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方法論記事

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

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DOI:

10.3791/62971

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2021年11月4日

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

この記事について

サマリー

この記事では、熱不活性化に基づくサンプル調製方法を、後分析による分解を回避する内因性ペプチドを保存し、続いて同位体標識とLC-MSを使用した相対定量を行う方法について説明します。

要約

ペプチド性は、生物学的試料中のペプチドの定性的および定量的分析として定義することができる。その主な用途は、疾患または環境ストレスのペプチドバイオマーカーの同定、神経ペプチド、ホルモン、および生理活性細胞内ペプチドの同定、タンパク質加水分解物からの抗菌および栄養補助ペプチドの発見、およびタンパク質分解プロセスを理解する研究で使用することができる。近年のサンプル調製の進歩により、分離法、質量分析技術、およびタンパク質シーケンシングに関連する計算ツールが、同定されたペプチド数およびペプチドドームの増加を特徴付けている。ペプチド学的研究は、細胞内で自然に生成されるペプチドを頻繁に分析します。.ここでは、熱不活性化に基づくサンプル調製プロトコルが記載されており、これはプロテアーゼ活性を排除し、軽度の条件で抽出するので、切断されたペプチド結合が存在しない。また、アミンの還元メチル化による安定同位体標識を用いたペプチドの相対定量も示されている。この標識法は、試薬が市販されており、他に比べて安価で、化学的に安定であり、かつ1回のLC-MSランで最大5個のサンプルの分析を可能にする利点を有する。

概要

「オミクス」科学は、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、代謝物などの分子集合の深い分析によって特徴付けられる。これらの生成された大規模なデータセット(ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、ペプチドミクス、メタボロミクスなど)は生物学に革命をもたらし、生物学的プロセスの高度な理解につながった1.ペプチドミクスという用語は20世紀初頭に導入され始め、一部の著者はプロテオミクス2の分岐と呼んでいます。しかしながら、ペプチド性は、細胞プロセス中に自然に生成されたペプチド含有量を調査すること、ならびにこれらの分子の生物学的活性の特性を調査することが主な関心事である、明確な特殊性を有する3,4。

当初、生理活性ペプチド研究は、エドマン分解および放射性免疫アッセイを通じて神経ペプチドおよびホルモンペプチドに限定された。しかしながら、これらの技術は、高濃度の各ペプチドの単離に応じて、抗体の生成にかかる時間、交差反応性の可能性5以外に、グローバル分析を可能にしない。

ペプチド性分析は、液体クロマトグラフィー結合質量分析(LC-MS)およびゲノムプロジェクトのいくつかの進歩の後にのみ可能となり、プロテオミクス/ペプチドミクス研究のための包括的なデータプールを提供しました6,7。さらに、脳サンプルで神経ペプチドを世界的に分析した最初の研究では、検出がタンパク質の大量分解の影響を受けたことが示されたため、ペプチドームの特定のペプチド抽出プロトコルを確立する必要がありました。これらのペプチド断片の存在は、神経ペプチドシグナルを覆い隠し、生体内でのペプチドドームを表すものではなかった。この問題は、主にマイクロ波照射を用いたプロテアーゼの高速加熱不活性化の適用によって解決され、これらのアーティファクト断片の存在を大幅に減少させ、神経ペプチド断片の同定だけでなく、細胞質、ミトコンドリア、核タンパク質からのペプチドのセットの存在を明らかにした。

これらの方法論的手順は、主にプロテアソームの作用によって生成された数百の細胞内ペプチドが酵母10、ゼブラフィッシュ11、げっ歯類組織12、およびヒトcells13で同定されている、よく知られた神経ペプチドを超えてペプチドを拡大することを可能にした。これらの細胞内ペプチドの数十は、生物学的および薬理学的活性の両方を有することが広範囲に示されている14,15。さらに、これらのペプチドは、疾患バイオマーカーとして使用することができ、おそらく臨床的意義を有する、頭蓋内嚢胞瘤を有する患者からの脳脊髄液において示されるように16。

現在、ペプチド配列の同定に加えて、質量分析を通じて絶対定量と相対定量のデータを得ることが可能である。絶対定量では、生物学的試料中のペプチドレベルは合成標準と比較され、一方、相対的定量では、ペプチドレベルは2つ以上のサンプル間で比較される17。相対定量は、次の方法で実行できます: 1) "ラベルフリー"18;2)生体内代謝標識または3)化学標識。最後の2つは、ペプチド19,20に組み込まれた安定な同位体形態の使用に基づいている。無ラベル分析では、LC-MS18の間にシグナル強度(スペクトルカウント)を考慮してペプチドレベルを推定します。しかし、同位体標識は、ペプチドのより正確な相対レベルを得ることができる。

