Method Article

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

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この記事では、熱不活性化に基づくサンプル調製方法を、後分析による分解を回避する内因性ペプチドを保存し、続いて同位体標識とLC-MSを使用した相対定量を行う方法について説明します。

Abstract

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ペプチド性は、生物学的試料中のペプチドの定性的および定量的分析として定義することができる。その主な用途は、疾患または環境ストレスのペプチドバイオマーカーの同定、神経ペプチド、ホルモン、および生理活性細胞内ペプチドの同定、タンパク質加水分解物からの抗菌および栄養補助ペプチドの発見、およびタンパク質分解プロセスを理解する研究で使用することができる。近年のサンプル調製の進歩により、分離法、質量分析技術、およびタンパク質シーケンシングに関連する計算ツールが、同定されたペプチド数およびペプチドドームの増加を特徴付けている。ペプチド学的研究は、細胞内で自然に生成されるペプチドを頻繁に分析します。.ここでは、熱不活性化に基づくサンプル調製プロトコルが記載されており、これはプロテアーゼ活性を排除し、軽度の条件で抽出するので、切断されたペプチド結合が存在しない。また、アミンの還元メチル化による安定同位体標識を用いたペプチドの相対定量も示されている。この標識法は、試薬が市販されており、他に比べて安価で、化学的に安定であり、かつ1回のLC-MSランで最大5個のサンプルの分析を可能にする利点を有する。

Introduction

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「オミクス」科学は、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、代謝物などの分子集合の深い分析によって特徴付けられる。これらの生成された大規模なデータセット(ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、ペプチドミクス、メタボロミクスなど)は生物学に革命をもたらし、生物学的プロセスの高度な理解につながった1.ペプチドミクスという用語は20世紀初頭に導入され始め、一部の著者はプロテオミクス2の分岐と呼んでいます。しかしながら、ペプチド性は、細胞プロセス中に自然に生成されたペプチド含有量を調査すること、ならびにこれらの分子の生物学的活性の特性を調査することが主な関心事である、明確な特殊性を有する3,4。

当初、生理活性ペプチド研究は、エドマン分解および放射性免疫アッセイを通じて神経ペプチドおよびホルモンペプチドに限定された。しかしながら、これらの技術は、高濃度の各ペプチドの単離に応じて、抗体の生成にかかる時間、交差反応性の可能性5以外に、グローバル分析を可能にしない。

ペプチド性分析は、液体クロマトグラフィー結合質量分析(LC-MS)およびゲノム....

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Protocol

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ペプチド抽出および還元メチル化に関する以下の手順は、以前に公表された手順24,25,26,27から適応した。この議定書は、全米動物実験管理評議会(CONCEA)のガイドラインに従い、サンパウロ州立大学バイオサイエンス研究所の動物利用倫理委員会(CEUA)によって承認されました。プロトコルの手順を図 1 に示します。

注:超純水ですべての水溶液を準備します。

1. ペプチド抽出

  1. 細胞培養
    1. 15%の胎児ウシ血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地で、37°Cから5%CO2 以下で15cmの皿でSHSY5Y細胞を培養します。
    2. 各サンプルに2~3枚のプレートを使用します。細胞を100%合流に成長させます。
    3. 意図した治療の後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄する。次に、リン酸緩衝生理食塩液を10mL加え、細胞を掻き取り、15mLチューブに集めます。<....

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Results

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質量分析計で行われたランから得られた結果は、質量分析計ソフトウェアで開くことができる生データファイルに保存されます。MSスペクトルでは、2〜5ラベルの範囲で、使用される標識スキームに従って標識ペプチドを表すピーク基を観察することができる。例えば、 図2では、クロマトグラフィー時間で検出された一対のピークが、同じ実行で2つの異なるサンプルで使用された同位体ラベルが2つだけの実験で表されている。 図 3 は 、LC-MS の実行ごとに 3 と 4 つの異なるラベルを使用して、肯定的な結果の他の可能性を示しています。LC/MSランで4または5のラベルを使用する場合、各ピークの実際の強度値を得るために修正する必要がある異なるタグを持つ標識ペプチドのピークの重複がある可能性があります(図4)。

同位体標識は、図5に示すように、所定のプロテアーゼまたはペプチ.......

