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方法論記事

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

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DOI：

10.3791/63013

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2021年9月27日

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1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、高速細胞圧延接着中に接着イベントを画像化するために、接着フットプリントアッセイを実行するための実験的手順を提示する。

要約

転動接着は、選択的に媒介される相互作用によって促進され、炎症部位に白血球を採用する上で非常に動的で受動的な運動性である。この現象は、血流が内皮細胞の転動で白血球を押し出す後毛細血管小胞で起こる。安定した転がりは、接着結合形成と機械的に駆動された解離との微妙なバランスを必要とし、細胞が流れの方向に転がり続けながら表面に付着したままにする。比較的静的な環境で発生する他の接着プロセスとは異なり、転がり細胞は毎秒数十ミクロンで数千ミクロンにわたって移動するので、圧着は非常にダイナミックです。その結果、トラクションフォース顕微鏡などの従来のメカノバイオロジー法は、短いタイムスケールと高感度が要求されるため、個々の接着事象および関連する分子力を測定するのには適していません。ここでは、P-セレクチン:分子レベルでの圧延接着におけるPSGL-1相互作用をイメージする接着フットプリントアッセイの最新の実装について説明します。この方法は、不可逆的なDNAベースの張力計テザーを利用して、蛍光トラックの形態で分子接着事象の永久履歴を生成する。これらのトラックは、(1)大きな視野を生み出すために何千もの回折限画像をつなぎ合わせ、長さ数千ミクロンにわたって各転球細胞の接着フットプリントを抽出し、(2)DNA-PAINTを実行して小さな視野内の蛍光トラックの超解像画像を再構築するという2つの方法で画像化することができます。本研究では、接着フットプリントアッセイを用いて、異なるせん断応力で転がるHL-60細胞を研究した。そうすることで、P-セレクチンの空間分布をイメージすることができました:PSGL-1相互作用と蛍光強度を通じて分子力に関する洞察を得ることができました。このように、この方法は、分子レベルでの圧延接着に関与する種々の細胞表面相互作用の定量的調査のための基礎を提供する。

概要

転がり接着カスケードは、循環細胞が血管壁1に沿ってどのようにテザーおよび転がするかを記述する。受動圧延は主に細胞接着分子(CAM)1の主要クラスであるセレクチンによって媒介される。血液のせん断流の下で、P-セレクチン糖タンパクリガンド-1(PSGL-1)を発現する白血球はP-セレクチンとの非常に一過性の結合を形成し、炎症を起こした内皮細胞の表面に発現し得る。このプロセスは、白血球が炎症部位に移行するために重要です2.さらに、PSGL-1はまた、P-selectin3との関与時に転がり接着カスケードのその後の堅接着段階を引き起こすことができるメカノイアセンセプターである。

CAM機能に影響を与える遺伝子変異は、白血球接着欠損症(LAD)の稀な疾患など免疫系に深刻な影響を及ぼし、転がりを媒介する接着分子の機能不全が重度の免疫不全個体4,5,6に至る。さらに、循環腫瘍細胞は、同様の圧延過程に従って移行することが示されており、転移7,8に至る。しかし、細胞の転がりは速く動的であるため、従来の実験的メカノバイオロジー法は、細胞転動時の分子相互作用を研究するのには適していません。原子間力顕微鏡や光ツイーツァーなどの単一細胞および単一分子操作法は、P-selectinのPSGL-1とPSGL-1との力依存相互作用などの分子相互作用を単一分子レベル9で研究することができたが、細胞転動中の生きた接着事象の調査には不向きである。さらに、インビトロで特徴付けられる相互作用は、生体内での分子接着に関する質問に直接答えることができない。例えば、細胞が本来の環境で機能している場合、生物学的に関連する分子張力範囲は何ですか?粘着力学simulation10や単純定常モデル11のような計算方法は、特定の分子の詳細を捉え、それらが転がり行動にどのように影響するか、モデリングパラメータおよび仮定の精度に大きく依存している。牽引力顕微鏡のような他の技術は細胞の移動の間に力を検出することができるが、十分な空間分解能または分子張力に関する定量的な情報を提供しない。これらの技術のいずれも、自生環境における細胞機能と挙動に直接関係する分子力の時間ダイナミクス、空間分布、および大きさの不均一性の直接的な実験的観察を提供することはできません。

