フロー強化超音波による眼の深部血管イメージング

サマリー

我々は、造影剤を使用せずに眼内に3次元血管造影を生成するための非侵襲的超音波技術を提示する。

要約

眼内の網膜は、体内で最もエネルギーを要求する組織の1つであり、したがって、豊富な血液供給からの酸素送達の高い速度を必要とする。脈絡膜の毛細血管薄層は網膜の外表面に並び、ほとんどの脊椎動物の網膜で支配的な酸素源です。しかし、この血管床は、光吸収性の高い網膜の背後に位置しているため、従来の光学技術では画像化が困難です。ここでは、眼の深部血管床(0.5〜3cm)を高い時空間分解能で画像化するための、その後の流れ増強を伴う高周波超音波技術について説明する。この非侵襲的方法は、有核赤血球を有する種(非哺乳動物および胎児動物モデル)において良好に機能する。造影剤を使用せずに非侵襲的な3次元血管造影の生成を可能にし、ドップラーベースの超音波イメージング技術よりも高感度で血流角度に依存しない。

概要

脊椎動物の網膜上の高い代謝は、2つの対照的なニーズの間に固有のトレードオフを課す。高い血流量と血管のない光路。赤血球の灌流の視覚的障害を避けるために、すべての脊椎動物の網膜は、光受容体の後ろの毛細血管のシートを介して酸素と栄養素を受け取ります^1,2,3。しかし、この栄養素と酸素の単一の供給源は網膜の厚さに拡散制限を課す^4,5ので、多くの視覚的に活性な種は、この代謝的に活性な器官に追加の血液供給を提供するために、様々な精巧な血管網を有する⁶。これらの血管床には、哺乳類および一部の魚類の網膜層を灌流する血管4、⁷、⁸、⁹、10、多くの魚類、爬虫類、および鳥類に見られる網膜の内側(光向き)側の血管^4、11、¹²、¹³、および魚類脈絡膜の向流血管配置^、脈絡膜reteミラビレは、超大気酸素分圧14、15、¹⁶、¹⁷、^18、19、20の生成を可能にする。網膜栄養供給のためのこれらの追加の非脈絡膜経路は、優れた視力の代謝要求に燃料を供給する上で不可欠な役割を果たす^{にもかかわらず4}、これらの血管構造の三次元解剖学は十分に理解されておらず、脊椎動物の眼の形態学的進化に関する我々の理解を制限する。

伝統的に、網膜血液供給は、眼底眼科検査などの光学的技術を用いて研究されてきた。このカテゴリーの技術は、非脈絡膜血管解剖学に関するハイスループットの非破壊的情報を高解像度で提供し²¹、したがって網膜血管構造の異常の臨床診断に容易に使用される²²。しかしながら、網膜色素上皮は透過光を吸収し、これらの光学技術における視野の深さを制限し、造影剤²¹を使用せずに脈絡膜構造および機能に関する減少した情報を提供する。同様の深さの制限は、光干渉断層撮影法(OCT)でも経験される。この技術は、深度透過の技術的犠牲を払って光波を用いて高解像度眼底血管造影を生成することができ²³、一方、強化された深度イメージングOCTは、網膜イメージング品質を犠牲にして脈絡膜を視覚化することができる²⁴。磁気共鳴イメージングは、眼科検査とOCTの光学的限界を克服し、低解像度ではあるが網膜の血管層をマッピングすることができる²⁵。組織学およびマイクロコンピュータ断層撮影法(μCT)は、光学技術の高分解能を維持し、全眼血管形態に関する情報を提供する⁴が、どちらの技術も眼のサンプリングを必要とするため、診療所や希少種または絶滅危惧種では不可能である。これらの確立された網膜画像化技術の限界のいくつかを克服するために、ここでの研究は、胚および心血管イメージングのために以前に説明したような類似の技術を適用することによって、眼全体にまたがる一連の等間隔の2次元超音波スキャン上で血液運動がインシリコでマッピングされる麻酔動物に関する超音波プロトコルを提示する^{26,27。28および}OCT血管造影²⁹。このアプローチは、造影剤を使用せずに非侵襲的な3次元深眼血管造影の生成を可能にし、種間の眼内の血流分布をマッピングするための新しい道を開く。

プロトコル

以下の議定書は、デンマーク食品農業水産省、デンマーク獣医食品局(許可番号2016-15-0201-00835)内のデンマーク動物実験検査官の許可を得て実施されました。