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Discussion

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ほとんどのペプチド化研究では、重要なステップの1つは、間違いなく、数分後にプロテアーゼによって生成されるペプチド断片の存在を避けるために慎重に行うべきサンプル調製である。非マイクロ波サンプルから調製された脳抽出物に関する最初の研究では、10-kDaマイクロフィルトレートに存在する多数のタンパク質断片が示された。タンパク質分解によるペプチドスペクトルを避けるためにさまざまなアプローチが記載されている:焦点を合わせたマイクロ波照射動物犠牲6,8、クライオスタット解剖、沸騰抽出buffer31、家庭用型マイクロ波オーブン9,26を使用した組織のポスト犠牲マイクロ波照射.細胞培養およびいくつかの組織の場合、プロテアーゼの不活性化は、80°Cで水を加えることによって直接行うことができる。 しかし、神経組織などの一部のサンプルは、事後変化に対してよ.......

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Disclosures

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競合する財政的利益は存在しない。

Acknowledgements

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ここで説明する技術の開発と使用は、ブラジル国立研究評議会の助成金420811/2018-4(LMC)によってサポートされました。フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(www.fapesp.br)は、2019/16023-6(LMC)、2019/17433-3(LOF)、21/01286-1(MEME)を助成金に与えます。資金提供者は、研究設計、データ収集と分析、出版の決定、または記事の準備に何の役割も持っていませんでした。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 kDa カットオフフィルターMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4、PLGC Ultracel-PL メンブレン、10 kDa
アセトンSigma-Aldrich179124
アセトニトリルSigma-Aldrich1000291000
重炭酸アンモニウムSigma-Aldrich11213
分析カラム (EASY-カラム)EASY-Column(SC200) 10 cm、ID75 & マイクロ;メートル、3、マイクロ;m、C18-A2
エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸Sigma-AldrichE10521MS-222
FluorescamineSigma-AldrichF9015
ムアルデヒド溶液Sigma-Aldrich252549
ホルムアルデヒド-13C、d2、溶液Sigma-Aldrich596388
ホルムアルデヒド-d2solutionSigma-Aldrich492620
ギ酸Sigma-Aldrich33015
ヒュームフードQuimisQ216
塩酸 - HClSigma-Aldrich258148
LoBind-Protein 保持チューブEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosサーモフィッシャーサイエンティフィックLTQ Velos
電子レンジPanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.VERSION 8.5
リン酸緩衝生理食塩水Invitrogen3002錠
プレカラム (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 µメートル、5、マイクロ;m, C18-A1
遠心分離機HermleZ326Kコニカルチューブ用
冷蔵遠心分離機VisionVS15000CFNIIマイクロチューブ用
逆相クリーンアップカラム  (オアシスHLB 1 ccカートリッジ)Waters186000383Oasis HLB 1 cc カートリッジ
ノホウ素添加ナトリウム - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
シアノボ水素化ホウ素ナトリウム - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
リン酸二塩基性ナトリウム Sigma-AldrichS9763注:0.2 M PB= 0.1 Mリン酸緩衝液pH 6.8(26.85 mL Na2HPO3 1M)と0.1 Mリン酸緩衝液pH 6.8(23.15 mL NaH2PO3 1M)から250 mlの水
リン酸ナトリウム 一塩基性Sigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
標準ペプチドProteimaxアミノ酸配列: LTLRTKL
トリエチルアンモニウム緩衝液 - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
トリフルオロ酢酸 - TFASigma-AldrichT6508
超精製水Milli-QDirect-Q 3UV
真空遠心分離機GeneVacMiVac DNA 濃縮器
ウォーターバスCientec266
XcaliburソフトウェアThermoFisher ScientificOPTON-30965
ホル冷蔵 シア

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

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