そのため、転がり接着性の理解を深める上で、選択イン媒介相互作用を正確に測定できる分子力センサを実装することが重要です。ここでは、PSGL-1被覆ビーズが機能性テンションゲージテザー(TG)13 を提示する表面上に転がされる接着フットプリントassay12のプロトコルについて説明する。これらのTGは、蛍光読み出しの形で破裂事象の永久的な歴史をもたらす不可逆的なDNAベースの力センサーです。これは、TGT(dsDNA)の破裂後、破裂したTGT(ssDNA)を蛍光標識された相補鎖で標識することによって達成されます。このシステムの大きな利点の1つは、回折限と超解像イメージングの両方との互換性です。蛍光標識された相補鎖は、回折限定画像撮影のために永久に結合(>12 bp)、またはDNA PAINTを介した超解像イメージングのために一過性(7-9 bp)結合することができる。これは、TGがアクティブローリング中に破裂する際にローリング接着を研究するのに理想的なシステムですが、蛍光読み出しは転がり後に分析されます。また、2つのイメージング方法は、ローリング接着を調査する自由度をユーザに提供します。典型的には、回折限定画像は蛍光強度13を介して分子破裂力を抽出するのに有用であるが、超解像イメージングは受容体密度の定量的分析を可能にする。このアプローチは、圧延接着のこれらの特性を調査する能力を持ち、せん断流下の転動細胞の分子接着に関する力制御機構を理解するための有望なプラットフォームを提供する。