1.麻酔および超音波媒体

1. 研究動物を麻酔する。
   注:適切な麻酔の種類および用量は、種に大きく依存する。一般に、MS-222(3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸)、ベンゾカイン(4-アミノ安息香酸エチル)、およびプロポフォール(2,6-ジイソプロピルフェノール)などの浸漬ベースの麻酔薬は、えらまたは皮膚(例えば、0.ニジマスの^L-1ベンゾカイン)。静脈内、筋肉内、腹腔内に投与することができる溶解化合物の範囲は、ガスベースの麻酔薬と同様に羊膜炎のために利用可能である。筋肉内投与のアルファクサロンは爬虫類(例えば、トカゲでは30mg・^kg-1)に有用であり、ガスとして投与されるイソフルランは鳥類に有用である(例えば、ハトの場合は空気中で2%)。種を超えて利用可能な麻酔薬の完全な概要については、出版された文献^30,31,32を参照してください。
2. 最適なレベルの麻酔を確認するために動物の反射神経を試験する。流量増強超音波手順は動きの騒音に敏感であるため、手順中に動物が完全に動かないことを確認してください。
   1. 深すぎる麻酔は血流パターンを変化させる可能性があるため、実験の開始段階で用量滴定を行います。
   2. 段階的に麻酔剤の投与量を増やし、単純な明るさモード(Bモード)超音波によって支援された目の血流を観察します。
      注:最適なレベルの麻酔は、動物が目に見える眼血流で動かない(呼吸を除く)ときに得られます。
3. 麻酔薬の種類/用量が呼吸運動に許容されない場合は、例えば、水生種の水に酸素を供給するためにエアポンプを使用するか、空気呼吸種のために換気装置を使用するなど、動物の適切な換気を確保してください。
4. 上から目に直接アクセスできる姿勢で動物を置きます。
   注:種に応じて、これは仰臥位または横方向の位置のいずれかにすることができます。非反応性金属(ステンレス鋼など)の小さな部分と緩いゴムバンド( 図1参照)を使用して簡単な保持装置を構築すると便利です。
5. 動物の目に適切な超音波媒体を置きます。鱗片状のまぶた(超音波不透過性)が目を覆う場合は、綿棒で静かに置き換えます。
   注:水生種の場合、最高の超音波媒体は、動物が通常住んでいるきれいなタンク水です。陸生種の場合、大量の超音波ゲルは、眼の表面全体にわたって超音波トランスデューサ(すなわち、リニアアレイプローブ)の自由な動きおよび画像化を保証する。対側眼の獣医軟膏は陸生種に必要です。

2. 2Dおよび3D眼超音波画像取得

1. 超音波探触子の内側を、所望の画像の向きに応じて、背側/腹側または吻側/尾側のいずれかの向きで眼に位置決めします。
2. Bモードでは、被写界深度が最大で、目の内側と最も深い部分を撮像し、関心のあるすべての構造が画像フィールドに見えることを確認します。
   注:いくつかの種では、水晶体は硝子体ユーモアの比較的大きな割合を占め、特により高い周波数で超音波を吸収する可能性がある。
3. リアルタイム画像を検査しながら、探触子をゆっくりと両側に移動します。関心のあるすべての構造が画像フィールドに表示されていることを確認します。そうでない場合は、周波数が低く被写界深度が大きい探触子に切り替えます。
   メモ: 次の中心周波数では、21 MHz: 3 cm、40 MHz: 1.5 cm、50 MHz: 1 cm の最大被写界深度を使用できます( 表 1 を参照)。しかしながら、これらの最大被写界深度値は、眼が石灰化または他の超音波不透過性構造を含む場合、著しく低くなり得る。
4. 画像深度、深度オフセット(画像の上部から目的の構造までの距離)、画像幅、ならびに焦点ゾーンの数および位置を、3つの空間寸法(例えば、 1cm画像深度、2mm深度オフセット、1cm画像幅、1焦点ゾーン)のすべてにおいて所望の関心領域をカバーするように調整する。
   メモ:これらのパラメータを調整するボタンの具体的な名前は超音波システムによって異なる場合がありますが、ほとんどのシステムにはこれらの調整の論理的な名前のボタンがあります。これらの画像パラメータ設定は、通常、超音波取得の可能な時間分解能の範囲に影響を及ぼす。
5. フレームレートを50~120フレーム・^s-1の範囲で設定します。
   注:時間分解能(すなわち、連続するBスキャン間の時間間隔)は、画像化された血管において大きなピクセル強度変動性を示すのに十分でなければならない、すなわち、時間分解能が高すぎてはならない。一方、妥当な時間内に眼のフル3D記録を完了するには、時間分解能を低くしすぎることはできません。50-120フレーム・^s-1 の範囲の時間分解能は、通常、ほとんどの種における流れ増強手順には十分である。いくつかの超音波システムでは、この所望の時間分解能は、「一般画像」(高空間/低時間分解能)および「心臓病」(低空間/高時間分解能)モードを切り替えることによって得ることができる。
6. 2Dゲインをレベル(~5dB)に調整して、解剖学的構造がBモード集録でのみ見えるようにして、その後の流量強化再構成で信号対雑音比を増加させます。
7. 1つのスライス位置で2Dフロー強調画像を取得するには、探触子をこの位置に平行移動し、ステップ3.1に進みます。
8. 関心領域全体、例えば網膜の3D記録を取得するには、トランスデューサを関心領域の1つの極端に変換します。
   1. 関心領域の極端の正確な位置を決定するには、2D ゲインを短く増やします。
   2. 探触子の正しい配置が完了したら、記録前に2Dゲインを下げて、その後の流量増強再構成で信号対雑音比を最大にします。
9. 3D録画の各ステップ(スライス)について、≥100フレーム(最適には≥1000フレーム)を取得します。
10. マイクロマニピュレータまたは内蔵トランスデューサモータを使用して、関心領域全体にわたってトランスデューサを25μmまたは50μmなどのステップで変換し(ステップサイズに注意してください)、各ステップに対して≥100フレームの取得を繰り返します。
11. 研究動物は、施設の動物ケアガイドラインに従って安楽死させる。

