モスキートAedes aegyptiにおける高解像度メルト分析を用いたCRISPR/Cas9突然変異誘発に続くインデル検出

デング熱¹、ジカ²、チクングニア³ ウイルス、マラリア原虫⁴などの病原体のベクターとして、蚊は人間にとって重大な公衆衛生上の脅威を表しています。これらすべての疾患について、蚊のベクターの制御に伝染介入の実質的な焦点があります。例えば、病原体への寛容さ、蚊の適性、生存、生殖、殺虫剤に対する耐性に関する重要な遺伝子の研究は、新しい蚊対策戦略を開発するための鍵です。このような目的のために、蚊のゲノム編集は、特に、ES、ZFN、タリン、そして最近ではCas9を用いたCRISPRなどの技術の開発に伴い、一般的な習慣になりつつあります。遺伝子編集株の確立は、通常、オフターゲットおよび創始者(ボトルネック)効果を最小限に抑えるために数世代にわたり所望の突然変異を運ぶ個体を裏切り、続いてヘテロ接合個体を交えてホモ接合または異種間間線を生成することを含む。支配的なマーカーがない場合、多くの場合、ヘテロ接合性変異体に対して明確な形質の形質が検出されないため、このプロセスでは分子ジェノタイピングが必要です。

シーケンシングはジェロティピック特性評価のゴールドスタンダードですが、これを何百人、あるいは何千人もの個人にわたって行うことは、結果を得るのに必要な多大なコスト、労力、時間をもたらし、蚊などの寿命が短い生物にとって特に重要です。一般的に使用される選択肢は、測量ヌクレアーゼアッセイ⁵ (SNA)、T7E1アッセイ⁶、および高解像度メルト分析(HRMA、レビュー^イン7)です。SNA と T7E1 の両方で、不一致のベースのみを切断するエンドヌクレアーゼを使用します。ヘテロ接合変異体ゲノムの変異領域が増幅されると、変異型アレルと野生型対立遺伝子からのDNA断片がアニールされ、不一致の二本鎖DNA(dsDNA)が作られます。SNAは、ミスマッチ特異的なエンドヌクレアーゼと単純なアガロースゲル電気泳動による消化を介してミスマッチの存在を検出します。あるいは、HRMAはdsDNA結合蛍光色素によって検出されたdsDNAの熱力学的性質を使用し、変異の存在とタイプに基づいて色素の逆結合温度が変化する。HRMAは、一塩基多型(SNPs)⁸、シマウ^マ魚9の変異型遺伝子型、微生物学的用途¹⁰、植物遺伝子研究¹¹の検出に使用されている。

本論文では、CRISPR/Cas9技術により生成される変異型蚊の分子ジェノタイピングの簡便な手法であるHRMAについて述べている。代替技術に対するHRMAの利点は、様々な遺伝子、幅広いインデルサイズ、異なるインデルサイズとヘテロ接合、ホモ接合、および異種性分化^12、13、14、2)コストの区別に有用であることが証明されている1)柔軟性、および3時間短縮、および3時間短縮を含む。 それはほんの数時間で実行することができるので。さらに、このプロトコルはDNAの供給源として小さな身体部分(脚)を使用し、蚊がジェノタイピングプロセスを生き残ることを可能にし、突然変異線の確立および維持を可能にする。

