細菌グリコーゲン粒子の分子構造解析のための非分解的抽出法

Jun-Jiao Wang; Meng-Meng Wang; You-Wei He; Zhang-Wen Ma; Zi-Yi Wang; Rui Qiao; Xin-Le Tan; Qing-Hua Liu; Liang Wang

doi:10.3791/63016

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方法論記事

細菌グリコーゲン粒子の分子構造解析のための非分解的抽出法

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DOI:

10.3791/63016

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2022年2月18日

Jun-Jiao Wang^*¹ , Meng-Meng Wang^*²^,³ , You-Wei He⁴ , Zhang-Wen Ma²^,³ , Zi-Yi Wang⁵^,⁶^,⁷ , Rui Qiao²^,³ , Xin-Le Tan⁵^,⁶ , Qing-Hua Liu⁸ , Liang Wang¹^,²

¹Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, ²Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, ³Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, ⁴Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, ⁵School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, ⁶Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, ⁷Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, ⁸State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

細菌のグリコーゲン構造は、分子の分解や偏ったサンプリングを引き起こす可能性のある抽出方法によって大きく影響を受けます。これらの問題を最小限に抑えるための方法を開発することが不可欠です。ここでは、抽出アーチファクトを最小限に抑えるための主要な基準として、サイズ分布とチェーン長分布を使用して、4つの抽出方法を比較しました。

要約

現在、グリコーゲンの空間構造を損傷するか、グリコーゲンを部分的にしか抽出しないさまざまなグリコーゲン抽出方法が存在し、グリコーゲンの微細分子構造のバイアスがかかっています。グリコーゲン構造の動的変化や細菌中のグリコーゲン粒子の多様な機能を理解するためには、分解を最小限に抑えてグリコーゲンを単離することが不可欠です。本研究では、糖密度勾配超遠心分離法(SDGU-CW) による 冷水(CW)沈殿法により、軽度のグリコーゲン単離法を実証した。比較のために、従来のトリクロロ酢酸(TCA)法と水酸化カリウム(KOH)法も実施しました。この研究では、一般的に使用される実験室株である 大腸菌 BL21(DE3)をモデル生物として使用し、デモンストレーション目的で使用しました。グリコーゲン粒子をさまざまな方法で抽出した後、粒子径分布についてはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で、直線鎖長分布では蛍光色素支援キャピラリー電気泳動(FACE)により、その構造を解析し、比較しました。この分析により、 SDGU-CWで 抽出したグリコーゲンの分解が最小限であることが確認されました。

概要

グリコーゲンは、グルコシル残基と少量ではあるが大量のタンパク質からなる高度に分岐した多糖類であり、すべてのグルコシル残基は、直鎖のα-1,4-グリコシド結合と分岐点¹のα-1,6-グリコシド結合を介して結合されています。グリコーゲン粒子の構造は、一般的に、1)短鎖オリゴマー、2)球状β粒子(直径~20nm)、3)直径が約300nmまでのβ粒子が凝集した大きなロゼット状のα粒子の3つの階層に分けられます。近年、真核生物ではグリコーゲン粒子αが壊れやすい状態と安定な状態の2つの構造状態を持っていることが分かってきました。ここで、脆弱性とは、DMSO²のようなカオトロピック剤の存在下で、大きなα粒子が小さなβ粒子に解離することを意味します。さらなる分析により、糖尿病性肝臓のグリコーゲンα粒子は一貫して壊れやすく³、壊れやすいα粒子は安定した^{α粒子よりもはるかに}速く分解することがわかりました4。したがって、グリコーゲンの構造的脆弱性は、糖尿病^の高血糖状態を悪化させる可能性があり^2,4、これにより、脆弱なα粒子は分子レベルで糖尿病の潜在的な病理学的バイ....