細菌グリコーゲン粒子の分子構造解析のための非分解的抽出法

Summary

細菌のグリコーゲン構造は、分子の分解や偏ったサンプリングを引き起こす可能性のある抽出方法によって大きく影響を受けます。これらの問題を最小限に抑えるための方法を開発することが不可欠です。ここでは、抽出アーチファクトを最小限に抑えるための主要な基準として、サイズ分布とチェーン長分布を使用して、4つの抽出方法を比較しました。

Abstract

現在、グリコーゲンの空間構造を損傷するか、グリコーゲンを部分的にしか抽出しないさまざまなグリコーゲン抽出方法が存在し、グリコーゲンの微細分子構造のバイアスがかかっています。グリコーゲン構造の動的変化や細菌中のグリコーゲン粒子の多様な機能を理解するためには、分解を最小限に抑えてグリコーゲンを単離することが不可欠です。本研究では、糖密度勾配超遠心分離法(SDGU-CW) による 冷水(CW)沈殿法により、軽度のグリコーゲン単離法を実証した。比較のために、従来のトリクロロ酢酸(TCA)法と水酸化カリウム(KOH)法も実施しました。この研究では、一般的に使用される実験室株である 大腸菌 BL21(DE3)をモデル生物として使用し、デモンストレーション目的で使用しました。グリコーゲン粒子をさまざまな方法で抽出した後、粒子径分布についてはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で、直線鎖長分布では蛍光色素支援キャピラリー電気泳動(FACE)により、その構造を解析し、比較しました。この分析により、 SDGU-CWで 抽出したグリコーゲンの分解が最小限であることが確認されました。

Introduction

グリコーゲンは、グルコシル残基と少量ではあるが大量のタンパク質からなる高度に分岐した多糖類であり、すべてのグルコシル残基は、直鎖のα-1,4-グリコシド結合と分岐点¹のα-1,6-グリコシド結合を介して結合されています。グリコーゲン粒子の構造は、一般的に、1)短鎖オリゴマー、2)球状β粒子(直径~20nm)、3)直径が約300nmまでのβ粒子が凝集した大きなロゼット状のα粒子の3つの階層に分けられます。近年、真核生物ではグリコーゲン粒子αが壊れやすい状態と安定な状態の2つの構造状態を持っていることが分かってきました。ここで、脆弱性とは、DMSO²のようなカオトロピック剤の存在下で、大きなα粒子が小さなβ粒子に解離することを意味します。さらなる分析により、糖尿病性肝臓のグリコーゲンα粒子は一貫して壊れやすく³、壊れやすいα粒子は安定した^{α粒子よりもはるかに}速く分解することがわかりました4。したがって、グリコーゲンの構造的脆弱性は、糖尿病^の高血糖状態を悪化させる可能性があり^2,4、これにより、脆弱なα粒子は分子レベルで糖尿病の潜在的な病理学的バイオマーカーになります。しかし、原核生物におけるグリコーゲンα粒子の存在は散発的にしか報告されておらず⁵、細菌におけるグリコーゲンα粒子の2つの異なる構造状態についての報告はありません。

細菌のグリコーゲン粒子の生理機能を理解するためには、グリコーゲン分子の微細構造を決定することが不可欠であり、そのためには最大の収量と最小限の分解でグリコーゲンを分離する必要があります¹。これまでに、グリコーゲン抽出には、熱水抽出、トリクロロ酢酸(TCA)抽出、および高温アルカリ(水酸化カリウム、KOH)抽出⁶を含むがこれらに限定されないさまざまな技術が開発されてきました。さらに、真核生物のグリコーゲン単離に一般的に使用される別の方法である糖密度勾配超遠心分離(SDGU)法も、Selenomonas ruminantiumおよびFibrobacter succinogenesの細菌グリコーゲン単離について報告されています^7,8。これらの方法の長所と短所は真核生物の研究^9,10で広く議論されていますが、グリコーゲン粒子構造の観点から細菌のさまざまな抽出方法によって単離されたグリコーゲン微細構造の比較研究はほとんどありません。