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プロトコル

1. オリゴヌクレオチド標識とハイブリダイゼーション

  1. プロテインGジスルフィド結合の還元
    1. 1mLの超純水にプロテインG(ProtG)10mgを溶かします。
      注:ここでのプロテインGは、C末端の単一のシステイン残基とN末端ポリヒスチジンタグで修飾されています。
    2. バッファー交換≥20 μL ProtG (10 mg/mL) を P6 カラムを使用して 1x PBS (pH 7.2) に交換します。
    3. バッファー交換後のタンパク質濃度を測定します。
      注:7-8 mg/mLの典型的な濃度。
    4. 120 mM トリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP)を90 μLの1x PBS(pH 7.2)に溶解し、次いで0.5 M EDTAの10 μLを調製します。
      注: TCEP は、新たに準備する必要があります。
    5. 120 mM TCEP (480 nmol) の 4 μL を ProtG (4-5 nmol) の 20 μL に加えます。
      注:タンパク質に対するTCEPのモル比は、100:1です。
    6. 室温(RT)で30分間反応を進行させます。
    7. P6 カラム(1x PBS、pH 7.2 で交換されるバッファ)を使用して、減少した ProtG から余分な TCEP を除去します。
    8. UV/Vis分光光度計で減少したProtGの濃度を測定し、スペクトルを保存します。
      注:典型的な濃度は3.5-4.5 mg/mL。
  2. スルホ-SMCCとのアミン標識 ssDNA 反応
    1. アミン標識 ssDNA (アミン-ssDNA) をヌクレアーゼを含まない水に 1 mM の濃度に溶解します。UV/Vis分光光度計でストランド濃度を確認します。
    2. 2 mgのスルフォ-SMCCを400μLの超純水と渦を混合して溶解して、新鮮な11.5 mMスルフォ-SMCC(スルフォ-NHSエステルとマレイミドを含むヘテロ二官能架橋剤)溶液を調製します。
    3. 1 mMアミン-ssDNA(6 nmol)の6 μLを11.5 mMスルフォ-SMCC(60 nmol)の5.2 μLに加え、1x PBS(pH 7.2)の88.8 μLを加えます。5 sの渦は、8600 x g で3分間遠心分離が続く。
    4. RTで30分間反応を進行させる。
    5. P6カラム(1x PBS、pH 7.2で交換されたバッファー)を有するSMCCコンジュゲートアミン-ssDNA(mal-ssDNA)から余分なスルホ-SMCCを除去する。
    6. UV/Vis分光光度計でmal-ssDNAの濃度を測定し、スペクトルを保存します。
      注:35-45 μMの典型的な濃度。
  3. プロトグ-ssDNA結合
    1. 4.5 mg/mLの21 μLを加え、ProtG(3 nmol)をmal-ssDNA(〜4-5 nmol)に加えます。
      注: ここでのボリュームと濃度は、典型的な値です。個々の実験測定に従って調整します。常に~1.5:1の比率でProtG上のmal-ssDNAの過剰な量を確保してください。
    2. 5sの渦を、RTで3時間進行させる反応を可能にする。
  4. プロトグ-ssDNAの精製と特性評価
    1. 磁気ニッケル-ニトリロトリアセク酸(Ni-NTA)ビーズとのタグ分離を介して結合プロトグ-ssDNAを精製します。
    2. P6カラム(1x PBS、pH 7.2で交換されたバッファー)を用いて、製品から余分なイミダゾール(Ni-NTA溶出バッファー)を除去します。
      注: イミダゾールは280 nmで有意な吸収を有するので、このステップは、結合を定量化するために不可欠です。
    3. UV/Vis分光光度計を使用して、製品ProtG-ssDNAのスペクトルとNi-NTA溶出バッファ(1x)を記録します。
      注: 260 nm および 280 nm の標準的な ProtG-ssDNA 吸光度は、それぞれ 0.8 および 0.6 です。
    4. ProtG と ssDNA に対する共役効率と比率を決定するには、カスタム記述 MATLAB スクリプト (補足コーディング ファイル 1) を使用して、以前に収集した 3 つのスペクトル (ProtG、SMCC-strand、Ni-NTA ビーズ溶出バッファー) に基づいて最終製品スペクトルを分解します。
      注: 簡単に説明すると、コードは手順 1.4.5~ 1.4.8 の手順で説明したとおりに動作します。典型的な濃度は、プロトグとssDNAを持つProtG-ssDNAの4μMであり、〜1:1モル比である(図2A)。
    5. 入力プロトグ、SMCC-ストランド、Ni-NTAビード溶出バッファー、および MATLAB スクリプトへの ProtG-ssDNA UV/Vis スペクトル
    6. 多次元非線形最小化を実行して、ソーススペクトル(ProtG、SMCC-strand、およびNi-NTAビード溶出バッファースペクトル)からProtG-ssDNAスペクトルを再構築します。
      注: 最小化関数は、ソーススペクトルごとに 1 つずつ、3 つの変換係数を出力します。
    7. スペクトルに対応する因子を掛け合わせ、変換されたソーススペクトルを組み合わせることにより、ProtG-ssDNAスペクトルを再構築します。
    8. ProtGおよびSMCC-strandの初期濃度に対応する変換因子を掛け合わせて、ProtG-ssDNA生成物におけるSMCC-ストランドとProtGの濃度を求めます。
    9. (オプション) 図 2B に従ってネイティブ PAGE を実行して、各コンポーネントとステップが期待どおりに動作することを確認します。
  5. TGT ハイブリダイゼーション
    1. T50M5バッファー(10 mM Tris、50 mM NaCl、5 mM MgCl2)でそれぞれ240 nMと200 nMの濃度で1.2:1のモル比でビオチン化された底鎖を持つProtG-ssDNA(上鎖)をハイブリダイズし、完全なTGTをハイブリダイズします。RT ≥1 hでハイブリダイズしましょう。