1. 一塩基多型(SNPs)、HRMAプライマー設計、プライマー検証のスキャン

1. 野生型実験室コロニー蚊におけるSNP同定
   1. 適切なポリペプチド翻訳を中断する標的エキソンを選択します。
      注:ターゲットは、開始コドンに近いか、タンパク質機能に必要な主要な残基の中にあるべきです。エキソンが短いほど(例えば、≤200塩基)、より困難なターゲットと分析が困難である。これは、HRMAプライマーの1つがイントロンを横断するか、イントロンに入ることを強制するので、エキソンの境界に近い編集を避けてください。SNP率は、これらの地域ではるかに大きくなる傾向があるため、これは望ましくありません。
   2. プライマーデザイン
      1. NCBIブラスト - プライマーブラストウェブサイト¹⁵に移動し、ページの上部にあるボックスに選択した エキソン をコピーして貼り付けます| PCR 製品サイズ を選択 (エキソンのほとんどを含む) |生物を選 ぶ。
      2. [詳細パラメータ]|をクリックします 。( PCR製品のTmの場合)を選び、 60(60 °Cの最適温度)を加| プライマーを取得します。他のパラメータはデフォルトのままにします。
   3. 野生型の実験室コロニーからゲノムDNA(gDNA)を取得する。10個の蚊を脇に置き、_CO2で麻酔し、氷の上のペトリ皿に入れて非アクティブに保ちます。組織からDNAを放出するための試薬0.5μLと希釈バッファーの20 μLを含む10個のチューブを設置し、いずれも 材料表に示されているDNA放出キットに用意されています。
   4. 鉗子を使用して単一の蚊から片方の脚を取り出し、DNA放出試薬の希釈溶液の対応するチューブ(ステップ1.1.3から)に入れ、脚を溶液中に完全に浸します。残りの蚊と一緒にこのステップを繰り返し、鉗子を70%エタノールで拭いてから次の蚊に向かってください。
   5. 脚含有溶液を室温で2〜5分間インキュベートし、98°Cで2分間、PCR反応を設定しながら冷却します。
      注:リリースされたgDNAを含むプレートは-20°Cで保存することができ、この時点でプロトコルを一時停止することができます。
   6. 10 μLの2倍 PCRマスターミックスを含む10個のチューブ、プライマーを0.5 μMの最終濃度に、分子グレードの水を最終体積20 μLに準備し、希釈したサンプルの1μLを各チューブに移します。これらのサイクリングパラメータに従ってPCRを実行する:98 °C 5分、5 sのための98°Cの40サイクル、60 °C 30 s、72 °C 20 s/kb;72°Cの最終延長を1分間延長。
   7. 残留PCRプライマーを分解し、過剰なdNTPsまたはカラムクリーンアップキットを脱リン酸化する酵素でPCR製品を精製します。サンプルのシーケンスを続行します。
   8. 各エレクトロフェログラムを分析して、二重ピーク/あいまいな塩基の存在を調べ、適切な縮退ベースコードを使用して各シーケンスでベースコールを手動で調整します。
      注: この手順は、複数のシーケンスのアライメントの前に実行する必要があります。.
   9. 材料表または ClustalW16 や ^T-Coffee17 などの他のオープンソースアライメントソフトウェアに記載されているアライメントソフトウェア SeqMan Pro を使用して、複数のシーケンスアライメントを実行します。
      1. アライメント ソフトウェア |を開く[ シーケンスの追加] を クリック|目的のシーケンスを選択し、[ 追加 ]をクリック|すべてのシーケンスが選択されたら、[完了]をクリック します。
      2. [アセンブリ]をクリックして、線形を実行します。線形を開くには、Contig 1 をクリックして、位置合わせを分析し、SNPs を特定します(図 1)。
         注: ステップ 1.1.3-1.1.6 の代替として、バルクサンプルから得られた単離されたゲノム DNAから PCR を実行できます (>10 個の個体由来)。シーケンスアンプリコンは、エレクトロフェログラムの二重ピークとして現れるSNPsの存在について直接分析することができますが、まれなスニックは検出するのがより困難になります。
   10. 設計3-5単一ガイドRNA(sgRNA)は、上記で特定された任意のSNPを含む領域を避け、¹⁸で説明したプロトコルに従う。
2. HRMA プライマー設計
   1. ^mFold19 を使用して PCR 中に二次構造の形成が可能なエキソン配列をテストします。
      1. UNAFold Web サーバー |に移動します。 [mFold] | をクリックしますドロップダウン メニューで、[ アプリケーション ] をクリック| DNA折りたたみフォーム。
      2. ボックスに シーケンス名 を入力し、 エクソンを貼り付けます。
      3. 折り畳み温度を 60°Cに変更します。 イオン条件で[Mg⁺⁺]を 1.5 に変更し、ユニットで mMに切り替えます。DNAの 折りたたみをクリックします。
      4. [出力]の[構造1]の下で、pdf をクリックして[円構造プロット]を開きます。
   2. プライマーデザインの場合は、NCBIブラスト - プライマーブラスト¹⁵ に移動します。
   3. ページ上部のボックスに、ステップ 1.1 のシーケンス (SN または SNP がない数が最も少ないシーケンス) で指定したシーケンスをコピーして貼り付けます。
   4. シンボル < > を使用して、SNPs、ターゲットサイト、および二次構造の形成が可能なリージョンを含むシーケンスをマークおよび除外します。
   5. PCR製品サイズを80~150bpに選択し、生物を選択します。
      注: より大きなフラグメントサイズを使用できます (300 bp)。ただし、アンプリコンが長くなると、1 つまたは数個の塩基対で異なるシーケンス間の感度が低下する場合があります。
   6. プライ マーを取得をクリックします。試験するプライマーの2~3組を選択します(理想的には、プライマーサイトは、任意のCRISPRターゲットサイトから ≥20〜50bp離れています)。
3. プライマー検証
   1. 単一の個体からgDNAを用いて、グラジエントPCRを行う。
      1. マスターミックスを準備し、別のチューブ内の非テンプレート コントロール (NTC) の 1 つのサンプルを削除します。残りのマスターミックスにテンプレートを追加し、96ウェルプレートにアリコートを追加します。
      2. サイクリングの変数に従ってください:98 °C 30 s、10 sのための98 °Cの34周期、55-65 °C 30 s、72 °C 15 s;72°Cの最終延長を10分間延長。
      3. パラメータに従って熱溶融プロファイルを生成する:変性ステップ95°C1分間、1分間60°Cのアニーリング、0.2°C増分で75°Cと95°Cの間の溶融曲線検出、各温度で10 sのホールドタイムを有します。
         注: 単一の熱溶融プロファイルを持つアニーリング温度のみを使用する必要があります。
4. ⁱⁿ¹²に記載されているように胚注射を伴う変異線の生成を進める。