本研究では、 大腸菌 BL21(DE3)をモデル生物として、この問題に取り組みました。TCA沈殿温水抽出法(TCA-HW)、TCA沈殿水抽出法(TCA-CW)、高温30%KOH溶液抽出法(KOH-HW)、ショ糖密度勾配超遠心法による冷水抽出法(SDGU-CW)の計4つのグリコーゲン抽出法を比較した。次に、グリコーゲンの粒度分布をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC) で 測定し、鎖長分布を蛍光色素補助糖質電気泳動(FACE) で 検出しました。これらはどちらも抽出法の品質評価に使用されました。さらに、一般的に使用されるカオトロピック剤であるジメチルスルホキシド(DMSO)で処理する前後の粒子サイズ分布を比較することにより、細菌グリコーゲンα粒子の安定性と脆弱性もさまざまな抽出方法間で比較しました。グリコーゲン抽出と構造特性評価の詳細な手順を以下に示します。要約すると、SDGU-CW法はグリコーゲン構造的完全性の点で全体的に最高の効果を持っているため、将来の関連研究で細菌グリコーゲン抽出に推奨されます。

Protocol

1. 細菌の培養と収集

1. 細菌性グリセロールストック(-80°C)から 大腸菌 BL21(DE3)を滅菌LB寒天プレート(10 g / Lトリプトン、5 g / L酵母抽出物、10 g / L NaCl、および15 g / L寒天)に接種することにより蘇生します。プレートを標準的なインキュベーターに入れ、37°Cで一晩培養します。
2. 1つのコロニーをピックアップし、10 mLの滅菌LB液体培地(10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母抽出物、および10 g/L NaCl)に接種します。ボルテックスと培養 により 、220rpmで振とうしながら37°Cで一晩よく混合します。
   注:特に指定のない限り、すべての液体培養条件は37°C、振とう速度は220rpmでした。
3. 1 mLのオーバーナイト 大腸菌 培養液を100 mLの滅菌LB液体培地に移し、5時間培養します。0.8% D-(+)-グルコースを含む1x M9最小培地(3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、6.78 g/L Na₂HPO₄、1 g/L NH₄Cl)を50 mL1 Lに移します。よく混ぜ合わせ、20時間培養します。
   注:1x M9最小培地とグルコースを別々に滅菌し、室温まで冷やすときに無菌的に混合しました。
4. 20時間培養後、細菌溶液を6,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を捨てます。細胞ペレットを-80°Cで一晩保存し、その後、ペレットを凍結乾燥します。
5. 凍結乾燥された細菌粉末を密封して冷蔵庫(-20°C)に保管し、後で使用します。

