このプロトコルは、EB3タンパク質トランスフェクションによる微小管プラスエンドビジュアライゼーションに専念し、一次細胞培養における動的特性を研究しています。このプロトコルは、ハンチントン病患者から得られたヒト原発性皮膚線維芽細胞に実施された。
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方法論記事
ヒト原発性皮膚線維芽細胞に基づくハンチントン病モデルにおける微小管プラスエンドダイナミクスの可視化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
蛍光標識マーカータンパク質とタイムラプスビデオ顕微鏡との組み合わせでのトランスフェクションは、細胞骨格の動的特性を研究する古典的な方法です。このプロトコルは、ヒトの原発性線維芽細胞トランスフェクションの技術を提供し、一次細胞培養条件の詳細のために困難であり得る。さらに、細胞骨格の動的特性の維持は微小管の安定化を引き起こすことなく良好な信号対雑音比を得るためにトランスフェクションの低レベルを必要とします。光によるストレスや蛍光色素の退色から細胞を保護する対策を講じるのが重要です。私たちの研究の過程で、我々は人間の一次線維芽細胞研究に適した条件の最良の組み合わせを選択するために、異なるトランスフェクション方法とプロトコルだけでなく、異なるベクターをテストしました。得られたタイムラプス動画を解析し、ImageJを用いて微小管ダイナミクスを計算した。異なる細胞部分における微小管のプラスエンドのダイナミクスは似ていないので、我々は分析をサブグループ(中心領域、ラメラ、線維芽細胞の尾)に分けました。特に、このプロトコルは、患者のサンプルにおける細胞骨格動態の インビトロ 分析に使用することができ、様々な疾患の発症のダイナミクスを理解するための次のステップを可能にする。
概要
ハンチントン病(HD)は、タンパチンチンタンパク質(HTT)をコードする変異遺伝子によって引き起こされる不治の神経変性病理である。HTT は、主に小胞と微小管に関連しており、おそらく微小管依存輸送プロセス1,2に関与している。微小管ダイナミクスに対する変異HTTの影響を研究するために、成長するプラスエンドを結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節するEB3タンパク質のインビトロビジュアライゼーションを用いた。蛍光標識されたEB3をヒト皮膚線維芽細胞にロードするために、プラスミドトランスフェクションを適用した。この研究では、HD患者の皮膚生検から得られた原発性線維芽細胞培養を用いた。
HTTタンパク質遺伝子の変異は、ポリグルタミン管3の伸びにつながる。HTTは、エンドサイトーシス4、細胞輸送1、2、タンパク質分解5、等のような細胞プロセスにおいて役割を有する。これらのプロセスの大部分は、微小管を含む細胞細胞骨格の様々な要素を含む。
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プロトコル
このプロトコルは、2015年9月8日付の連邦医療生物機関の連邦研究および物理化学医療臨床センターのガイドラインに従っています。
注: 図 1 は、プロトコルの概要を示します。
1. ヒト皮膚線維芽細胞の一次培養を得る(図2)
- 50 μg/mLのペニシリンと50 U/mLのストレプトマイシンを補った、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)培地で、数時間以内に検査室に生検を届けます。
注:皮膚生検は、患者がインフォームド・コンセントに署名した後、医師によって無菌状態で行われなければなりません。 - 生検組織を少量の培地と共に6cmのペトリ皿に入れます。
- 無菌メスを使用して、生検サンプルを約0.5〜1mmの大きさに切ります。1-2で得られた断片を3.5cmのペトリ皿に入れ、生検片の上に無菌カバースリップを置きます。次の組成物に1.5mLの成長培地をゆっくりと加える:DMEM、50 U/mLペニシリンストレプトマイシン、および10%牛血清(FBS)。
- 培養線維芽細胞は、CO2インキュベーター内部の成長培地中で、5%CO2、37°C、80%湿....
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結果
生成された GFP-EB3 ムービーは、プロトコルを使用して生成されます (図 1) マイクロチューブの動的特性を示しています。微小管は異なる細胞プロセスに関与しており、その動的特性は患者の生検材料からの原発ヒト細胞培養の様々な生命特性に影響を与える(図2)。
次のパラメータは、微小管の動的不安定性を決定します: 成長の速度 (重合) と縮小 (脱重合);大惨事の頻度(重合から脱重合への移行);救助の頻度(重合解除から重合への移行);一時停止と同様に - 微小管が重合せず、12を非重合しない状態。すべてのパラメータは厳しく調節されており、個々の微小管の重合率および脱重合率は、同じ細胞タイプ13、14、15、16、17の両方で有意に変動する可能性がある。
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ディスカッション
微小管のダイナミクス解析の品質の向上は、高品質の顕微鏡画像から得ることができます。生きている細胞のタイムラプスイメージングに必要なすべての条件を観察し、イメージングパラメータを正しく調整することが重要です。ガラスはプラスチックとは異なる屈折率を有するため、ガラス底部(共焦点皿)を備えた特殊な細胞培養皿を使用することは重要である。ガラスの厚さと領域全体の均一性も非常に重要です。これらのパラメータの違反は必然的に完璧なフォーカスシステムの障害を引き起こし、その結果、フォーカスが悪くなり、そのような焦点外のビデオを分析に使用することが不可能になります(図5A)。生細胞イメージングのもう一つの重要な条件は、ROSからの保護です。このような目的のために種々の試薬を用いることができる20.私たちの仕事では、大気中から培地を完全に分離し、ガス交換を防ぐ鉱物油を使用しています。同様に、ROS還元オキシラーゼも使用できますが、この酵素はすべての細胞タイプに適しておらず、時間の増加によるイメージングに適しています。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、ロシア連邦の科学と高等教育省によって資金提供されました, 助成金0. 075-15-2019-1669 (線維芽細胞のトランスフェクション), ロシア科学財団によって, 助成金第19-15-00425 (vitroで線維芽細胞の栽培に関するすべての他の作品).これは、ロモノソフモスクワ州立大学開発プログラムPNR5.13(イメージングと分析)によって部分的にサポートされました。著者らは、A.N.ベロゼルスキー物理化学生物学研究所のニコン・センター・オブ・エクセレンスの支援を認めている。エカテリーナ・タランに、声優の支援をしてくれた方に、特別な感謝を申し上げたいと思っています。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | 代替品:ライカ、オリンパス、ツァイス | |
| LUNA-II 自動セルカウント | ロゴス バイオシステム | L40002 | |
| 生涯撮影用顕微鏡インキュベーター | Okolab | 温度コントローラー H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| ガスコントローラー CO2-O2-UNIT-BL | |||
| 対物レンズ CFI プラン Apo Lambda 60x オイル 1.4 (WD 0.13) | ニコン | 代替品:ライカ、オリンパス、ツァイス | |
| 広視野蛍光光学顕微鏡 エクリプス Ti-E | ニコン | 代替品: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | オープンソース画像処理ソフトウェア | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell Culture Dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| 共焦点ディッシュ (ガラスの厚さ 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | 代替品: MatTek |
| 円錐形遠心分離管 | SPL Lifesciences | 50015 | |
| 極低温バイアル | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 トランスフェクション試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | L3000001 | |
| ジメチルスルホキシド | PanEko |  135 | |
| DMEM(ダルベッコの修正イーグルメディア) | PanEko | C420 | |
| DPBS(ダルベッコのリン酸塩溶液) | PanEko | P060 | |
| Fetal wevine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| ゼラチン(ウシの皮膚) | PanEko | 070 | |
| GlutaMAX | Thermo FisherScientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP Kind | gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [エラスムス大学, ロッテルダム] | Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
参考文献
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
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再版と許可