2. 蚊の足からのゲノムDNAの作製

1. 彼らはジェノタイピングの前に交尾しないように、パパルの段階でセックスによって_G1 蚊を分離し、年齢に一致した野生型のコントロール蚊が参照や裏クロスに使用できることを確認してください。同様にセックス分離します。
2. 必要な材料(図2A)を収集し、DNA放出試薬0.5 μLと希釈バッファー20 μL(gDNAリリースキットから)を1個につきジェノタイプにして氷の上に残す96ウェルPCRプレートを用意します。NTCに対して2つの反応を予約します。
3. 96プレートの各井戸がトレイ内のそれぞれの蚊バイアルに対応するように、蚊バイアル(ショウジョウバエ バイアル)のトレイにラベルを付けます。
4. G1蚊を_CO2で麻酔し、ガラスペトリ皿に入れて鎮静させ続けます(図2C、D)。麻酔をして、2番目のペトリ皿に8つの野生型の蚊を入れます。
5. 70%エタノールでピンセットを拭き、蚊の後ろ足の1つを取り除きます(図2E、F)。
6. 脚をDNA放出試薬溶液に沈め、蚊を対応するバイアルに入れ、スポンジで閉じます(図2G、H)。
7. 70%エタノールでピンセットを再び拭き取り、次の蚊から脚を取り除きます。96ウェルプレートが完了するまで、ステップ2.5~2.7を繰り返します。
   注:ピンセットを70%エタノールで拭き取ることが重要です。これにより、DNA交差汚染を最小限に抑えます。
8. プレートを光学PCRプレートシール(図2I)で密封し、脚を含む96ウェルプレートを室温(RT)で2〜5分間、98°Cで2分間インキュベートします。PCR ミックスの準備中にプレートを RT まで冷却します。
   注: プロセス全体は通常 3 ~ 4 時間かかります。蚊が予想される期間(特に≥1日)よりも長くバイアルに保管されなければならない場合は、各蚊と一緒にレーズン(または砂糖と水の供給源)を小さくして、拡張インキュベーション中の蚊の生存を確実にします。

3. HRMA

1. PCR を実行します。
   1. 各反応ごとに、2xバッファーの10 μL(gDNAリリースキットから)、各プライマーの0.5 μM、EvaGreen色素1μL、ポリメラーゼ0.4μL(gDNA放出キットから)、分子グレードの水で19μLに完了します。
   2. マルチチャンネルパイプを使用して、マスターミックスの19 μLを各ウェルに転送します。セクション2で作製した蚊のDNAを含むDNA放出溶液の1μLをプレートに移す(図3A)。光学PCRプレートシールでプレートをシールします。
   3. サイクリングパラメータに従ってPCRを実行:5分間98°C、10sの98°Cの39サイクル、30sの選択されたアニーリング温度(72°C);最終延長72°C 2分間。
2. パラメータに従って熱溶融プロファイルを生成する:変性ステップ95°C1分間、1分間60°Cのアニーリング、0.2°C増分で75°Cと95°Cの間の溶融曲線検出、各温度で10 sのホールドタイムを有します。CFX96 リアルタイム システムを使用した HRMA 実行のソフトウェア セットアップの詳細については、 補足資料 および 補足図 S1-S5 を参照してください。
3. メルトプロファイルを調べます(図3B)。参照クラスタにワイルド タイプのコントロールを割り当てます。
   注: ソフトウェア( 材料表を参照)は、データを自動的に正規化し、異なるメルトカーブの色を持つクラスタを指定します。
4. 96 ウェル テンプレートで、対応する色を使用して異なるクラスターにマークを付けます (図 3C)。
5. 目的のカーブを持つ個人を選択し、チューブからそれらを削除し、バッククロス(図3D)します。血中の雌を養い、_G2 卵を集める。