2. グリコーゲン抽出

1. トリクロロ酢酸沈殿温水抽出(TCA-HW)
   1. 500 mgの凍結乾燥 大腸菌 BL21(DE3)粉末を正確に秤量し、20 mLの氷冷0.05 Mトリエタノールアミン(TEA)緩衝液に再懸濁します。超音波セルクラッシャー(25%エネルギー、4°C)を使用して、細菌細胞を3分間(30秒の作業サイクルと2秒の間隔)破壊します。溶液中に明らかなペレットがないことを確認してください。
      注:細胞破壊は氷上で行われました。HCl添加によりTEA緩衝液のpHをpH7に調整し、室温で保存してください。
   2. すべての細菌ホモジネートを2本の10.4 mL超遠心チューブ(10 mL/チューブ)に移します。チューブの上部に脱イオン水を入れ、4°Cの超遠心分離機で104,000 x g で90分間遠心分離します。上清を捨てます。
   3. 2 mLの脱イオン水を加えて、各チューブにペレットを再懸濁します。懸濁液を50 mLの遠心分離チューブに移し、脱イオン水を最終容量20 mLまで加えます。5分間加熱して沸騰させ、すべてのタンパク質を変性させます。
   4. 懸濁液を18,000 x g で10分間遠心分離し、上清(S1)を保持します。沈殿物は、ステップ 2.1.3 と同じように扱います。新しい上清 (S2) を S1 とプールします。
   5. 上清(S1 + S2)に50%TCA(0.1容量)を加え、混合物を氷上に10分間置いて、DNA、RNA、タンパク質などの高分子を沈殿させます。混合物を18,000 x g で10分間遠心分離し、上清を1.5容量の無水エタノールと混合します。
      注:TCAの濃度は50%v / vです。保管の際は、光を避けて保管してください。
   6. グリコーゲンを氷上で20分間沈殿させ、18,000 x g で10分間遠心分離します。上澄みを注ぎます。
   7. ペレットを5mLの_ddH2Oに溶解し、次に5mLの氷冷無水エタノールを加えます。溶液を4°Cで一晩インキュベートし、18,000 x g で10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを保管します。
   8. ステップ2.1.7のような「洗浄と沈殿」のステップをさらに2回繰り返します。
   9. 最後に、沈殿したグリコーゲンを 2 mL チューブ内の 400 μL の ddH₂O に溶解し、-80 °C で予備凍結し、凍結乾燥して乾燥グリコーゲン粉末を得ます。
2. トリクロロ酢酸沈殿冷水抽出(TCA-CW)
   注:TCA-CW法はTCA-HW法と同じですが、上清を廃棄した後、ペレットを沸騰させずに処理し(ステップ2.1.3を参照)、1 mg/mLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む20 mLのddH₂Oに再懸濁します。
   1. 1 mg/mLプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を調製するには、50 mgのプロテアーゼ阻害剤カクテルを1 mLの脱イオン水に溶解し、50:1の割合で希釈します(脱イオン水:プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液)。
3. ショ糖密度勾配超遠心分離法(SDGU-CW)による冷水抽出
   1. 1 gの凍結乾燥 大腸菌 粉末を4 mLのグリコーゲン抽出バッファー(GEB)に1 mg / mLプロテアーゼ阻害剤カクテルとともに溶解してホモジナイズします。
      注:GEBは、50 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF、および5 mMピロリン酸ナトリウムで構成されています。GEBはHClでpH 8に調整する必要があります。
   2. 超音波セルクラッシャー(25%エネルギー、4°C)を使用して、細菌細胞を3分間(8秒の作業サイクルと9秒の間隔)破壊します。すべてのプロセスが氷上で実行されることを確認してください。超音波処理後、細菌ホモジネートを遠心分離チューブに移し、最終容量10mLまでGEBを充填し、チューブをボルテックスして混合します。
      注意: 発生する熱がグリコーゲンを劣化させる可能性があるため、長時間均質化しないでください。
   3. 6,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を10.4 mLの超遠心チューブに移し、チューブの上部までGEBを充填した後、360,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
      注意: チューブがいっぱいになっていて、気泡が存在しないことを確認してください。
   4. 遠心分離後に上清を廃棄し、沈殿物を2 mLの脱イオン水で再懸濁します。
   5. 新しい超遠心チューブで、4 mLの75%ショ糖溶液と4 mLの37.5%ショ糖溶液をゆっくりと重ねます。次に、ステップ2.3.4で得られた懸濁液をショ糖溶液の上に重ね、脱イオン水を補充します( 図1を参照)。
      注:ショ糖濃度は75%[v / v]および37.5%[v / v]です。ショ糖密度勾配を作成するときは注意し、2つのショ糖溶液の間に観察可能な層があることを確認してください。また、超遠心チューブ内に気泡がないことを確認してください。
   6. 360,000 x g で4°Cで2.5時間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを200μLの脱イオン水に溶解します。グリコーゲン沈殿のために800μLの無水エタノールを添加します。
   7. グリコーゲンを-20°Cで一晩沈殿させます。4,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。
   8. 得られたペレットを2 mLチューブ内の400 μLのddH₂Oに溶解し、-80°Cで予冷し、凍結乾燥して乾燥グリコーゲン粉末を得ます。乾燥グリコーゲン粉末は、構造解析のために4°Cで保存してください。
      注: 詳細な手順を 図 1 に示します。
4. ホット30%水酸化カリウム溶液抽出(KOH-HW)
   1. 凍結乾燥した 大腸菌 粉末(50 mg)を30% [w/v] KOHの1 mLで1時間煮沸します。
   2. 15 mM LiClを含む67%[v/v]エタノールを添加し、-20°Cで少なくとも1時間沈殿させます。サンプルを16,000 x g 、4°Cで20分間遠心分離します。
      注:15 mM LiClを含む67%[v / v]エタノールには、0.6358 gのLiCl、67 mLの無水エタノール、および33 mLの脱イオン水が含まれています。
   3. ペレットを1mLのddH₂Oに再溶解し、断続的に攪拌しながら95°Cで10分間加熱します。
   4. ステップ2.4.2で説明したように、エタノール沈殿ステップをさらに3回繰り返します。最終ペレットを2 mLチューブ内のddH₂O400 μLに再溶解し、-80°Cで予冷し、凍結乾燥して乾燥グリコーゲン粉末を得ます。

