単一粒子干渉反射率イメージング:個々の細胞外小胞と集団動態の特性評価

サマリー

このプロトコルは、細胞外小胞(EV)サイズ、EVカウント、EV表現型、およびEVバイオマーカーの共局在のマルチレベルかつ包括的な測定のために設計された単一粒子干渉反射率イメージングを提供します。

要約

細胞外小胞(EV)は、ほとんどの細胞から分泌される脂質二重層を持つナノメートルサイズの小胞です。EVは、タンパク質、脂質、DNA、RNAなど、さまざまな生体分子を運び、さまざまな組織や臓器での細胞間コミュニケーションを促進すると考えられています。近年、EVは様々な疾患の診断薬や治療薬のバイオマーカーとして大きな注目を集めています。EVの特性評価のために、多くの方法が開発されてきました。しかし、現在のEV解析手法には、それぞれ異なる制限があります。したがって、EVの絶縁と特性評価のための効率的で効果的な方法を開発することは、この最先端の研究分野が成熟するにつれて、依然として重要なステップの1つです。ここでは、未精製の生物学的源からのEVと他の方法論によって精製されたEVを検出および特性評価できる方法として、単一粒子干渉反射率イメージングセンサー(SP-IRIS)の概要を示す詳細なプロトコルを提供します。この高度な手法は、EVサイズ、EV数、EV表現型、およびバイオマーカーの共局在を分析するためのマルチレベルかつ包括的な測定に使用できます。

概要

細胞外小胞(EV)は、血液、母乳、唾液、尿、胆汁、膵液、脳脊髄液、腹膜液など、多数の生体液から単離できるナノメートルサイズの細胞起源の膜小胞です。EVの導出は、アポトーシス、多胞体と原形質膜との融合による放出、原形質膜^のブレブ1という3つの主要なメカニズムによって発生します。ドナー細胞成分のEV移動が隣接または離れた細胞や組織に転移するという証拠は、これらの膜封入パッケージがパラクリンだけでなく、長距離または内分泌シグナル伝達カスケードでも重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています^1,2,3。EVは細胞の表現型のスナップショットを提供できるため、さまざまな疾患の治療のための診断および治療ツールとしての使用の可能性は、研究の活発な領域となっています4,5,6,7,8。

EVの特性評....

プロトコル

血清サンプルは、カンザス大学医療センター(KUMC)の承認された動物施設管理および使用委員会(IACUC)のプロトコルに従ってマウスから収集されました。これらの実験にこれらの生体試料を使用することも、建国大学工学院によって承認されています。

1. サンプル調製(1日目)

1. ナノ粒子トラッキングまたは同等の技術を使用してEV濃度を決定します。
2. インキュベーション溶液でサンプルを5 x 10^7-5 x 10⁸ EV/mLの濃度に希釈します。最低50μLが必要です。
   注:EV濃度が不明なサンプルの場合、1 μg/mLの総タンパク質を代用手段として使用できます。サンプルの濃度が低いと予想される場合は、インキュベーション溶液で少なくとも1:1の希釈を行ってからロードしてください。
3. 24ウェルプレートを、振動や無愛想な動きのない平らな面に置きます。
   注意: コントラストを高めるために、プレートの下に白い紙を置くことができます。
4. 井戸の周辺に水を追加します(図2)。

結果

図7 (左パネル)は、HEK293でコンディショニングされた培地をチップ上のCD63スポットに結合させ、CD81、CD63、CD9を染色したEVの3色合成画像です(それぞれ緑、赤、青)。 図7 (右上のパネル)は、キャプチャされた各EVが、各チャネルでさまざまな強度の1つ以上の色の共局在を表示できることを示すズームイン画像です。捕捉されたEVの染色の違いは、単一の小胞上での3つのテトラスパニンの発現の不均一性を表しており、データ解析ソフトウェアで定量化することができます。 図7 (右下のパネル)は、50nmを超えるEVのサイジングヒストグラムを示しています。サイジングヒストグラムは、CD63スポットでキャプチャされたEVのモードサイズが50nmであることを示しています。スポット画像にバインドされた各EVの色の共局在化、強度、およびサイズは、表現型データを表し、測定の基本データを構成します。

ディスカッション

現在のEV特性評価法は、精製されたEVに大きく依存しており、これはEV精製法^{9,10,11,12,13}の現在の実験的制限によって制限されています。単粒子干渉反射率イメージング(SP-IRIS)は、サンプル分析に必要な精製ステップを省くことができる効果的な技術であり、一般的なEVワークフローに関連する時間とコストを削減できます。必要なサンプルインプットは通常非常に少ないため、サンプルの残りの部分は追加の分析方法に使用できます。

さらに、抗原特異的な方法でEVを測定する能力は、基本的なEV研究だけでなく、診断および治療アプリケーションにおけるレアイベント検出にとっても非常に重要です。しかし、疾患特.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cm滅菌ペトリ皿	フィッシャー	FB0875712
15mL滅菌チューブ	n/a	各種
24ウェル細胞培養プレート、平底	フィッシャー	08-772-1
ブロッキングソリューション	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
チップファイル	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
チップ	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
Chuck	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
コーニングイージーグリップ使い捨てポリスチレン滅菌ボトル250ml	フィ	ッシャー09-761-4
ニングイージーグリップ使い捨てポリスチレン滅菌ボトル500ミリリットル	フィ	ッシャー09-761-10
イオン(DI)水	フィッシャー	LC267404
EMSスタイルのピンセットカーボンファイバーチップ付き	フィ	ッシャー50-193-0842ExoView
ヒューマンテトラスパニンキット	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	キャプチャー hCD81, hCD9, hCD63, IgG Control  + stains for hEV-A (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) 16チップ/キット
ExoView R100 イメージャー	NanoView Biosciences	EV-R100	干渉顕微鏡 3色蛍光を含むハイスペックカメラを含む 細胞外小胞のサイジングとカウント
標識ヒューマ CD9 IgG抗体	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
蛍光標識されたヒトCD63 IgG抗体	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
蛍光標識されたヒトCD81 IgG抗体	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoViewヒトテトラスパニンキットに含まれています。
インキュベーションソリューション	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
n/a	で振とうできるデジタル設定のオービタルシェーカーまたはマイクロプレートシェーカー	様々な
プレートシール	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	ExoView Human Tetraspanin Kitで見つけることができます。
ソリューションA:	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
ソリューション B	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kit に含まれています。
Solution C	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kitに含まれています。
ソリューション D	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	は、ExoView Human Tetraspanin Kit に含まれています。
スクエア/フラットチップピンセット	Fisher	50-239-62
ストレートストロングポイント Boley型ピンセット	Fisher	16-100-124
Thermo Scientific 接着性PCRプレートシール	Fisher	AB-0558

コー脱 蛍光500 rpm