4. サンガーシーケンシングによるシーケンス検証

1. 選択した蚊(セクション3.1で調製したプレートから)でウェルからPCR産物を精製し、酵素を使用して残留PCRプライマーを分解し、過剰なdNTPsを脱リン酸化します。または、任意のカラムクリーンアップキットを使用し、サンプルのシーケンス処理を続行します。
   注: PCR 製品サイズが小さい場合(≤200 bp)、直接シーケンス処理の方が困難な場合があります。このような場合、標的部位を包含するより大きな断片(≥250bp)を増幅し、96ウェルプレート内のDNAを用いてPCRにより増幅するようにプライマーを設計する(ステップ2.2)。
2. トレース ビューア ソフトウェアを使用してインデルを分析および識別します (図 4)。あるいは、ポリピークパーサソフトウェア²⁰ は、ヘテロ接合個体の突然変異を検出するのに役立つ。
   1. Poly Peak Parser Web サイトに移動し、[ 参照 ] メニューのミュータントされた個人からシーケンスを選択し、参照シーケンスをコピーしてボックスに貼り付けます。
      メモ:代替対立と参照の間の位置合わせは、画面の右側に自動的に表示されます。

遺伝子 AaeZIP11 (推定鉄輸送因子21)および ミオフェム (飛行筋13に関連する女性偏ったミオシン遺伝子)に変異を含む蚊がCRISPR/Cas9技術を用いて得られ、HRMAを用いて遺伝子型型化され、配列検証された(図5)。 図5A および 図5C は、 AaeZIP11 および ミオフェム 変異体サンプルからのHRM曲線からの正規化された蛍光強度を、それぞれ野生型制御と共に示す。 図4B および 図4D は、各曲線を野生型基準から引いた後にソフトウェアによって割り当てられた異なるクラスターの溶融プロファイル間の差曲線( AaeZIP11 および ミオフェム 変異体サンプルからそれぞれ)の倍率を示す。ヘテロザイグースおよびホモ接合体変異体 AaeZIP11 個体は異なるクラスターに配置され、野生型制御と容易に区別される(図5B)。ヘテロ接合変異型 ミオフェム 個体も、コントロールとは異なる(図5D)。両方のケースでワイルド タイプ コントロール内に 2 つのクラスターが存在し、ほとんどの場合、ターゲット領域に SNP が存在するため (図 5)、複数のコントロール サンプルを使用して、SNPs を回避できないときにコントロールを変異体として分類しないようにする必要性が強調されています。

図4Aは、AaeZIP11変異体の配列解析を示す。AaeZIP11ヘテロ接合体変異体からのエレクトロフェログラムは、インデルが発生したヌクレオチド位置を示す。これは、多形位置が共に両方のヌクレオチドを示すように単一から二重ピークへのシフトによって表される(図4A)。削除または挿入された塩基対の数は、DNA鎖の1つが削除または挿入された塩基対の数によって他方より短くなるか、または長くなるように、実行終了時の単一のピークを数えることによって計算された。変異体からの配列検証済みgDNAをヘテロ接合量の同定のための基準として使用し、その後の世代のHRMA解析に役立つ事が推奨されます。類似のカーブが異なるクラスタに自動的に割り当てられる場合、カーブに手動で割り当てる必要があります。これは、温度シフトされた曲線と差分曲線を比較することによって行うことができます。サンプルをクラスターに適切に割り当てるには、ソフトウェアの手動調整が必要な場合があります。AaeZIP11とAeflightinと呼ばれる変異体のHRMAの結果は、ヘテロ接合ゴット、ホモ接合体、およびトランスヘテロ接合体を正常に分類するために個々のサンプル分析が必要であったことを示しています。最初に、ソフトウェアからの自動クラスタ割り当てでは、グループ間を適切に区別できませんでした (図 6A、図 6C、図 6E、図 6G)。次に、各サンプルを個別に分析し、ヘテロ接合、ホモ接合体、およびトランスヘテロ接合(シーケンシングによって以前に検証された)の参照サンプルとの類似性に基づいて正しいグループに割り当てられました(図6B、図6D、図6F、図6H)。