3. フロー強調画像再構成

1. デジタルイメージングと医学のコミュニケーション(DICOM)ファイル形式(リトルエンディアン)に記録をエクスポートします。
2. ≥100 フレーム (T) のシネ録画に基づいて単一のフロー強調画像を生成するには、次の式を使用してピクセル レベル (STD(x,y)) の標準偏差を計算します。
   
   ここで_、It(x,y) は時刻 t における (x,y) ピクセル座標におけるピクセルの強度であり、_Īt(x,y) は時間の経過に伴う I の算術平均値です。
3. 3D 記録の各スライスについて、手順 3.2 を繰り返します。
4. 3D記録の複数スライスのSTD計算と画像再構成プロセスを自動化するには、ImageJや補足マクロスクリプト(補足ファイル1)などを使用して、この操作をバッチモードで実行します。
5. 再構築されたすべてのスライスを 1 つのイメージ スタックに結合します (ImageJ の [イメージからスタックへ] コマンド)。
6. 取得時に使用したステップサイズからスライスの厚さを指定します(ImageJの[プロパティ] コマンド)。
7. イメージ スタックを 3D TIF ファイルとして保存します。
   注:眼血管のフロー加重3次元記録は、その後、ボリュームレンダリングを作成し、眼の血管構造のデジタルおよび物理解剖学的モデルを構築するために使用することができる。これらの画像処理オプションは、このプロトコルの範囲外です。詳細については、以前に公開された記事^{33,34,35を参照してください}。

結果

眼の血管床を画像化する流れ増強超音波技術は、種の範囲に適用することができ、現在、46の異なる脊椎動物種で使用されている(図1、表1)。非成体哺乳類脊椎動物における有核赤血球の存在は、シネ記録における静的組織と比較して、流れる血液の正のコントラストを提供する(補足ファイル2)。しかし、フレームごとに分析すると、血液と周囲の組織との明確な区別はそれほど明確ではありません(図2A)。このプロトコルで説明されている血流増強手順は、基本的に、2D空間(Tフレームで作られたスライス)でのマルチタイムポイント記録を単一の画像にコンパイルし、流れる血液に位置するピクセル単位の固有の信号値変動が周囲の静的組織よりも高い標準偏差をスコアリングし、したがって正のコントラストを生成する(図2B)。血管のコントラストを知覚的に高めるために、ルックアップテーブルを使用して疑似カラー画像を生成することがで...

ディスカッション

流れ増強超音波を用いた血管画像化は、現在の技術よりもいくつかの利点を提供するが、その本質的な限界を有する眼の血管系の非侵襲的画像化のための新しい方法を提供する。流れ増強超音波の主な利点は、網膜色素上皮を超える被写界深度を有する眼血管造影を生成する能力であり、これは光学技術における被写界深度を制限する。超音波イメージングでは、空間分解能と被写界深度は最終的に超音波トランスデューサ周波数によって決定され、周波数が高いほど空間分解能は向上しますが、被写界深度が浅くなるため、トランスデューサ周波数の選択は画像深度と空間分解能の間にトレードオフをもたらします。私たちの経験では、画像深度が1cmの小さな目には高周波超音波トランスデューサ(≥50MHz)を使用し<、画像深度1.5〜3.0cmの大きな目には低周波トランスデューサ(20〜40MHz)を使用して、最適な網膜超音波イメージングが達成されます。3D超音波スキャンの場合、追加のスライス寸法の解像度は、2D超音波スキャンのスタック内のスキャン間のステップサイズによって設定されます。私たちの経験では、20μm未満のステップサイズで3Dスキャンを行うことは困難です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MS-222	Σ	E10521-50G
ベンゾカイン	Σ	E-1501
プロポフォール	B Braun	12260470_0320
Alfaxalon	Jurox	NA
Isoflurane	Zoetis	50019100
超音波スキャナー	VisualSonics	Vevo 2100