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方法論記事

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

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DOI：

10.3791/62987

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2021年12月11日

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1Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 4Department of Pathological Anatomy, North-Western State Medical University, 5Department of Biology, Lomonosov State University

この記事について

サマリー

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。

要約

iPSC由来の脳オルガノイドは、イン ビトロで 神経系の病理と薬物スクリーニングをモデル化するための有望な技術です。この技術は最近登場しました。それはまだ初期段階にあり、まだ未解決のいくつかの制限があります。現在のプロトコルは、オルガノイドを得ることを薬物発見および前臨床試験のために十分に一貫することを可能にしていない。オルガノイドの成熟には最大1年かかる可能性が高く、研究者は複数の分化プロセスを同時に開始する。それはスペースおよび装置の点で実験室のための付加的な費用を課す。さらに、脳オルガノイドは、多くの場合、栄養と酸素欠乏症に苦しむ中心に壊死領域を持っています。したがって、ほとんどの現行プロトコルは、栄養を改善するために培養培地の循環系を使用する。

一方、オルガノイド栽培のための安価な動的システムやバイオリアクターはありません。本論文では、小型で安価な自家製ミニバイオリアクターで脳オルガノイドを製造するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、大量に高品質のオルガノイドを得ることができます。

概要

ヒトiPSC由来モデルは、神経発達および神経変性疾患の研究に広く使用されている。過去10年間で、3D脳組織モデル、いわゆる脳オルガノイドは、本質的に伝統的な2Dニューロン培養2を補完した。オルガノイドはある程度胚性脳の3Dアーキテクチャを再現し、より正確なモデリングを可能にする。大脳皮質3、4、5、小脳6、中脳、前脳、視床下部7、8、9、海馬10の異なる脳領域を表すオルガノイドの生成のために多くのプロトコルが公開されています。ヒト神経系疾患11を研究するためにオルガノイドを使用する複数の例がある。また、オルガノイドは、薬物発見12に実施され、感染症の研究に使用され、SARS-Cov-213,14を含む。

脳オルガノイドは直径数ミリメートルまで達することができます。だから、オルガノイドの内領域は、低酸素症や栄養失調に苦しみ、最終的に壊死的になることがあります。したがって、多くのプロトコルは、特殊なバイオリアクター8、シェーカー、またはマイクロ流体システム15を含む。これらの装置は、大量の高価な細胞培養培地を必要とするかもしれない。また、このような機器のコストは通常高いです。一部のバイオリアクターは、再利用のために殺菌することが困難になる多くの機械的な部品で構成されています。

ほとんどのプロトコルは、同一のiPSCから得られたオルガノイド間で有意な変動性を生み出す「バッチ効果」16に苦しんでいる。この変動は、薬物検査または均一性を必要とする前臨床試験を妨げる。オルガノイドの収率が高いため、均一なサイズのオルガノイドを選択できるほど、部分的にこの問題を解決できる。

時間係数も重大な問題です。松井ら(2018)は、脳オルガノイドが成熟17に達するまでに少なくとも6ヶ月を要することを示した。Trujilloら(2019)はまた、6ヶ月の培養18の後にのみオルガノイドで電気生理活性が起こったことを実証した。オルガノイド成熟時間が長いため、研究者はしばしば前の分化を完了する前に新しい分化を開始します。分化の複数の並列プロセスには、追加の費用、設備、および実験室スペースが必要です。

我々は最近、主に19上記の問題を解決するミニバイオリアクターを開発しました。この自家製バイオリアクターは、中央にプラスチックノブを備えた超低接着または未処理のペトリ皿で構成されています。このプラスチックノブは、シェーカーの回転によって引き起こされるペトリ皿の中央にオルガノイドとその凝集の混雑を防ぎます。この安価でシンプルな自家製ミニバイオリアクターが、高品質の脳オルガノイドを大量に生成する方法について説明します。

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プロトコル

メモ:手順1.2と1.3を除いて、プロトコル全体で無菌技術を使用してください。細胞またはオルガノイドに塗布する前に、すべての培養培地と溶液を37°Cに温めます。CO2インキュベーターで、湿度80%で5%CO2で37°Cで細胞を培養します。プロトコル スキームを図1に示します。