図1:SNP識別。 野生型からの AaeZIP11 フラグメントの複数配列アライメントの模式図表。赤はスナップで、緑色のフラグメントはSNPsを含まない。このSNPフリー領域は、sgRNAおよびプライマー設計に推奨される。略語: SNP = 一塩基多型;sgRNA = 単一ガイド RNA;LVP = リバプール株。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:HRMA用の蚊の足からゲノムDNAを得るための実験的手順。 (a)ピペット、チップ、PCRプレート、光学シール、リザーバ、希釈バッファー、およびDNA放出溶液を含むゲノムDNAを得るための材料。(B)DNA放出試薬及び希釈緩衝液を含有するPCRプレート調製物。(C) CO2を伴う蚊の麻酔。(D)試料間の汚染を防ぐために70%エタノールでピンセットを拭く。(E)ピンセット、蚊バイアル用ラック、麻酔蚊を含む氷容器の上のペトリ皿、および以前に調製されたPCRプレートを含む実験的なセットアップ。(F)蚊の脚の除去(G)DNA放出試薬溶液中に沈んでいる蚊の脚のズームビュー。(H)バイアルに入れた単一の蚊。(i)蚊の足を含むPCRプレートを密封する。略称: HRMA = 高分解能メルト分析 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:HRM解析の実験手順 (a) PCRミックスを含む96ウェルプレートに放出されたgDNAを移す。(B) 差分曲線の目視検査。(C) 96 ウェルテンプレート上の各サンプルに、それぞれの差分曲線の色と同じ色でマーキングします。(D) 同じクラスターから個人をバッククロスする。略語: HRM = 高解像度の融解;gDNA = ゲノム DNA。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4: AaeZIP11 変異体の配列解析 (a) AaeZIP11Δ56変異体のヌクレオチドアラインメント。黄色で強調表示されているダッシュは、削除されたベースです。ボックスでは、電解が単一のピークから二重ピークに移行し、削除が発生した位置(矢印)を示しています。(B)シーケンス実行の終わりの電解と、二重ピークから単一のピークへの遷移。単一のピークの数は、削除されたベースの数を表します (灰色の四角形)。プライマー配列は 補足表S1に提供される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:蚊の足から抽出したDNAのHRMA。 DNAは AaeZIP11 (A および B)および ミオフェム (C および D)ノックアウト Ae.アエジプティ 蚊から単一の脚から抽出され、HRMAによって分析された。 A および C は、サンプルの正規化された蛍光シグナルを1.0~0の相対値にすることを示す。 B と D は、ワイルド型の基準(リバプール株)から各曲線を差し引くことで曲線の倍率を示す。略語: HRMA = 高解像度の溶融解析;LVP = リバプール株;RFU = 相対蛍光単位。プライマー配列は 補足表S1に提供される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:エイフライトイン変異体に対する手動グループ割り当ての例。(A および C) メルト カーブ(正規化された線形スケール カーブと差分カーブ)は、精密メルト解析ソフトウェアによって自動的にグループ化されます。(B) 手動で変更された微分曲線の正規化。(D)微分曲線の正規化を変更した後、各サンプルは、対応する陽性制御の差分曲線のピーク温度(以前に配列決定されたサンプルがΔ4およびΔ5ヘテロジゴットおよびΔ4Δygotesによって識別される)によって個別に割り当てられ、3群の明確な同定が可能となった。赤と茶色の矢印は、異なる温度でピークを強調するために追加されます。(E-H)AaeZIP11変異体のHRMA。(E と G) メルト カーブはソフトウェアによって自動的に割り当てられます。(FおよびH)第2ヘテロ接合自己交差における変異体は、正規化された差曲線と以前に決定された参照との類似性(曲線で色分け)によって適切に正しいグループに適切に割り当てられた。ヘテロ接合法、ホモ接合体、トランスヘテロ接合法アスグ:精密溶融解析ソフトウェアによってメルト曲線を割り当て略語: HRMA = 高解像度の溶融解析;LVP = リバプール株;RFU = 相対蛍光単位。プライマー配列は補足表S1に提供される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足資料:CFX96リアルタイムシステム(例えば、バイオラッド)でHRMAを設定するための詳細なプロトコルは、このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。

補足図 S1: バイオ・ラッド CFX マネージャーでのサイクリングプロトコルのセットアップ手順をステップごとに説明します。 補足資料 2.1-2.3 を参照してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図 S2: バイオラッド CFX マネージャーでプレートのセットアップの手順を説明します。 補足資料 3.1-3.4 を参照してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図 S3: バイオ・ラッド CFX マネージャーでプレートのセットアップのステップバイステップの手順. 補足資料 3.5-3.6 を参照してください。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図 S4:バイオラッド CFX マネージャーでの実行のセットアップの手順を説明します。補足材料 4.1 を参照してください。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図 S5:バイオラッド CFX マネージャーの HRMA 分析の手順を説明します。補足資料 5.1-5.3 を参照してください。略称: HRMA = 高分解能メルト分析このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:プライマーのリスト。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は宣言する利害の対立を持っていません。