2. 表面のペギレーション

  1. 表面洗浄
    1. 8つのカバーリップごとに1つのエルレンマイヤーフラスコと2つの染色瓶をきれいにします。RTで1 M KOH溶液と1時間の超音波処理を各容器に充填し、徹底的に超純水で各容器を洗浄し、N2 またはオーブンで乾燥させます。
      メモ:KOHを上に充填して蓋に触れ、清掃してください。
    2. 各カバースリップを超純水で十分に洗い流し、洗浄された染色瓶の1つに入れます。
      注:お互いに、または汚れ瓶の壁に貼り付けされていないことを確認してください。
    3. ヒュームフードでは、250 mLビーカーに30 mLの過酸化水素(30%)を90mLの濃縮(95%-98%)硫酸を加えてピラニア溶液を作製します。
      注意:濃縮硫酸は腐食性が高い。過酸化水素を硫酸に非常にゆっくりと加え、慎重に渦巻いて混ぜます。
    4. ピラニア溶液で染色瓶にカバースリップを完全に浸します。カバースリップをピラニアに30分間煙のフードに入れておきます。
      注意:汚れ瓶を割るのを防ぐために注ぐ前に、ピラニア溶液を80°C以下に冷却してください。
    5. ピラニア溶液を1000 mLビーカーに捨て、ガラス洗浄から1M KOHで中和します。
    6. (オプション)ピラニア洗浄(ステップ2.1.3-2.1.5)を新鮮なピラニア溶液で繰り返します。
    7. カバーリップを大量の超純水ですすいで、残留ピラニア溶液をすべて除去します。取り除きが容易にするため、各上昇の間に染色瓶を軽く振ります(10リンスをお勧めします)。
    8. カバーリップをメタノールで3回リンスし、カバースリップ表面から水を取り除き、カバーリップをメタノールに沈めておきます。
  2. 表面のサイラン化
    1. 94mLのメタノール、1mLのアミノシラン、および5mLの氷酢酸を洗浄し乾燥したアーレンマイヤーフラスコに十分に混合して1%アミノシラン溶液を調製します。2番目の洗浄され、乾燥染色jar14に注ぎます。
    2. メタノール溶液の下に沈んだカバーリップを1%アミノシラン溶液を含む染色瓶に移し、瓶を覆い続ける。
      注:ガラス表面の空気への露出を制限するために、アミノシランに転送する際にカバーリップを乾燥させないでください。
    3. カバースリップを含む染色瓶を70°Cでアミノシランに1時間含有する染色瓶をオーブン15でインキュベートする。
    4. アミノシラン溶液を別の廃液に入れ、メタノールでカバーリップを5回メタノールでリンスし、アミノシラン溶液を除去します。
    5. 超純水で染色瓶のカバーリップを5回すすいで、N2で乾燥させます。
    6. 乾燥したカバーリップを110°Cのオーブンで20分間オーブンで染色瓶に入れ、焼きます。カバーリップをRTに冷却させ、PEGylationラックに置きます。
      注:表面15上の特定の化学的堆積を最小限に抑えるために、ベーク中に蓋で染色瓶を覆います。
  3. PEG ソリューションの準備
    1. PEG(ポリエチレングリコール)およびPEGビオチンを約30分間RTに解凍する。
      注:このステップはPEGのNHSエステルを低下させることができる水分凝縮を最小にする。
    2. 84mgの炭酸水素ナトリウムを10mLの超純水に加えてPEGバッファーを作ります。この製剤は、pH 8.4でバッファーを提供する必要があります。
    3. 8つのカバーリップの場合、それぞれ20:1 PEG:PEG-ビオチンを備えた1つのPEGylateed側:PEGの100mgとPEG-ビオチンの5mgを測定し、PEGバッファーの400 μLに加えます。最大速度(≥18000 x g)で1分間、30 sと遠心分離機の溶液をボルテックス。
      注:SVA NHSエステル加水分解はすぐに始まり、pH 8.0で34分の半減期を有し、pH 8.4で短い半減期を有するため、このステップは時間に敏感である。
  4. PEG インキュベーションおよびカバースリップストレージ
    1. 湿度室を設置し、カバースリップを内部に置きます。
    2. 湿度チャンバのカバースリップに90 μLのPEG溶液を追加し、カバースリップ保持ピンセットを使用してPEG溶液の上に2番目のカバースリップを置き、PEG溶液を均等に広げます。
    3. 溶液にカバースリップに落とされた泡がないことを確認します。最初のカバースリップの2番目のカバースリップの一方の端を下げ、カバーリップの間に挟まれた泡がないようにゆっくりともう一方の端を落とします。
      注: 気泡は、特定の領域が貧弱な PEGylateed を引き起こす原因となります。
    4. すべてのカバーリップがPEG(すなわち、8カバーリップ=4 PEGサンドイッチ)を持つまで繰り返します。PEG溶液を一晩(約12時間)に、暗闇の中の湿度チャンバーのRTでインキュベートする。
    5. カバースリップのペアを分離し、染色瓶に入れます。PEGylated の側面に注意してください。
    6. 超純水でカバーリップを十分に洗い流し、N2で乾燥させます。
      注:ピンセットでカバースリップを保持し、汚染物質が表面に乾燥するのを防ぐために、ピンセットに向かって表面を横切ってN2 を吹きます。
    7. 固定マーカーまたはダイヤモンドペンを使用して、コーナーに非 PEGylated 側を点でマークします。
    8. PEGylated側が互いに向いているメーラーチューブに2 PEGylatedカバースリップを置き、使用前にPEGylated側を識別するのに役立ちます。
    9. チューブを5分間真空にし、N2でバックフィルします。パラフィルムでチューブを密封します。
    10. 密閉されたメーラーチューブに-20 °CのPEGylatedカバーリップを6ヶ月間保管してください。
      メモ:チップアセンブリの前に、ストレージチューブをRTに温めます。シール中にカバースリップの凝縮は漏れを引き起こす。

