークを研究するために適用することができます。原理の証明として、ダクトは、肝臓胆道および門脈系および肺動脈脈管および肺の気道を可視化するために使用された^。肝内胆管は、門脈静脈に隣接して発達し、ポータル静脈は胆道樹¹²の成長および分化を調節する構造テンプレートおよびシグナリングセンターを提供する。ハンケオバ^ら9章では、ダクトは、ヒト小児疾患アラジール症候群のマウスモデルで胆道再生を検討した。ダクトは、胆道系が野生型のようなボリューム⁹を達成するために使用した以前に報告されていない建築メカニズムを明らかにした。アラギル症候群マウスは、2つの異なる戦略を利用した:(1)肝臓のヒラルおよび中央領域において、胆道系は分岐を増加させ、(2)肝臓周辺では、デノボ生成胆管は非常に激しい。これらの2つの要因は、異常なアーキテクチャにもかかわらず、ほぼ正常な胆道系体積をもたらす組み合わせ。さらに、ダクトは、2つの門脈間の接続橋を形成する門脈分岐および胆管とは無関係に発生した異常な胆管分岐を検出^した9。これらの表現型は、単一の樹脂鋳造では検出不可能であり、2D組織学的セクションでは胆管増殖と誤解される可能性があります。したがって、ダクトは、質的で詳細な定量分析の可能性を持つ全器官またはローブレベルでの2つの管状ネットワークの3Dアーキテクチャを記述するデータを提供する。ダクトは、異なる動物モデルにおける出生後肝発達および肝臓再生分析の新しい基準となり得る。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL SafeSeal マイクロチューブ	Sarstedt	72.706
23 G バタフライ針 チューブ付き	BD バイオサイエンス	367283
23 G 針	BD バイオサイエンス	305892
30 G 針	BD バイオサイエンス	305106
アガロース	トップバイオ	P045
ベンジルアルコール	シグマ アルドリッチ
108006 安息香酸ベンジル	Sigma Aldrich	B6630
Corning 50 mL チューブ	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	ポリプロピレン
綿棒	Medicarier	60406
解剖顕微鏡	ライカカメラ AG		ライカ M60
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック
エタノール 70%	VWR	83801.41
ファルコン チューブ 15 mL	Verkon	331.850.084.006
鉗子湾曲	ファイン サイエンス ツール	11051-10	ファイン グレーフ 10 cm 湾曲
鉗子 ストレート	ファイン サイエンス ツール	11050-10	ファイン グレーフ 10 cm ストレート
ホルムアルデヒド溶液	シグマ アルドリッチ	F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240	Waygate Technologoies		マイクロコンピュータ断層撮影スキャナー
Hanks' Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14025092
Heparin	Leo Pharma	B01AB01	5000 IE/mL
Isolfurane	Baxter	FDG9623
Methanol	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL	Flowtech	MV-122	合成樹脂 黄色
MICROFIL	Flowtech	MV-120	合成樹脂 青色
MICROFIL	Flowtech	MV-希釈剤	透明樹脂希釈剤
パスツールピペット	Verkon	130.690.424.503
蠕動ポンプ	AgnThos	010.6131.M20
フェニックスdatos|x 2.0 software	Baker Hughes		CT data reconstruction software
Rocker	VWR	444-0142
Silk suture	AgnThos	14757	Black silk, 4-0, sterile, 100 m
Skin scissor	Fine Science Tools	14058-09	Iris straight tip 9 cm
Spring scissor	Fine Science Tools	15000-03	Vannas micro, straight tip 2 mm
シリンジ 1 mL ルアー	BD バイオサイエンス	303172
チューブ PE10	BD バイオサイエンス	427401
チューブ PE50	BD バイオサイエンス	427411
VG Studio MAX 3.3 ソフトウェア	ボリュームグラフィックスGmbH		CT データ処理および分析ソフトウェア