多くのペプチド研究では、トリメチルアンモニウム・ブチレート(TMAB)標識試薬を化学標識として使用し、さらに最近では、ホルムアルデヒドおよびシアノボロヒドリル酸ナトリウム試薬を有するアミンの還元メチル化(RMA)が使用されている。しかし、TMABラベルは市販されておらず、合成プロセスは非常に面倒です。一方、RMAでは、試薬が市販されており、他のラベルに比べて安価で、手順が簡単に行われ、標識ペプチドが安定している23,24である。

RMAの使用は、ペプチドがホルムアルデヒドと反応することを可能にすることによってシッフ塩基を形成することを含み、続いてシアノボロヒドロヒドを介して還元反応を行う。この反応は、N末端およびリジン側鎖およびモノメチル化N末端プロリン上の遊離アミノ基のジメチル化を引き起こす。プロリン残基がN末端でまれであることが多く、N末端に遊離アミンを有する実質的にすべてのペプチドが2つのメチル基23,24,25で標識される。

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プロトコル

ペプチド抽出および還元メチル化に関する以下の手順は、以前に公表された手順24,25,26,27から適応した。この議定書は、全米動物実験管理評議会(CONCEA)のガイドラインに従い、サンパウロ州立大学バイオサイエンス研究所の動物利用倫理委員会(CEUA)によって承認されました。プロトコルの手順を図 1 に示します。

注:超純水ですべての水溶液を準備します。

1. ペプチド抽出

  1. 細胞培養
    1. 15%の胎児ウシ血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを含むダルベッコの改変イーグル培地で、37°Cから5%CO2 以下で15cmの皿でSHSY5Y細胞を培養します。
    2. 各サンプルに2~3枚のプレートを使用します。細胞を100%合流に成長させます。
    3. 意図した治療の後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄する。次に、リン酸緩衝生理食塩液を10mL加え、細胞を掻き取り、15mLチューブに集めます。
    4. 5分間800 x g で遠心ゲートし、上清を取り除く。ペレットを80°Cの超精製脱イオン水1mLで再懸濁する。
    5. チューブの内容物(細胞性ライセート)を2mLマイクロフュージチューブに移します。
  2. 動物組織(主に神経組織):
    1. 野生型の雄の成人 ダニオ・レリオ (ゼブラフィッシュ)をMS 222(100mg/L)の致死量で麻酔し、すぐに8秒のマイクロ波放射線を受けてペプチダーゼとプロテアーゼを不活性化する。
      注意:家庭用電子レンジを使用できます。8~10sのフルパワーで900Wマイクロ波を使用しました。使用するマイクロ波は、10s以内に>80°Cに脳温度を上げることができる必要があります。サンプル間の加熱の再現性は、組織をマイクロ波内の同じ場所に配置することでも利益を得るであろう。
    2. 熱不活性化後、2 mLマイクロフュージチューブに脳全体を集め、分析まで−80°Cで凍結します。
    3. 80°Cで1mLの超精製脱イオン水で組織試料を再懸濁する。 1 sの30パルス(4Hz)を用いて、プローブで組織を超音波処理します。
      注:肝臓および腎臓組織の場合、20 sの10,000-30,000 rpmで機械的ホモジナイザーを使用してください。筋肉組織の場合は、磁器のるつぼと害虫を使用して液体窒素で組織を粉砕します。以下のステップは、細胞のライセートまたはホモジネート組織について同様である。
  3. 細胞のライゼートまたはホモジネート組織を80°Cで20分間インキュベートします。次に氷の上で10〜30分間冷まします。
  4. 1 mLのサンプル量ごとに1M HClストック溶液10μLを加え、10mMの最終濃度を得ます。20 sの渦を混ぜて混ぜ、さらに氷の上で15分間インキュベートします。
    注:酸性化する前に、高温での酸性化によって引き起こされるペプチド結合を壊さないように、サンプルが完全に冷却されていることを確認してください。
  5. 細胞のリセートまたはホモゲネート組織を4° Cで 15分間遠心分離する。上清を低結合タンパク質マイクロ遠心チューブに集め、-80°Cで保存します。
  6. 2300 x g で水と遠心分離器を 3 分間加えて、限外ろ過装置(10 kDa カットオフ フィルター)を洗浄します。この手順をさらに 2 回繰り返します。
  7. 上清をあらかじめ洗浄した10kDaカットオフフィルターと遠心分離機を4°Cで2,300 x gに50分間、冷蔵庫で再冷蔵庫で入れます。フロースルーは、ペプチド抽出物を表す。
  8. 以下に説明するように、アセトニトリル(ACN)およびトリフルオロ酢酸(TFA)溶液を使用したメーカーの指示に従って、逆相クリーンアップカラムのサンプルを脱塩します。
    1. 1mLのACNを1mLと平衡化します。






