3.フローチャンバーの準備

  1. チップアセンブリ
    1. カミソリの刃が付いた両面テープの両側に少量のエポキシを薄く広げる。
      注: あまりにも多くのエポキシは、組み立て中にチャネルに広がる可能性があります。
    2. エポキシコーティングテープをレーザーカットして、4つのチャンネルを作成します。4ホールスライドとPEGカバースリップの間にエポキシテープを挟んでフローチップを作成します(図1A)。
    3. ピペットチップを使用して、チャネルの長さに沿って穏やかな圧力をかけ、良好なシールを作成します。エポキシを≥1時間硬化させる。
      メモ:エポキシに対する滑りを避けるためにガラスをせん断しないでください。
  2. チャンバーアセンブリ
    1. 各チャンネルの開口部がアダプタの中央に配置されるようにチップを位置合わせします(図1A)。チップの上に透明なアクリルスペーサーを2つ置き、ブロックの中央にしっかりとした圧力をかけ、各スペーサーの端に2本の4-40ネジでねじ込みます。
      メモ:スクリューを無理に押したり、スペーサーを強く押したり、チップが割れる場合があります。
    2. ブラケットの反対側で、入り口をねじ穴にねじ込みます。透明アクリルブロックを通してシール状態を監視します。
    3. チューブがチップの開口部に接触する場合は、チューブを時計回りに軽くねじって接続を密封します。
      注:入り口を締め過ぎると流れが妨げられますが、接触が緩んでいると漏出が発生します。

4. 表面の準備

注: 全体的なワークフローについては 、図 1B を参照してください。

  1. 非特異的なバインドを防止するエージェントをブロックする
    1. ピペットを使用して200 μLの洗浄バッファー(10 mMトリス、50 mM NaCl、5 mM MgCl2 および 2 mM CaCl2、0.05% Tween 20)をチャンバーに流し、漏出がないか確認します。気泡がチャネルに形成された場合は、積極的に気泡を除去するために、さらに200 μLを押します。
      注: このステップで取り外されない大きな気泡は、後で表面の機能を取り除き、破壊することができます。
    2. 非特異的結合を防止し、10分間インキュベートするために、40 μLのBSA(1%w/v)をフローチャンバーに加えます。
    3. 各インキュベーション期間中に十分な量を追加して、流入口と出口でフローチャンバーを充填し、液滴を形成します。それに応じてインキュベーション量を調整し、湿度チャンバ内のすべてのインキュベーションを実行します。
    4. 40 μLの Tween 20 (5% v/v) をフローチャンバーに加えます。非特異的結合をさらに低減するために10分間インキュベートする。
    5. (オプション)チャネルを通してポリスチレンビーズを流すことによって十分なパッシベーションのための表面を確認してください。ProtGコーティングされたポリスチレンビーズ(0.01%w/v)の40 μLと、10倍の目的を持つダークフィールド顕微鏡を使用して画像を追加します。ビーズが表面に付着しない場合は、次のステップに進みます。
    6. 200 μL の洗浄バッファーでチャネルを洗浄し、すべてのパッシベーション剤を取り除きます。
  2. チャンバー表面機能化
    1. 40 μLのストレプトアビジン(100 μg/mL)をフローチャンバーに加え、20分間インキュベートします。その後、200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
    2. 40 μLのハイブリダイズプログ-TGT(100 nM)をフローチャンバーに加え、20分間インキュベートします。その後、200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
    3. ProtG-TGTトップストランド(100 nM)を40 μL20分間追加し、表面に未ハイブリッド化TGT底鎖を完成させます。200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
    4. 40 μLのP-セレクチンFc(10 μg/mL)をフローチャンバーに加え、60分間インキュベートします。その後、200 μL の洗浄バッファーで洗浄します。
      メモ:インキュベーションの持続時間は非常に重要です。