3. グリコーゲン構造の決定

1. 透過型電子顕微鏡(TEM)
   1. グリコーゲン粉末を50 mMトリス緩衝生理食塩水(pH 7)に最終濃度1 mg/mLで再懸濁します。
   2. 懸濁液を10倍に希釈し、希釈した懸濁液をグロー放電400メッシュの銅グリッドに塗布します。
   3. 2分後、濾紙を使用して余分なサンプルをグリッドから引き出し、1%酢酸ウラニルを2〜3滴垂らしてグリッドを染色します。
   4. 75 kVで動作する透過型電子顕微鏡を使用して、調製物を調べます。
2. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
   1. 移動相の調製:0.02%(w/w)アジ化ナトリウム溶液と50 mM硝酸ナトリウム溶液を脱イオン水に調製し、0.45 μmのフィルターメンブレンでろ過します。超音波振動水浴を使用して、溶液を15分以上超音波処理し、気泡を除去します。
   2. サンプル調製:移動相を使用してグリコーゲン粉末を溶解し、最終濃度が1 mg/mLになるようにします。溶液を80°Cで一晩、サーモミキサーでインキュベートします。溶解したサンプルを室温で6,000 x g で10分間遠心分離し、上清を標準的なSECバイアルに移します。
   3. DMSO処理グリコーゲンサンプルの調製
      1. グリコーゲン粉末1 mgをDMSO300 μLに溶解し、サーモミキサーで80°Cで一晩インキュベートします。4 倍容量のエタノールを加えてグリコーゲンを沈殿させ、溶液を 6,000 x g で遠心分離します。
      2. ペレットをエタノールで2回洗浄し、ペレットをddH₂Oに溶解し、凍結乾燥します。
      3. 凍結乾燥グリコーゲン粉末を SECで 分析し、上記のようにサンプルを調製します。
   4. プレカラム、1000カラム、10000カラム、10000カラムを備えたSECシステムを使用して、グリコーゲンの粒度分布を分析します。カラムを 80 °C に保ち、流速を 0.3 mL/分に保ちます。
3. 蛍光色素補助炭水化物電気泳動(FACE)
   1. グリコーゲンのデブランチ
      注:FACEを使用して鎖長分布(CLD)を検出する場合、試験するすべてのサンプルはデブランチの前処理を受ける必要があります。
      1. グリコーゲン粉末0.5 mg、熱水90 μL(90 °C)、NaN₃ 溶液1.5 μL、イソアミラーゼ3.5 μL(200 U/mL)、酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液8 μL(pH 3.5)を試験管に加えます。
         注:イソアミラーゼは、試験するサンプルの分岐鎖を特異的に切断するために添加されます。イソアミラーゼは、α-(1-4)結合を破壊することなくα-(1-6)結合を特異的に破壊できる脱分岐酵素であるため、主鎖の構造を破壊することなくグリコーゲン側鎖を特異的に切断できます。
      2. 混合物を37°Cで3時間、サーモミキサーでインキュベートします。8 μLの0.1 M NaOH溶液でpHを中性にした後、混合物を80°Cで1時間サーモミキサーでインキュベートします。
      3. 混合物に4倍量の無水エタノールを加えて、グリコーゲンを沈殿させます。その後、6,000 x g で室温で10分間遠心分離します。ペレットをエタノールで2回洗浄し、ペレットをddH₂Oに溶解して凍結乾燥します。
