方法論記事

Y-27632を用いた初原ヒト歯肉上皮細胞の単離と培養

5K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/62978

⸱

2021年11月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

この記事について

サマリー

ここでは、従来の方法にロック阻害剤Y-27632を添加することにより、ヒト歯肉上皮細胞の単離および培養のための改変方法を提示する。この方法は、より簡単で、時間のかかるおらず、幹細胞の特性を高め、実験室と臨床用途の両方で、より多くの高電位上皮細胞を産生します。

要約

歯肉組織は歯周組織を保護し、多くの口腔機能において意味のある役割を果たす最初の構造である。歯肉上皮は歯肉組織の重要な構造であり、特に歯周組織の修復および再生において重要である。歯肉上皮細胞の機能を研究することは、口腔欠損の修復や生体物質の適合性の検出など、科学的価値が重要です。ヒト歯肉上皮細胞は高度に分化された角化細胞であるため、その寿命は短く、通過が困難です。これまでのところ、歯肉上皮細胞を単離して培養する方法は2つしかなく、直接外植法と酵素法です。しかし、直接外植法を用いて上皮細胞を得るのに要する時間は長く、酵素法の細胞生存率は低くなる。臨床的には、歯肉組織の獲得は限られているため、安定、効率的、簡便 なインビトロ 分離および培養システムが必要です。我々は、上皮細胞の増殖を選択的に促進することができるRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤であるY-27632を添加することで、従来の酵素的方法を改善した。当社の改変酵素法は、従来の酵素法のステップを簡素化し、上皮細胞の培養効率を高め、直接外植法および酵素法に対して大きな利点を有する。

概要

ヒト歯肉は、歯周組織を保護する第1線防御構造であり、物理的および化学的障壁1であるだけでなく、免疫応答に関与し、免疫バリア2,3を構成する炎症性メディエーターの異なるクラスを分泌する。歯肉上皮は歯周組織の修復および再生に重要な役割を果たす。したがって、歯肉上皮の防御と免疫を研究することは、歯膜炎の発生、診断、および治療を理解する上で非常に重要である。ヒト歯肉組織からの歯肉上皮細胞の単離および培養は、歯肉上皮の研究に必要な第一歩である。このような手順は、組織工学のための種子細胞の生産、歯周関連疾患のインビトロモデル、および歯周欠損を修復するための材料などの基本的な操作を必要とします。

初代歯肉上皮細胞は、vitro4における低い分裂率によって特徴付けられるが、研究者たちは何十年もの間、最適な単離および培養法を探してきた。現在までに、2つの異なる技術、直接外植法および酵素的方法は、一般的に、インビトロ4、5で一次歯肉上皮細胞を得るために実験室で使用されている。この直接外植法は、より低い量の組織標本および単純な単離手順の要件などの利点を有するが、汚染5に対する培養時間および感受性が長いという欠点を有する。酵素法は必要な培養時間を短縮するが、効率は比較的低く、使用する酵素や培地によって異なる。Kedjaruneら 6は、サブカルチャー(2週間)前により多くの時間を要する直接外植法が、酵素法と比較して歯肉上皮細胞の培養に成功したように見えることを示した。しかし、これら2つの方法を比較すると、Klingbeilら7は、酵素法が経口上皮細胞の一次培養に最良の結果を有し、最短時間(11.9日対14.2日)以内に最適な細胞収量を得ることが可能であることを発見した。

したがって、口腔上皮細胞4の単離および培養に対して、より便利で効果的な方法を開発することが重要であった。我々は、以前、Y-27632、Rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)の阻害剤を添加すると、成人の皮膚組織8、9、10からのヒト初表皮細胞およびケラチノサイトの単離手順を簡素化することを報告した。我々は、表皮を皮膚細胞から自然に分離し、初発表皮細胞8,9,10の増殖と収率を支える新しい調整接種培地であるG培地を開発した。本研究では、G培地とY-27632を組み合わせることにより、歯肉上皮細胞の新しい無血清分離および培養技術を開発した。本質的に、我々の方法は従来の2段階の酵素法の単純化に基づいているので、我々は新しい方法を直接外植法と比較した。この修飾酵素法は、歯肉の上皮細胞を歯肉組織から分離するのに必要な時間を大幅に短縮し、歯肉上皮細胞の培養の効率を高める。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

このプロトコルで使用されるヒト組織は、本学の人間研究倫理委員会のガイドラインに従って、顎顔面外科の影響を受けた歯の抽出から廃棄された新鮮な成人の歯肉組織である(プロトコルNo.GR201711、日付:02-27-2017)。