5. 実験とイメージング

  1. フローシステムの設定
    1. 5 mL ガラスシリンジにローリング バッファー (2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、0.1% BSA を使用した HBSS) を充填します。シリンジの側面をタップして泡を外し、先端に向かって浮くように押し出して、シリンジに気泡がないことを確認します。
    2. ポリエチレンチューブの約200ミリメートル(I.D:0.38ミリメートル)に滅菌針(26 G、5/8インチの長さ)を挿入します。O.D:1.09mm)をクリックし、針をガラス注射器に接続します。
      メモ:針コネクタのどこにも空気が閉じ込めないようにしてください。
    3. シリンジをシリンジポンプに固定し、気泡がチャネルに入るのを防ぐためにプランジャー側が上昇するようにシリンジポンプを傾けます。チューブの端部を流れチャンバの入口に挿入します。
      注:インレットに液滴を堆積させ、シリンジチューブの端に液滴を持つことによって接続を行う際に液体と液体の接触を確認してください。入口に挿入する前に、シリンジチューブの端に小さな落下を形成させることによって、気泡がチャネルに入らないようにします。
    4. 別の200mmのポリエチレンチューブの一方の端を出口に挿入し、もう一方の端を廃棄物ビーカーに沈めます。
  2. セルローリングの設定
    1. 25 cm2 換気培養フラスコで HL-60 細胞を成長させる 20% 牛血清と 5% CO2 で 37 °C で 1% 抗生物質を補った IMDM メディアで.1 x 105-2 × 106 セル/mL の間のセル密度を維持します。
    2. (オプション)初期密度2 x 105細胞/mLで1.25%DMSOを含む完全なIMDM培地でHL-60細胞 を区別します。5〜6日間最も活性となる細胞をインキュベートする。
    3. 細胞懸濁液と遠心分離機(200 x g,3分)からサンプル(1〜2 mL)を採取し、細胞をペレットにします。
    4. 培地を取り出し、転がりバッファーの500 μLで細胞を静かに再懸濁します。洗浄工程を2回繰り返して、細胞の破片を除去します。
    5. ヘモサイトメーターで細胞密度を測定します。転がりバッファーを持つセルペレットを 2 x 105 細胞/mL の密度に再懸濁します。
    6. インレット/出口からチューブを慎重に取り外し、40μLの細胞懸濁液をフローチャンバーに取り出します。前述のようにチューブを再接続し、フロー チャネルに気泡が入らないようにします。
    7. 所望の流速でシリンジポンプを開始して細胞の転がり実験を開始します。
      注:蛍光トラックの強度はせん断応力に依存し、低いセル速度のせん断応力/細胞速度は一般的に調光トラックを生成します(図4A)。表面の高いセル密度や過度の転がり時間を避けて、分離可能な単一セルトラックを確保します(図4B、C)。
    8. 細胞の転がりが観察されることを保障するために10xの目的の暗視野の顕微鏡を使用しなさい。
    9. 実験が完了したら、100 mL/hのローリングバッファを表面が無細胞になるまで注入して、チャネルから細胞を取り除きます。
  3. 「ナノスケール地形におけるDNAベースの点蓄積」による局所的な軌跡のイメージング(DNA-PAINT)
    1. 40 μL の DNA-PAINT イメージャーストランド (500 pM) を DNA-PAINT バッファー (0.05% Tween-20, 5 mM トリス, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) に加えます。
    2. 100x油浸性TIRF対物レンズを使用して、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡を行います。電子乗算電荷結合デバイス(EMCCD)カメラを使用して、電子乗算(EM)ゲイン300でフレームあたり25 msの露出時間を持つ40000以上のフレームを獲得します。
    3. 手順 5.3.4~5.3.5 に従って、超高解像度イメージ (図 4D) をローカライズおよびレンダリングするには、ピカソソフトウェア package17 を使用します。
    4. DNA-PAINTムービーをローカライズプログラムにロードして、各フレーム内の各蛍光色素の局在を決定します。
      注: フルオロフォアだけが正確に追跡されるまで、ボックス側の長さと最小のネットグラデーションのパラメータを最適化します。Min. ネットグラデーションパラメータは、多くの場合、最適なトラッキングを達成するために100000を超えることができます。フィット設定:MLE、統合ガウス法は最良の結果を生成します。最後に、ムービーが長すぎる場合は、最終的な hdf5 ファイルに再結合する前に、Localize のプレビュー トラッキングが正しく動作するように、10000 フレームのスタックに分割します。
    5. 次に、結果の hdf5 ファイルを Render プログラムにロードして、ドリフト補正とレンダリングを実行します。
      注意: RCCによるアンドリフトを 介して複数のドリフト補正を実行して、最終結果を改善します。
  4. 永久的なラベル付けによる長いトラックのイメージング
    1. 永久イメージャーストランドを追加し、T50M5バッファに120 sのインキュベートを行います。200 μLの洗浄バッファーを注入して、チャネルを洗浄します。
    2. 励起レーザーをオフにして画像を記録し、カメラの背景ノイズを取得します。TIRF顕微鏡法によるグリッドパターンの大きな領域を画像化します。
      注記:フレームオーバーのオーバー≥10%のオーバーラップは、後続のステッチに推奨されます。
    3. 400 x 50画像(合計20000枚)の領域をスキャンするように顕微鏡をプログラムします。フィジープログラムを使用して、生データを個々のTIFFファイルに分割し、それぞれに最大10000枚の画像が含まれています。
    4. イルミネーション プロファイル(図 3A-C)を使用してすべてのイメージを平らにします(図 3A-C) 手順 5.4.5~5.4.7 に従います。
    5. すべてのフレームからバックグラウンドカメラのノイズを減算します。背景から減算されたフレームの平均スタック投影(照明プロファイル)を取得します。
    6. 最大値で照度プロファイルを正規化します。すべての背景を減算したフレームを正規化された照明プロファイルで割ります。
    7. 修正したフレームを、対応するビット深度に対応する適切な範囲に再スケールします。
    8. MIST18 を使用して画像をステッチします(図 3D、E)。