   2. 蛍光溶液の調製
      1. APTS(8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム塩)試薬ボトル(各ボトルに5 mgのAPTSが入っています)を4,000 x g で2分間遠心分離します。15%酢酸溶液50μLを加えて粉末を溶解し、よく混合し、室温で4,000 x g で2分間遠心分離して、0.2 M APTS酢酸溶液を得ます。
         注:APTS溶液は-20°C.It 冷蔵庫に保管し、開封後2週間以内に完全に使用する必要があります。それ以外の場合は、非アクティブ化されます。APTSは、グリコーゲン鎖の還元末端に結合する、一般的に使用される負に帯電した色素です。重合度(DP)の異なる鎖はすべて1つの負電荷しか持たないため、FACEは、異なる質量電荷比に基づいてそれらを分離できます。このようにして、異なるDP値の信号が蛍光検出器によって検出されます。
   3. 分枝したグリコーゲンを試験管に移し、1.5 μLのAPTS溶液と1.5 μLのシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加えます。暗所で60°Cで1.5時間インキュベートします。脱イオン水80μLを加え、4,000 x g で室温で10分間遠心分離し、上清を保ってください。
   4. 0.5 psi(大気圧より3.4 kPa高い)で3秒間注入することにより、サンプルをキャピラリー電気泳動システムに導入します。
      注:蛍光標識された線状グルカンは、30kVの印加電圧と25°Cで約14mAの電流によって分離されました。 ピーク面積は、質量の異なるグルカンの相対量を示しました(隣接するピークのグルカンの重合度(DP)は 1 DP 異なりました)。サンプル温度は18°Cに保たれました。

Results

グリコーゲン粒子のサイズ分布
一連の研究により、糖尿病肝臓のグリコーゲンα粒子は壊れやすく、水素結合かく乱物質であるDMSO 11,12,13,14で簡単に分解できることが示されています。本研究では、4つの異なる方法で抽出された細菌グリコーゲンの粒子サイズと構造安定性がどのように変化するかを検証しました。4 つの方法のすべてのグリコーゲンサンプルを水(青の曲線)と DMSO(赤の曲線)でそれぞれ処理しました。重み分布 w(logR_h) を図 2 に示します。TCA-HW(図2A、青の曲線)およびTCA-CW(図2B

Discussion

グリコーゲンは、多くの細菌で確認されている重要なエネルギー貯蔵庫です¹⁶。グリコーゲン粒子の生理機能を解剖するためには、グリコーゲン分子の微細構造をより深く理解することが不可欠です。これまでに、細菌培養物からグリコーゲンを抽出するためのさまざまな方法が開発されてきました。しかし、抽出方法によってグリコーゲン粒子のサイズ分布が異なることが観察されており、グリコーゲンの構造が損傷していることが示唆されています。したがって、異なる研究のグリコーゲン構造が同等であることを確認するために、抽出手順を比較して標準化する必要があります。この研究では、 大腸菌 の液体培養物からのグリコーゲン抽出に一般的に使用される4つの方法を説明する詳細なプロトコルが提示され、グリコーゲン粒子の構造特性評価を通じて評価されます。