1. ペトリ皿をミニバイオリアクターに変える

  1. 高さ7-8ミリメートルのリングで滅菌15 mL遠心分離チューブをカット;リングをオートクレーブします。
  2. 低接着、未処理または微生物学的なペトリ皿をパン粉に分解します。10mLのクロロホルムに約1gのプラスチックパン粉を一晩溶かし、液体プラスチックを調製する。
    注意:ヒュームフードで作業してください。
  3. 得られた液体プラスチックがピペット処理に十分な粘性であることを確認してください。その落下は球形を保持し、表面に広がりません。それは非常に液体である場合は、より多くのプラスチックパン粉を追加します。厚い場合はクロロホルムを加えます。
  4. 無菌超低接着6cmペトリ皿の中央にプラスチックノブを作ります。以下に詳しく説明する 2 つの適切な方法があります。
    1. オートクレーブプラスチックリングを中央に置き、液体プラスチックをリングの内側に落とします。
    2. プラスチック製のリングがない場合は、ペトリ皿の中央に液体プラスチックを落とします。
  5. 乾燥するまで、皿流フードで2〜3時間開いたままにしておきます。乾燥した食器を15~20分間紫外線で処理します。

2. iPSCの神経分化誘導

  1. 細胞外タンパク質からなるマトリックスをあらかじめコーティングした35mmペトリ皿で、最大75~90%の合流度合流を可能にする多能性幹細胞用培地でiPSCを培養します。
  2. 中程度のA-SRを準備します。詳細については 、表 1 を参照してください。
  3. 培養培地を吸引し、0日目の分化時にA-SR培地の2mLを加える。
  4. メディア A を準備します ( 表 2 を参照)。
  5. 2~14日目から2週間、1日おきにペトリ料理で培地をリフレッシュし、培地Aで細胞を培養します。

3. 14日目の神経上皮前駆細胞からのスフェロイドの形成

  1. 14日目に、各ウェルに約1,200のマイクロウェルを含む特別な24ウェル培養プレートを用いて神経上皮前駆細胞からスフェロイドを作る(図2C)。以下の手順に従ってください。
    注:この分化段階では、35 mmのペトリ皿は通常3-3.5 x 106 神経上皮前駆細胞を含む。したがって、神経上皮前駆細胞を有する1つの35mmペトリ皿は、マイクロウェルを有する24ウェル培養プレートの3〜4ウェルで十分である。
  2. マイクロウェル付きの24ウェル培養プレートを準備する:各井戸に、プレートホルダーを取り付けたスイングバケットローターで5分間、1,300 x g で1mLのミディアムA.遠心分離機を短時間追加します。マイクロウェルに気泡がないことを顕微鏡でコントロールする。
  3. 媒体Bを準備する (表 3)。
  4. ペトリ皿から神経上皮前駆細胞を除去する。DMEM/F12の2 mLで細胞を洗浄してください。細胞剥離の場合、PBSで調製した0.48 mM EDTA溶液の1.5 mLで細胞を処理します。顕微鏡下で細胞剥離を制御します。
  5. 細胞を15 mLチューブに収穫します。チューブに5mLのDMEM/F12を加えて、細胞を洗浄します。200 x g で 5 分間遠心分離機。上清を取り除き、培地Bの2mLで細胞を再懸濁する。
  6. トリパンブルー染色と血球計で細胞の濃度と生存率を確認します。合計で1 x 106 の生存細胞を含むために必要な懸濁液の量を計算します。
  7. 1 x 106 個の細胞を含む細胞懸濁液をマイクロウェル付き24ウェルプレートの各ウェルに移します。各ウェルに最大2 mLの培地Bを加え、ピペット細胞を数回上下に軽くピペットし、遠心分離機を1分間100 x g にしてマイクロウェル内の細胞を捕捉します。
    注:ウェルあたりのセルの数は1 x 106を超えてはならない。それ以外の場合は、隣接するマイクロウェルからのスフェロイドが融合します。
  8. 顕微鏡下で、細胞がマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。細胞が不均一に分布している場合は、ピペット処理と遠心分離を繰り返します。
  9. プレートを一晩インキュベートし、細胞をスフェロイドに凝集させます。