1. 準備

  1. 10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mLチューブに新鮮な成人歯肉組織を採取し、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を3%補充し、組織を4°Cに保ちます。
    注:切除後24時間以内に、以下の詳細として組織を扱ってください。

2. 試薬・培養培地の準備

  1. 洗浄液を調製する:3%P/S.50mLのペニシリン(100 U/mL)と1.5mLのストレプトマイシン(100mg/L)をPBSに混ぜます。
  2. 500 mLの成長因子含有培地(G培地と呼ばれる):1%P/S、2%B27サプリメント、20 ng/mLの表皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)の40 ng/mL、および40 μg/mLのファンギゾンを含むDMEM/F12(3:1)培地。
  3. 新しい方法のための酵素消化液を準備する:DMEMの50 mLでディスパーゼ粉末の125mgと125mgのタイプコラゲローゼパウダーを溶解します。
    注:0.22 μmのストレーナーを通してすべての酵素溶液をフィルターし、4°Cで保管してください。
  4. 酵素消化を中和するために培地の500 mLを調製する:10%胎児ウシ血清(FBS)と1%P/S DMEM培地でP/S。

3. 直接出動方法

  1. 歯肉組織前処理
    1. 歯肉組織を5 mLの75%エタノールで30s洗浄します。次いで、洗浄液の5mL(ステップ2.1)で5分間2回リンスする。
      メモ:直径50mmの細胞培養皿ですべての洗い物を行います。
  2. 歯肉上皮細胞培養
    1. 歯肉組織を1mm3 に切り、100mmの細胞培養皿に散散らす。切断操作には、細かい尖った鉗子と眼科用ハサミを使用してください。
    2. G培地(ステップ2.2)を培養皿に加えます。次いで、培養皿を37°Cで5%CO2 インキュベーターでインキュベートする。 24時間ごとに組織を調べるには、反転顕微鏡(40倍)を使用してください。
    3. 上皮細胞が組織片の周りの直径2〜5mmに伝播した場合、歯肉組織片を取り除きます。G-培地を2~4日ごとに変更します。

4. 新しい変更された酵素的方法

  1. 歯肉組織前処理
    1. このためには、直接出動法のステップ 3.1.1 に記載されているのと同じ手順に従います。
  2. 歯肉組織の消化
    1. 歯肉組織を2つの滅菌ブレードで約<1mmの小さな部分に切ります。2つの外科用ブレードで細断するプロセスを繰り返します。
    2. 歯肉組織片を含む1.5mL遠心分離機チューブに2.5mg/mLジスパーゼ+コラゲナーゼ溶液1 mLを加え、37°Cでインキュベーターで15〜20分間チューブをインキュベートします。
    3. 組織が透明で凝集すると、1 mLの中和溶液を加え、消化を終了する。10~15回上下にピペットを入れ、溶液を完全に混合します。100 μm メッシュフィルターを通して、ソリューションを渡します。
    4. 200 x g で 5 分間遠心分離機。
    5. 上清を取り除き、成長因子含有培地の10mLで底部の細胞ペレットを再懸濁する(ステップ2.2)。細胞懸濁液を100mmの細胞培養皿に移す。細胞培養皿にY-27632の10μMを加えます。
    6. 5%CO2インキュベーターで37°Cで細胞を培養する。古いG培地を2日ごとに新鮮なG培地に交換してください。1日目と3日目にセルを観察します。

5. 細胞の通過

  1. インキュベーターから皿を取り出し、使用済み培地を取り出し、PBSで2回洗浄します。100mmの皿ごとに0.05%トリプシンを2mL加えます。
    注:トリプシン溶液と皿底の間に十分な接触があることを確認するために皿を振ります。
  2. 消化プロセスのために37 °Cで5分前後のインキュベーターに皿を残します。
  3. 顕微鏡(40x)を使用して細胞を調べ、ほとんどの細胞が皿の底から分離していることを確認します。
  4. 2 mLの中和液を加え、消化を停止し、細胞を15 mLチューブに移します。ピペットは10-15回上下します。200 x g で細胞を 5 分間遠心分離します。
  5. 上清をゆっくり取り出します。G培地10mLで細胞を再懸濁し、細胞数をカウントします。
  6. G培地10mLに約1 x 106 細胞、10μM Y-27632を100mm皿に加えます。
  7. G-MediumとY-27632を2日ごとに更新します。1 日目と 5 日目のセルを表示します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図1 は、直接外植法及び改変酵素法の概略図を示す。直接の外植法は、全体のプロセス中に任意の消化酵素を必要としません。対照的に、伝統的な酵素法は通常、消化酵素の2組、ディスパスおよびコラゲアーゼを必要とし、下層の線維芽細胞層から上皮シートを分離し、次にトリプシンを使用して上皮細胞を懸濁液に放出する。我々の新しい方法は分離のステップを省略し、単純化された酵素的方法である。さらに、Y-27632をG培地に添加すると、上皮細胞増殖が効果的に促進される。直接外植法は、通常、歯肉上皮細胞が十分に増殖して十分に増殖し、容易に汚染されるのに約2週間かかる。しかし、新しい方法で得られる歯肉上皮細胞の数は、直接外植法で得られるものより有意に多く、合格の要件を満たすのに平均8日しかかかりません。