figure-protocol-1

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結果

質量分析計で行われたランから得られた結果は、質量分析計ソフトウェアで開くことができる生データファイルに保存されます。MSスペクトルでは、2〜5ラベルの範囲で、使用される標識スキームに従って標識ペプチドを表すピーク基を観察することができる。例えば、 図2では、クロマトグラフィー時間で検出された一対のピークが、同じ実行で2つの異なるサンプルで使用された同位体ラベルが2つだけの実験で表されている。 図 3 は 、LC-MS の実行ごとに 3 と 4 つの異なるラベルを使用して、肯定的な結果の他の可能性を示しています。LC/MSランで4または5のラベルを使用する場合、各ピークの実際の強度値を得るために修正する必要がある異なるタグを持つ標識ペプチドのピークの重複がある可能性があります(図4)。

同位体標識は、図5に示すように、所定のプロテアーゼまたはペプチ...

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ディスカッション

ほとんどのペプチド化研究では、重要なステップの1つは、間違いなく、数分後にプロテアーゼによって生成されるペプチド断片の存在を避けるために慎重に行うべきサンプル調製である。非マイクロ波サンプルから調製された脳抽出物に関する最初の研究では、10-kDaマイクロフィルトレートに存在する多数のタンパク質断片が示された。タンパク質分解によるペプチドスペクトルを避けるためにさまざまなアプローチが記載されている:焦点を合わせたマイクロ波照射動物犠牲6,8、クライオスタット解剖、沸騰抽出buffer31、家庭用型マイクロ波オーブン9,26を使用した組織のポスト犠牲マイクロ波照射.細胞培養およびいくつかの組織の場合、プロテアーゼの不活性化は、80°Cで水を加えることによって直接行うことができる。 しかし、神経組織などの一部のサンプルは、事後変化に対してよ...

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開示事項

競合する財政的利益は存在しない。

謝辞

ここで説明する技術の開発と使用は、ブラジル国立研究評議会の助成金420811/2018-4(LMC)によってサポートされました。フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(www.fapesp.br)は、2019/16023-6(LMC)、2019/17433-3(LOF)、21/01286-1(MEME)を助成金に与えます。資金提供者は、研究設計、データ収集と分析、出版の決定、または記事の準備に何の役割も持っていませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 kDa カットオフフィルターMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4、PLGC Ultracel-PL メンブレン、10 kDa
アセトンSigma-Aldrich179124
アセトニトリルSigma-Aldrich1000291000
重炭酸アンモニウムSigma-Aldrich11213
分析カラム (EASY-カラム)EASY-Column(SC200) 10 cm、ID75 & マイクロ;メートル、3、マイクロ;m、C18-A2
エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸Sigma-AldrichE10521MS-222
FluorescamineSigma-AldrichF9015
ムアルデヒド溶液Sigma-Aldrich252549
ホルムアルデヒド-13C、d2、溶液Sigma-Aldrich596388
ホルムアルデヒド-d2solutionSigma-Aldrich492620
ギ酸Sigma-Aldrich33015
ヒュームフードQuimisQ216
塩酸 - HClSigma-Aldrich258148
LoBind-Protein 保持チューブEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosサーモフィッシャーサイエンティフィックLTQ Velos
電子レンジPanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.VERSION 8.5
リン酸緩衝生理食塩水Invitrogen3002錠
プレカラム (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 µメートル、5、マイクロ;m, C18-A1
遠心分離機HermleZ326Kコニカルチューブ用
冷蔵遠心分離機VisionVS15000CFNIIマイクロチューブ用
逆相クリーンアップカラム  (オアシスHLB 1 ccカートリッジ)Waters186000383Oasis HLB 1 cc カートリッジ
ノホウ素添加ナトリウム - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
シアノボ水素化ホウ素ナトリウム - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
リン酸二塩基性ナトリウム Sigma-AldrichS9763注:0.2 M PB= 0.1 Mリン酸緩衝液pH 6.8(26.85 mL Na2HPO3 1M)と0.1 Mリン酸緩衝液pH 6.8(23.15 mL NaH2PO3 1M)から250 mlの水
リン酸ナトリウム 一塩基性Sigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
標準ペプチドProteimaxアミノ酸配列: LTLRTKL
トリエチルアンモニウム緩衝液 - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
トリフルオロ酢酸 - TFASigma-AldrichT6508
超精製水Milli-QDirect-Q 3UV
真空遠心分離機GeneVacMiVac DNA 濃縮器
ウォーターバスCientec266
XcaliburソフトウェアThermoFisher ScientificOPTON-30965
ホル冷蔵 シア

参考文献

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