培養骨細胞および単離骨軸におけるアミノ酸消費の評価

アミノ酸は、各アミノ酸に特異的な可変側鎖を有するアミノ(−_NH2)およびカルボキシル(−COOH)官能基を含む有機化合物である。一般に、タンパク質の基本構成成分としてアミノ酸がよく知られている。最近では、アミノ酸の新たな用途や機能が解明されています。例えば、個々のアミノ酸を代謝して、生体エネルギーに寄与する中間代謝産物を生成し、酵素補因子として機能し、活性酸素種を調節し、または他のアミノ酸を合成するために使用される1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .多くの研究は、アミノ酸代謝が様々な状況における細胞の多能性、増殖、および分化に重要であることを示しています³、^6、11、12、^13、14、¹⁵、^16、17。

骨芽細胞は、コラーゲン1型に富む細胞外骨基質を産生および分泌する分泌細胞です。骨形成中に高いタンパク質合成速度を維持するために、骨芽細胞はアミノ酸の一定の供給を必要とします。この需要を満たすために、骨芽細胞は積極的にアミノ酸を獲得しなければなりません。これと一致して、最近の研究は、骨芽細胞活動および骨形成におけるアミノ酸の取り込みおよび代謝の重要性を明らかにしている¹⁵、16、¹⁷、^18、19、20。

骨芽細胞は、細胞外環境、細胞内タンパク質分解、de novoアミノ酸生合成の3つの主要なソースから細胞アミノ酸を獲得します。このプロトコルは、細胞外環境からのアミノ酸取り込みの評価に焦点を当てます。アミノ酸の取り込みを測定する最も一般的な方法は、放射性標識(例えば、^3Hまたは^14C)または重同位体標識(例えば、^13C)アミノ酸のいずれかに依存する。重同位体アッセイは、アミノ酸の取り込みおよび代謝をより徹底的かつ安全に分析することができるが、サンプルの調製および誘導体化に1日かかり、サンプル数に応じて質量分析計で分析するのに数日かかるため、完了するまでに数日かかるため、より時間がかかる^21,22。比較すると、放射性標識アミノ酸取り込みアッセイは、下流代謝について有益ではありませんが、安価で比較的迅速であり、実験の開始から2〜3時間以内に完了することができます^23,24。ここでは、in vitroで培養された初代細胞または細胞株または個々の骨軸における放射性標識アミノ酸の取り込みを評価するために設計された、容易に変更可能な基本プロトコルについて説明します。これら2つのプロトコルの適用は、他の放射性標識アミノ酸および他の骨関連細胞型および組織に拡張することができる。

本明細書に記載されているすべてのマウス手順は、ダラスのテキサス大学サウスウェスタン医療センターの動物研究委員会によって承認されました。放射線プロトコルは、ダラスのテキサス大学サウスウェスタン医療センターの放射線安全諮問委員会によって承認されました。

1. 細胞内におけるアミノ酸の取り込み(プロトコルI)

1. プレート5 x 10⁴ ST2細胞を12ウェル組織培養プレートの各ウェルに入れる。10%FBS、100 U/mLペニシリンおよび0.1 μg/mLストレプトマイシン(ペン/ストレプトマイシン)を含むα-MEMのプレート細胞。細胞の余分なウェルをプレートして、ステップ1.12での正規化のための条件ごとの細胞数を定量化する。加湿した細胞培養インキュベーター内で細胞を37°C、5%_CO2でインキュベートします。
2. コンフルエントになるまで細胞を2〜3日間培養します。
3. 実験当日、以下の溶液を調製する:1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4およびクレブスリンガーHEPES(KRH)緩衝液、pH 8.0:(120mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、1mM MgCl₂、NaHCO₃、5mM HEPES、1mM D-グルコース)。37°Cに予熱します。
4. 培地を吸引し、1 mLの1x PBS、pH 7.4で細胞を2回洗浄します。
   注:このプロトコルは、非コンフルエントセルを急速に分割する場合にも適しています。この場合、放射能を絶対細胞数またはDNA含有量のいずれかに正規化することが重要です。さらに、培養プレートまたはフラスコのサイズを大きくして、全体的な細胞数とcpm値を増やすことを検討してください。これは、個別に経験的に決定することが重要です。
5. 1x PBSを吸引し、1 mL KRHで細胞を1回洗浄します。
6. KRH 1 mLあたり 4 μL の [1 μCi μL-1] L-[3,4-3H]-グルタミンストックを希釈して、4 μCi/mL L^-[3,4-3H]-グルタミン作動培地を作成します。
   注:放射性物質を使用する前に、所属機関の放射線安全室に連絡して承認を取得してください。放射線に関連するすべての手順は、プレキシガラスシールドの後ろで実行する必要があります。
7. 4 μCi/mL L-[3,4-3H]-グルタミン作動培地を含む0.5 mLのKRHで細胞を5分間インキュベートします。
8. 放射性媒体を収集し、廃液容器に分注します。細胞を氷冷したKRHで3回短時間洗浄し、反応を終了します。放射性液体廃棄物容器内のすべての洗浄を収集して廃棄します。
9. 各ウェルに1 mLの1% SDSを加え、10倍に粉砕して細胞を溶解およびホモジナイズします。細胞ライセートを1.5 mLチューブに移します。細胞培養プレート、血清学的ピペット、およびピペットチップは、固体放射性廃棄物容器に廃棄してください。
10. >10,000 x g で10分間遠心分離します。上清を8mLのシンチレーション溶液を含むシンチレーションバイアルに移します。シンチレーションバイアルを激しく振って混合する。チューブとピペットチップは固形放射性廃棄物容器に廃棄してください。
11. シンチレーションカウンターを使用して、放射能を1分あたりのカウント(cpm)で読み取ります。シンチレーションバイアルはシンチレーションバイアル廃棄物容器に廃棄します。
12. トリプシン処理、再懸濁、および残りの非放射性細胞のプレートから細胞をカウントし(ステップ1.1を参照)、溶解した放射性培養液中の細胞数を推定します。血球計算盤を用いて、実験条件ごとに非放射性ウェル当たりの細胞数をカウントする。ステップ1.11のcpmを非放射性プレートからの推定細胞数に正規化します。
13. 実験終了後、細胞培養フード、ベンチ、およびすべての器具を放射能除染剤スプレーで除染します。最後に、ワイプテストを実行して、作業領域が放射線を含まないことを確認します。