figure-results-1

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

歯肉組織は歯周の完全性と健康を維持する重要な構造です。歯肉上皮細胞は歯周組織の修復および再生に重要な役割を有し、経口生物学、薬理学、毒物学、および口腔粘膜欠乏症を含む科学的研究および臨床応用および関連分野で使用することができる18。したがって、経口上皮細胞19を収穫するために安定かつ効率的な方法を開発する必要がある。初代上皮細胞は、少ない通路と短い寿命を持つ完全に分化した細胞の一種です。上皮細胞の培養は、線維芽細胞の培養よりも複雑であることが証明されている5.

現在、出版された文献は、上皮細胞の単離および培養のために様々なプロトコルが存在することを示している。しかしながら、直接外植法と酵素法の2つの方法が、これらのプロトコルの中で最も頻繁に使用される。1910年、キャレルとバローズはまず、直接外植法20と呼ばれる歯肉および頬上皮細胞を得る方法を説明した。直接外植法は、組織標本に対する低体重要件...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

すべての著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、山東省自然科学財団(ZR2019ZD36)の主要プログラムと山東省の主要研究開発プログラム(2019GSF108107)からX.W.に支援されました。山東省の主要研究開発プログラム(2018GSF118240)からJ.G.へ山東省医療・健康科学技術開発プロジェクト(2018WS163)からZ.Xへ、山東省医療・健康科学技術開発プロジェクト(2019WS045)からJ.S.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
名前の略語&コメント
Countess automated cell counterShanghai Ruiyu Bio-science&テクノロジー Co.Ltd。BBA0218AC自動細胞計数
CO2インキュベーターThermo Scientific51026333細胞インキュベーション用
Sorvall ST 16R 遠心分離機Thermo Scientific75004380細胞
遠心分離機 細胞培養ディッシュエッペンドルフ30702115細胞培養用
50ml 遠心チューブキルゲン171003細胞遠心分離用
1.5 ml 微量遠心チューブKIRGEN190691J細胞消化用
細胞ストレーナーコーニング 431792組み込まれ細胞ろ過
リン酸緩衝液Solarbio Life ScienceP1020-500洗浄液
DMEMThermo ScientificC11995500中和媒体の成分
定義された K-SFM寿命技術10785-012歯肉上皮  細胞培養培地
ペニシリン ストレプトマイシンサーモサイエンティフィック15140-122抗生物質
ウシ胎児血清生物産業04-001-1AC5中和培地の成分
0.05% トリプシンライフテクノロジーズ 25300-062HGGEPCs解離
希釈培地用Life Technologies50-9701コーティングマトリックス
DispaseGibco17105-041HGGEPCs分離
コラゲナーゼI型Life Technologies17100-017HGGEPCs分離
F12栄養ミックス、ハムLife Technologies31765035G-medium
B27サプリメントの成分 Life Technologies17504044G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595G-medium
Y-27632遺伝子のIAD1011ROCK阻害剤
菌類ゾーンGibco15290026G-medium
EGF組換えヒトタンパク質の調製 GibcoPHG0311G-medium
Cell Counting Kit-8の成長因子同人堂 モレキュラーテクノロジーCK04細胞増殖アッセイ
ウサギ抗ヒト CK18Abcamab82254HGGEPCの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用
ウサギ抗ヒトサイトケラチン10Abcamab76318HGGEPCの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用
抗ヒトビメンチン細胞シグナル伝達技術3390歯肉線維芽細胞の免疫蛍光染色用
Rabbit Anti-Human pan-ckBD550951分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用
Abcam15580
の分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用HGGEPCの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用
ウサギ抗p75NGFRAbcamab52987HGGEPCの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用
た 増殖因子 操作 ズ 用 マウス HGGEPCs rabbit anti-Ki67の HGGEPCs rabbit anti-p63 Biolegend 619002

参考文献

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

ROCK

関連記事