4. オルガノイドの入手と栽培

  1. 翌朝(15日目)、顕微鏡下でのスフェロイドの品質を確認する。正常であれば、透明で滑らかであることを確認します(図2A、B)。慎重に15 mLチューブに各ウェルからスフェロイドを収集し、2〜3分間重力で沈殿するためにスフェロイドを残し、その後、上清を除去します。
  2. 氷上で同時に解凍したマトリックスの2mLの回転楕円体に加えます。ピペットで軽く混ぜ、室温で30分間インキュベートします。
  3. マトリックスの余分を洗浄するには、ミディアムB.ピペットのチューブ8 mLにそっと加え、100 x gでチューブを1分間遠心します。
    注: 回転楕円体の不可逆的な凝集を避けるために、遠心分離の時間と速度を超えないでください。
  4. 上清を取り除く。ミディアムBのチューブ2 mLに、ピペットをそっと加えます。スフェロイド懸濁液を2つのミニバイオリアクターに分割し、それぞれに4mLの媒体Bを含み、ミニバイオリアクターを15cmのペトリ皿に入れて水の蒸発を防ぎ、汚染を避けます。
  5. 軌道シェーカーにミニバイオリアクター付きのペトリ皿を置きます。オルガノイドを70~75rpmの回転速度で栽培します。
  6. 16日目に、中程度のCを準備します(表4)。
  7. オルガノイドを15mLチューブに移します。5分間、底に落ちるようにし、上清を吸引し、5 mLの培地Cを加え、オルガノイドをミニバイオリアクターに戻します。
    注:透明でほとんど見えない回転楕円体を失わないように注意してください。
  8. スフェロイドを培地Cで2週間栽培し、2日ごとに培地をリフレッシュする。この2週間の終わりに、ミニバイオリアクターあたり約100個のスフェロイドを残し、次の栽培を行う。液体窒素中の凍結媒体中の過剰なスフェロイドを凍結する。
  9. 30日目に、中程度のD(表5)を準備します。
  10. 成熟培地である培地Dに栽培培地を変更する。3週間2〜3日ごとに培養培地をリフレッシュし、BDNFおよびGDNFなしで培地Dを使用する。

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結果

プロトコル スキームを図1に示します。このプロトコルには、iPSCが少なくとも1ヶ月間に脳オルガノイドに分化する5つのメディアが含まれていました。分化が開始された後、iPSCは75-90%の合流点に達した(図2A、B)。細胞が「ロゼット」に集まり始めた時、ニューロンに対する分化の最初の兆候は、10~11日目に、細胞が「ロゼット」に集まり始めた時に、A培地でのiPSC培養の10~11日目に観察された(図2C)。14-15日目に、iPSCは神経上皮前駆細胞に分化した。細胞の99%は、神経上皮マーカーSOX1に陽性であり、多能性細胞マーカーTRA-1-81およびOCT4を発現しなかった(補助図S1)。次に、EDTA含有溶液を用いて細胞を採取し、ミディアムBでマイクロウェルを有する特殊な24ウェル培養プレートに移した(図2D)。

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ディスカッション

記載されたプロトコルは、均一なサイズの高品質オルガノイドの生成を可能にする2つの重要なステップを有する。まず、オルガノイドは、細胞数と細胞成熟度がほぼ同じスフェロイドから成長する。第二に、自家製のバイオリアクターは、オルガノイドが群がったりくっつくりしない均一な環境を各オルガノイドに提供します。

細胞の品質と細胞成熟の状態は、プロトコルを実行するために不可欠です。iPSCの75~90%合流で神経分化を開始することが重要です。細胞密度が低すぎると、iPSCは非神経方向に分化することができます。後に神経前駆物質が脆弱になるため、iPSCの2週間を超えないことが重要です。分化の間、飢餓はオルガノイドの質の急激な低下につながるので、細胞およびオルガノイドは、定期的に新鮮な培地と一緒に供給されるべきである。動的栽培では、短期休憩のみが許可されます。

プロトコルの一部の変更が許可されます。任意の不活性生物材料は、ミニバイオリアクターの中央部にノブを作るために適用することができます:フッ素樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン。微生物学用のペト...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、ロシア連邦科学高等教育省からの助成金075-15-2019-1669(RT-PCR分析)とロシア科学財団からの助成金No.19-15-00425(他のすべての仕事のために)によって支えられました。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc3442524ウェル培養プレート、マイクロウェル付き
B-27 サプリメントGibco17504044ニューロンサプリメント B
GlutaMAX サプリメントGibco35050061200 mM L-アラニル-L-グルタミン
ヒト BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
ヒト FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
ヒト GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
ノックアウト 血清交換Gibco10828028血清交換
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850多量性幹細胞培地
N2 サプリメントGibco
ニューロベースル培地ギブコ21103049神経細胞維持のための基礎培地
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液ギブコ15140130
プラズモシンInvivoGenant-mpt-1抗菌剤
プルモルファミンEMD ミリポア540220
StemMACS Y27632ミルテニー バイオテック130-106-538Y27632
StemMACS ドルソモルフィンミルテニー バイオテック130-104-466ドルソモルフィン
StemMACS LDN-193189ミルテニー バイオテック130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542ミルテニー バイオテック130-106-543SB431542
トリパン ブルー ソリューションギブコ15250061
バーセン ソリューションギブコ150400660.48 mM EDTA含有PBS
&β;-メルカプトエタノールGibco31350010
17502001

参考文献

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