2.新たに分離された骨組織におけるアミノ酸の取り込み(プロトコルII)

1. KRHを37°Cに予熱します。
2. 生後3日のマウスを安楽死させ、腕の皮膚を取り除きます。ハサミを使用して肩から上腕骨を解剖し、両方の上腕骨を解剖します。メスと鉗子を使用してすべての即時組織を取り除きます。骨端を骨から取り除きます。
   注:上腕骨に加えて、このプロトコルは、新生児の大腿骨、脛骨、頭蓋骨、および2か月齢および4か月齢のマウスから分離された上腕骨、大腿骨、脛骨に適合させることができます(未発表データ)。
3. 骨から骨髄を洗い流し、ステップ2.14で正常化するために骨シャフトの重量を量ります。
4. 上腕骨の1本を1x PBSで100°Cで10分間煮沸し、骨を脱細胞化します。脱細胞化された煮骨は陰性対照として使用されます。
   注:品質管理として、パラフィンは組織学的染色のために沸騰した骨と沸騰していない骨を埋め込み、沸騰が骨の脱細胞化に効果的であることを視覚的に確認します。
5. 両上腕骨を1 mLのKRH中で37°Cの細胞培養インキュベーター内で30分間平衡化します。
6. 1 mL KRHあたり4 μLの1μCi/μL L-[2,3,4-3H]-アルギニンストックを希釈することにより、KRH中の4 μCi/mL L-[2,3,4-3H]-アルギニンの作業溶液を作ります。
   注:このプロトコルは、選択された放射性標識栄養素の取り込みを評価するのに適しています。L-[2,3,4-3H]-グルタミン、L-[¹⁴C_U]-アラニン、およびL-[2,3-3 H]-プロリンも同様の結果でテストされています。アルギニンデータは、このプロトコルの有用性を強調するために示されています。
   注意: 放射線を使用するすべての手順は、適切な個人用保護具(PPE)を使用しながら、プレキシガラスシールドの後ろで実行する必要があります。
7. 実験用対照骨と煮沸対照骨の両方を、4 μCi/mL L-[2,3,4-3H]-アルギニンを含むKRH中で37°Cで最大90分間インキュベートします。
   注:タイムコースを行うことにより、マウスの年齢、さまざまな骨格要素、放射性標識アミノ酸の種類など、さまざまな条件のインキュベーション時間を経験的に決定することが重要です。飽和は主に約3〜4時間後に起こります。取り込みは、取り込みの線形怒りの時点で評価する必要があります。
8. 放射性媒体を取り出し、液体放射性廃棄物容器に廃棄します。氷冷1mLのKRHを使用して上腕骨を3回洗浄し、反応を終了させます。液体放射性廃棄物容器内のすべての洗浄物を廃棄します。
9. 各骨を1.5 mLチューブに移します。500 μLのRIPAバッファー[150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM トリス (pH 8.0); 0.5% NP40 (v/v); 0.5% DOX (w/v); 0.1% SDS (w/v)]を加える。培養プレート、血清学的ピペット、およびピペットチップは、放射性固形廃棄物容器に入れて廃棄します。
10. RIPAバッファーでハサミで100回刻んで上腕骨を均質化します。
11. 超音波処理(振幅:35%、パルス1秒)得られた均質化された骨を10秒間。
    注:超音波処理はエアロゾルを生成することも知られています。超音波処理ステップは、生物学的安全キャビネットで実行できます。エアロゾルの形成を減らすには、チューブを過剰に充填しないことが重要です。少量のサンプルの超音波処理は、不完全な超音波処理または発泡によるサンプル損失をもたらすことができます。発泡が発生した場合は、サンプルを5分間遠心分離して沈降させます。
12. 室温で >10,000 x g で 10 分間遠心分離することにより、ライセートを清澄化します。200 μLの上清を8 mLのシンチレーション溶液を含むシンチレーションバイアルに移します。シンチレーションバイアルを激しく振って混合する。すべての固体放射性廃棄物(使用済みチューブ、ピペットチップ、プレートなど)を固体放射性廃棄物容器に廃棄します。
13. シンチレーションカウンターを使用して放射能(cpm)を読み取ります。使用済みのシンチレーションバイアルは、シンチレーションバイアル用に指定された放射性廃棄物容器に廃棄してください。
14. 実験骨のcpmから茹で骨のcpm(基礎値)を引く。ステップ2.3の骨重量で放射能を正規化します。
15. 細胞培養フード、器具、およびベンチに放射能除染剤をスプレーします。ワイプテストを実行して、作業領域が放射線フリーであることを確認します。