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結果

上記のプロトコルは、接着フットプリントアッセイの実験手順を説明する。一般的な実験ワークフローを 図1に示し、流れチャンバアセンブリ(図1A)から表面官能化(図1B)および実験およびイメージングステップ(図1C)までを示す。

図2 は、ProtG-ssDNAバイオコンジュゲーション特性評価の代表的な結果である。最終製品における3つの成分のUV/Visスペクトル、すなわち、ProtG、mal-ssDNA、およびイミダゾール溶出緩衝液を、最終的な結合の前に収集した(図2A)、それぞれ既知の濃度に対応する。これらのスペクトルは、3つの未知のパラメータがそれらの濃度である生体共役生成スペクトルに適合するための直交基礎を形成する。MATLA...

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ディスカッション

接着フットプリントアッセイにより、細胞圧延接着中のPSGL-1とP-セレクチン間の分子接着事象の可視化が可能になります。このプロセスは、P-selectin媒介捕捉によって開始され、その後、流体せん断応力下での転がりが続きます。実験中の潜在的な問題は、通常、細胞がうまく転がっていても、細胞の転がりが悪かったり、蛍光トラックが欠落したりする。これらの問題は、多くの場合、プロトコルの重要なステップでの品質管理が原因で発生します (表 1)。

表面調製には複数のステップが必要なため、汚染を防ぐために生体分子とバッファーを4°Cで濾過して保管する必要があります。高品質の表面パッシベーションは、適切な表面官能化密度を達成し、生体分子の非特異的結合を低減するための要件です。表面に生体分子の非特異的結合は、高い蛍光の背景を作成することができ、単一分子蛍光イメージングおよび統計データ分析を妨害する。複数の要因が表面のパッシベーションに影響を与える可能性があります。アミノシランおよびPEG-NHSの加水分解は、PEGylationのはるかに低い効率をもたらす。十分...

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開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

