マイクロプレート形式の磁気ピンセット

サマリー

ここでは、アンサンブル生化学的アッセイを実行しながら生体分子の機械的操作を可能にする新しいマイクロプレートアッセイの使用について説明します。これは、磁石で改造されたマイクロプレートの蓋を使用して、マイクロプレート全体に複数の静的磁気ピンセットを作成することで実現されます。

要約

メカノバイオロジーは、生体材料の物理的力と機械的特性が生理学と病気にどのように寄与するかを説明しています。通常、これらのアプローチは限られた単一分子の方法であるため、利用可能性が制限されます。このニーズに対応するため、標準的な生化学的アッセイを行いながら機械的な操作を可能にするマイクロプレートアッセイが開発されました。これは、マイクロプレートの蓋に組み込まれた磁石を使用して、複数の磁気ピンセットを作成することで実現されます。この形式では、常磁性ビーズに接続された生体分子全体に力が加えられ、これは一般的な磁気ピンセットに相当します。この研究では、このツールをFRETベースのアッセイと組み合わせてタンパク質のコンフォメーションをモニターする方法を実証しています。しかし、このアプローチは、酵素活性の測定から生細胞のシグナル伝達経路の活性化まで、さまざまな生物学的システムに広く適用できます。

概要

メカノバイオロジーは、細胞内および細胞間の物理的な力の伝播が細胞活動をどのように制御するか^1,2、およびこれがタンパク質と細胞の両方の組織とダイナミクスとどのように相関するかを理解することに焦点を当てています。

単一分子の力の測定により、単一のタンパク質から全細胞および組織3,4,5,6,7までの生物学的システムにおいて力がどのように使用されるかが明らかになりました。これらの困難な実験には、特殊な機器と技術的な専門知識が必要です。逆に、標準的な生化学的アッセイは、容易に入手できる市販の機器でより高いスループットで実施できます。

ここでは、この研究では、磁気ピンセットベースの操作と生化学的アッセイを一緒に実行できるようにする機械生物学アッセイについて説明します⁸。磁石は3....

プロトコル

この実験に必要なタンパク質のサンプルと試薬のリストは、 材料表に記載されています。コンフォメーションの変化を測定するために、ユーザーの研究システムに対して同等のタンパク質を作製する必要があります。

1. 3Dプリントされた磁気蓋

1. 24ウェルマイクロプレート内に磁石を収納するマイクロプレートの蓋を設計します。サンプルのCADファイルはGitHub¹²からダウンロードできます。測定値を 図1に示します。
   注意: 台座の高さを変更して、磁石と表面の間の距離を変更し、加えられる力を変更できます。さらに、粒子に加えられる最終的な力は、粒子のサイズと磁石のペア間のギャップによって異なります。0.5 mm、1 mm、および2 mmのギャップで1 μmおよび2.8 μmの粒子に加えられる力を計算する式は、Dos Santos et ^al.8に示されています。ここで説明する2.8 μmの粒子と2 mmのギャップでの実験では、式1を使用します。
   方程式1:

結果

図2 は、GFPの蛍光強度がマイクロプレートウェル全体で1mm間隔で記録されたウェルスキャン測定の例を示しています。一般的な蛍光測定は、マイクロプレートウェルの中心位置( 図2の位置8,8)で行います。したがって、この場所に結合タンパク質が存在することが重要です。 図2に示すように、強度は半径数ミリメートル以内の井戸の中心で最も高くなります。通常、固定化はウェルの端から離れている方が優れていますが、これはタンパク質が側壁に結合するためである可能性があります。ここでは、タンパク質結合の欠如やビオチン-BSAやストレプトアビジンの欠陥によるシグナルの低下が特定されます。蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートを使用して、表面上のビオチン-BSAを確認できます。同様に、ビオチン-GFPからなる対照タンパク質は、ストレプトアビジンがビオチン-BSA表面に結合しているかどうかを決定します。プロトコルに記載されているように、ビオチン-BSA、ストレプトアビジン、およびタンパク.......

ディスカッション

このアプローチにより、蛍光プレートリーダーを使用して、力ベースの測定をマイクロプレートに容易に適用できます。重要なことは、このアッセイフォーマットは、表面に結合したときに機能的なタンパク質が存在することを前提としています。したがって、これらの測定に着手する前に、タンパク質活性があることを確認するための事前知識が必要です。また、常磁性ビーズや表面への分子の結合が各システムに対して最適化されていることを確認することも有益です。

この概念は、すべてのタイプのマイクロプレートで機能するように変更できます。ただし、磁石はウェルに収まらないため、24ウェルを超えるマイクロプレートには磁石の選択を適合させる必要があります。磁石はウェルの上にまだ置くことができます。しかし、24ウェルプレートでは、これは他のウェル⁸を横切る漂遊磁場につながらない。96ウェルプレートなどの小さなウェルでは、ウェル間でフィールドのばらつきが生じる場合があります。最後に、倒立顕微鏡で蛍光顕微鏡法を実行する.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルガラス底マイクロプレート	Cellvis	P24-1.5H-N	複数のソースが利用可能です。必要でない限り、処理された表面を避けるのが最善であり、イメージンググレードのガラスN1.5を使用しています。
抗RFP抗体	アブカム	ab290	複数の供給源が利用可能ですが、GFPとの反応性が最小限であることを確認する必要があります。
ベンチトップ光学顕微鏡	Optika	IM-3
ベンチトップ ローテーター	コール・パーマー・スチュアート	SB3
ビオチン-BSA	シグマ・アルドリッチ	A8549
CADソフトウェア - スケッチアップ エデュケーター	スケッチアップ		代替CADソフトウェアを使用することができます。ユーザーは、ファイル形式が3Dプリンターと互換性があることを確認する必要があります。
Dynabeads Protein A	フィッシャーサイエンティフィック	10746713	2.8 & マイクロ;m 常磁性ビーズ 組換えプロテインA
インパクト接触接着剤	EVO-STIK
MagnaRack 磁気分離ラック	サーモフィッシャー サイエンティフィック	CS15000	マグ
NaCl	フィッシャーサイエンティフィック	10316943
ネオジム N42 5mm キューブ マグネット	スーパーマグネタイト	W-05-N
プレートリーダー - ClarioStar	BMGLabtech		すべてのプレートリーダーシステムは、マイクロプレートの下から測定可能な場所で使用できます。マグネットリッドは、上からの標準測定値を除外
ストレプトアビジン	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	フィッシャーサイエンティフィ	ック10142400
Ultimaker PETG フィラメント	Ultimaker Ultimaker
S3 - 3Dプリンター	Ultimaker

ネティックアイソレーター しています