アミノ酸輸送は、基質特異性、動態、イオンおよびpH依存性を含む多数の特性に基づいて異なる輸送システムに分類されている多くの膜結合アミノ酸トランスポーターによって調節されています25。例えば、グルタミンの取り込みは、Na+依存性輸送系A、ASC、γ+LおよびN、またはNa+非依存性系Lによって媒介され得る。Na+依存系は、Na+(系N)をLi+に置き換える能力、またはアミノ酸アナログの2-(メチルアミノ)イソ酪酸(MeAIB)(系A)に対する感受性によって区別されます。この実験の目的は、各輸送システムに起因するグルタミン消費量を定義することでした。L-[3,4-3H]グルタミンの取り込みは、120 mM NaClを含む正常KRH、120 mM塩化コリンを含むNa+遊離KRH、5 mM MeAIBを含む正常KRH、または120 mM LiClを含むNa+遊離KRHのコンフルエントST2細胞で測定されました。総放射能(1分間当たりのカウント)は細胞数に対して正規化した。Na+の除去により、グルタミンの取り込みが90%減少しました。これは、システムLがグルタミン取り込みの10%を占めるのに対し、ST2細胞ではグルタミン取り込みの90%がNa+依存性であることを示しています(図2)。Li+の存在は、Na+遊離条件と比較してグルタミン取り込みを2%増加させただけでしたが、5 mM MEAIBはグルタミン取り込みに影響を与えませんでした。これらのデータは、グルタミン取り込みの大部分がシステムASCおよびγ+Lによって媒介され、システムNおよびシステムAがそれぞれNa+依存性グルタミン取り込みの約2%および0%に関与していることを示しています。

プロトコルIを修正して、ex vivoでの骨軸でのアミノ酸取り込みを特徴付けました。この実験では、プロトコルIIに従って、3日齢(p3)マウスから分離された長骨のアルギニン取り込み動態を特徴付けました。これを行うために、我々は最初にp3マウスから両方の上腕骨を解剖した。骨端を取り除き、骨髄をスピンアウトし、正常化のために各上腕骨の重量を測定しました。反対側の上腕骨は陰性対照に指定され、細胞活動を殺すために煮沸されました。次に、実験的で煮沸した上腕骨を、放射性標識された4μCi / mL L-[2,3,4-3H]-アルギニンで最大2時間インキュベートしました。アルギニンの取り込みは、この実験の過程で直線的に増加した(図3A)。比較のために、茹でた上腕骨は、この実験ではアルギニン取り込みの動的増加を示さず、むしろ骨基質へのプローブの吸着に起因する基礎放射能を有していた。正規化および補正されたアルギニン取り込みを図3Bに示す。

図1:放射性標識アミノ酸取り込みアッセイのワークフロー。 インビトロ(プロトコルI)および骨エクスビボ(プロトコルII)でのアミノ酸取り込みアッセイの概略概要。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:in vitroでのST2におけるL-[3,4-3H]-グルタミン取り込みの速度論的特性。 (A)ST2細胞におけるナトリウム(Na+)、MeAIBまたはリチウム(Li+)の存在下(+)または非存在下(-)で行われるL-[3,4-3H]-グルタミン取り込みアッセイ。(B)グルタミンの取り込みに対するシステムA、N、L、またはASCおよびγ + Lの推定寄与の割合。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:新生児上腕骨におけるEx vivo L-[2,3,4-3H]-アルギニン取り込み。 (a)L-[2,3,4-3H]-アルギニン取り込みを、3日齢のC57BL/6マウスから単離した生上腕骨および煮上腕骨において2時間の経時変化にわたって行った。(B)茹でた上腕骨による正規化されたL-[2,3,4-3H]-アルギニンの取り込み。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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