サイズ分布については、TCA-CWおよびTCA-HWの両方からのグリコーゲン粒子は、R_h ≈ 20 nm(β粒子)...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SECシステム	Agilent	1260 infinity II	粒度分布
分析カラム	PSS	10-1000	-
遠心分離	エッペンドルフ	5420	-
フィルター膜	Cambio	Km-0220	-
蛍光支援キャピラリー電気泳動システム	ベックマン・コールター	チェーン	長分布
凍結乾燥機	Xinzhi	SCIENTZ-10N	細菌とグリコーゲンの凍結乾燥
フリーザー	サーモフィッシャー	Forma 900	サンプル保存
ガードカラム	PSS	SUPPERMA	イン
キュベーター	サーモフィッシャー	PR505750R-CN	-
低速大容量遠心機	Hexi	HR/T20MM	サンプル遠心分離機
Multiskan FC マイクロプレートリーダー	サーモフィッシャー	1410101-Optima
XPN 超遠心機	Beckman	XPN-100/90/80	グリコーゲン
用 Oscillator	Xinbao	SHZ-82-PA-800
Plus System	Beckman Coulter	A66528-pH
メーター	ラートレド	FE28-TRIS	-
屈折率検出器	ワイアット	Optilab T-rEX
-冷蔵庫	アール	BCD-406WDPD	-
サーモミキサー	上海Jingxin	JXH-100	サンプルインキュベーション
透過型電子顕微鏡	立製作所	H-7000	グリコーゲン粒子形態
超遠心チューブ	ベックマン	355651
-超音波細胞破砕機	寧波新志	Scientz-IID	バクテリア攪乱器
超音波振動水浴	Jietuo	JT-1027HTD	-
ボルテックス	ミキサーTiangen	OSE-VX-01	-
水システム	メルクミリポア	H2O-MM-UV-T	脱イオン水
Material
8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	196504-57-1	-
無水エタノール	Guoyao		10009228-
寒天粉末	Solarbio	A1890-α
-アミラーゼ	メガザイム	E-BLAAM-40ML	-
アミログルコシダーゼ	メガザイム	E-AMGDF-40ML-cOmplete
ミニ	ロシュ	4693159001-D
-(+)グルコース	Sigma-Aldrich	G8270-1kg-D-Glucose
Assay Kit (GOPOD Format)	Megazyme	K-GLUC	グリコーゲン定量
ジメチルスルホキシド	Vicmed	Vic147	カオトロピック剤
大腸菌 BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02	-
エチレンジアミン四酢酸	Vicmed	Vic1488	-
氷河酢酸	Guoyao	10000218	-
グリセロール	Guoyao	10010618	バクテリア貯蔵
塩酸	Guoyao	10011008	-
ヒドロキシメチルアミノメタン	Sigma-Aldrich	V900483-500g	-
イソアミラーゼ	MegaZyme	9067-73-6	グリコーゲン 分岐
塩化リチウム	Sigma-Aldrich	62476-100G-M9
、最小限の塩、5倍;	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	細菌培養
水酸化カリウム	Guoyao
10017008-Pullulan 標準	PSS	-	-
酢酸ナトリウム三水和物	Guoyao	10018718	-
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	26628-22-8	-
塩化ナトリウム	Guoyao	10019318	細菌培養
ノ水素化ナトリウム	Huaweiruike	hws001297	-
二リン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	71515-250g	-
フッ化ナトリウムマッ	クリン	S817988-250g	-
水酸化ナトリウム	Guoyao	10019762	-
硝酸ナトリウム	Guoyao	10019928	-
ピロリン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	V900195-500g	-
スクロー	Guoyao	10021463	-
トリクロロ酢酸	Guoyao	40091961-Tryptone
	Oxoid	LP0042	細菌培養
酵母エキス	Oxoid	LP0021	細菌培養