この研究は、カナダイノベーション財団(CFI 35492)、カナダディスカバリーグラント自然科学工学研究評議会(RGPIN-2017-04407)、研究基金のニューフロンティア(NFRFE-2018-00969)、マイケル・スミス健康研究財団(SCH-2020-0559)、ブリティッシュコロンビア大学エミンズ基金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4チャンネルドリルガイドABSフィラメントで3Dプリントされたカスタムメイド
4穴スライドカスタムメイドアルミクランプの8-32ネジ穴の中心と一致するレイアウトの4チャンネルドリルガイドに、ダイヤモンドコーティングされたドリルビットを備えたドレメルを使用して、きれいな顕微鏡スライドをドリルします。
アセトンVWRBDH1101-4LP
アクリルスペーサーカスタムメイド40 mm x 30 mm x 2.5 mmの寸法のアクリルシートの2つのブロックをカットします。各ブロックに、アルミニウムホルダーの4〜40個の穴と正確に位置合わせされた2つの3mmの穴を開けます。
アルミチップホルダーカスタムメイド外形寸法640 mm x 500 mm x 65 mm、開口部寸法400 mm x 380 mm x 65 mmのC字型ホルダーに機械陽極酸化アルミニウムブロックを折りたたむインレットとアウトレットは8-32スレッドでタップされています。
アミノシランAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
/抗真菌溶液Cytiva HyCloneSV3007901ペン/連鎖球菌/菌類
ビーズ、ProtGコーティングポリスチレンSpherotechPGP-60-5
シ血清アルブミンVWR332
バッファー、DNAペイント0.05%Tween-20、5 mMトリス、75 mM MgCl<サブ>2、1 mM EDTA
バッファー、T50M510mM Tris、50 mM NaCl、5 mM MgCl2
バッファー、ローリングHBSS with 2mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM Hepes、0.1% BSA
バッファー、10mM Tris、 50 mM NaCl、5 mM MgCl2および2 mM CaCl2、0.05% Tween 20
塩化カルシウムVWRBDH9224
細胞培養フラスコVWR10062-868
濃硫酸VWRBDH3072-2.5LG95-98%
カバースリップ保持ピンセットTechni-Tool758TW150
ダイヤモンドコーティングドリルビット研磨技術C5250510 0.75 mm ダイヤモンドドリル
DNA、アミン-ssDNA(上鎖)IDT DNAカスタムオリゴCCGGGCGACGCAGGAGGGG /3AmMO/
DNA、ビオチン-ssDNA(下鎖)IDT DNAカスタムオリゴ/5ビオチンTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA、DNAペイント用イメージャー鎖IDT DNAカスタムオリゴGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA、永久標識用イメージャーストランドIDT DNAカスタムオリゴCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
両面テープスコッチ2373/4インチ幅、永久両面テープ
EDTAサーモフィッシャー155750200.5 M EDTA、pH 8.0
エポキシゴリラ420015分間硬化時間
ウシ胎児血清(FBS)アバンター97068-085
GelGreenBiotium41005
氷酢酸VWRBDH3094-2.5LG
ガラス、カバーガラスフィッシャー サイエンティフィック12-548-5P
ガラス、顕微鏡スライドVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
ガラス、染色ジャーVWR74830-150ウィートン染色ジャー (900620)
ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)ロンザ04-315Q
血球計算盤Sigma-AldrichZ359629-1EA
HL-60細胞ATCCCCL-240
湿度チャンバースライドサポートABSフィラメントでカスタムメイド
過酸化水素VWRBDH7690-130%
イミダゾールSigma-AldrichI2399
インレット/アウトレットカスタムメイドコバルトドリルビットを使用して 8 本の 8-32 止めネジをドリルスルーします。挿入 1.5 cm ポリエチレンチューブ(タイゴン、I.D. 1/32 "O.D. 3/32")を各中空止めねじに
Iscove Modified Dulbecco Media(IMDM)Lonza12-722F
塩化マグネシウムVWRBDH9244
磁性Ni-NTAビーズInvitrogen10103D
メーラーチューブEMSEMS71406-10
ノールVWRBDH1135-4LP
マイクロバイオスピンP-6ゲルカラムBiorad7326200SSC
バッファーPEGレイサンバイオMPEG-SVA-5000
PEG-ビオチンレイサンバイオビオチン-PEG-SVA-5000
酸化カリウムVWR470302-132
タンパク質、タンパク質GAbcamab155724N末端HisタグおよびC末端システイン
タンパク質、P-セレクチン-FCR&D系統137-PS組換えヒト P-セレクチン/CD62P fc キメラ蛋白質、CF
蛋白質、ストレプトアビジンシダーランCL1005-01-5MG
ポンプシリンハーバード704801
重炭酸ナトリウム病棟科学470302-444
塩化ナトリウムVWR97061-274
スルホ-SMCCサーモフィッシャー22322
シリンジハミルトン81520シリンジ PTFEルアーロック付きシリンジ、5mL
シリンジニードルBD305115プレシジョングライド 26 G、5/8 インチ長
TCEPシグマ-アルドリッチC4706-2G
トリスVWRBDH4502-500GP
チューブ、アダプタータイゴンABW00001フォーミュレーション 3350、内径 1/32"; O.D. 3/32"
チューブ、ポリエチレンBD イントラメディック427406イントラメディック (PE20) 内径 0.38mm; 外径 1.09mm
Tween-20Sigma-Aldrich93773
抗生物質ウ3Dプリントメタ水ジ

参考文献

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P PSGL 1 DNA PAINT
接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング
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