方法論記事

植物宿主におけるヨコバイベクターのウイルスおよび唾液タンパク質の検出

DOI：

10.3791/63020

⸱

2021年9月14日

 ,  ,  , 
1Vector-borne Virus Research Center, Fujian Province Key Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、植物宿主を使用して、ヨコバイの唾液タンパク質およびヨコバイベクターによって放出される植物ウイルスタンパク質を検出する方法を示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

昆虫ベクターは、農業上重要な多くの植物ウイルスを水平に感染させます。植物ウイルスの半分以上は、口の部分を刺す半翅目昆虫によって伝染します。ウイルス感染中、唾液ベクターウイルスと昆虫タンパク質が昆虫から植物宿主への植物の免疫応答を誘発または抑制するため、昆虫の唾液はウイルスベクター宿主を橋渡しします。唾液タンパク質の同定と機能解析は、アルボウイルスと宿主の相互作用の研究分野における新たな焦点となりつつあります。このプロトコルは、植物宿主を使用してヨコバイの唾液中のタンパク質を検出するシステムを提供します。ヨコバイベクターネフォ テティックス・シンクティセプス は、イネ矮性ウイルス(RDV)に感染した例として役立つ。ニテロゲニンと、 N. cincticeps の唾液によって媒介されたRDVの主要な外側キャプシドタンパク質P8は、 N. cincticeps が餌とするイネで同時に検出することができます。この方法は、昆虫の餌付け後に植物宿主に一過性に保持される唾液タンパク質の試験に適用できます。この検出システムは、半翅目 - ウイルス - 植物または半翅目 - 植物相互作用の研究に役立つと考えられている。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

根本的な問題であるアルボウイルスのベクター宿主感染様式は、生物科学の最前線にあります。農業上重要な多くの植物ウイルスは、昆虫媒介動物によって水平に伝染します1。植物ウイルスの半分以上は、アブラムシ、コナジラミ、ヨコバイ、ウンカ、アザミウマなどの半翅目昆虫によって媒介されています。これらの昆虫は、植物ウイルスを効率的に感染させることを可能にする明確な特徴を持っています1。彼らは穿孔吸引口器を持ち、師部と木部からの樹液を食べ、唾液を分泌します1,2,3,4。技術の開発と改善に伴い、唾液成分の同定と機能分析は、集中的な研究の新たな焦点になりつつあります。唾液中の既知の唾液タンパク質には、ペクチネステラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、スクラーゼなどの多数の酵素が含まれます5,6,7,8,9,10,11,12,13 .唾液中のタンパク質には、宿主防御応答を誘発し、それによって昆虫の性能を変化させるエリシター、および昆虫の適応度を高める宿主防御を抑制するエフェクターおよび宿主病理学的応答を誘導する成分も含まれる14,15,16,17。したがって、唾液タンパク質は昆虫と宿主の間のコミュニケーションに不可欠な物質です。ウイルスの伝染中、穿刺吸引ウイルス性の昆虫の唾液腺から分泌される唾液にもウイルスタンパク質が含まれています。ウイルス成分は唾液の流れを利用して昆虫から植物宿主に放出します。したがって、昆虫の唾液は、ウイルス-ベクター-宿主の三栄養相互作用を橋渡しします。ウイルス性昆虫が分泌する唾液タンパク質の生物学的機能を調査することは、ウイルス-ベクター-宿主の関係を理解するのに役立ちます。

動物ウイルスの場合、蚊の唾液がウエストナイルウイルス(WNV)とデングウイルス(DENV)の伝染と病原性を媒介することが報告されています。唾液タンパク質AaSG34はデング熱ウイルスの複製と伝播を促進し、唾液タンパク質AaVA-1はオートファジーを活性化することによりDENVおよびジカウイルス(ZIKV)の伝播を促進します18,19。蚊の唾液タンパク質D7は、DENVビリオンおよび組換えDENVエンベロープタンパク質20との直接相互作用を介して、インビトロおよびインビボでDENV感染を阻害することができる。植物ウイルスでは、ベゴモウイルストマト黄葉カールウイルス(TYLCV)は、植物宿主のWRKY33を介した免疫を抑制するコナジラミ唾液タンパク質Bsp9を誘導して、コナジラミの嗜好と性能を高め、最終的にウイルスの感染を増加させます21。昆虫の唾液タンパク質が植物宿主で果たす役割の研究は動物宿主の研究に遅れをとっており、植物宿主中の唾液タンパク質を検出するための安定した信頼性の高いシステムが緊急に必要とされています。

イネ矮性ウイルス(RDV)として知られる植物ウイルスは、ヨコバイネフォテティクス・シンクティセプス(半翅目:Cicadellidae)によって高効率で持続的に増殖して伝染します22,23。RDVは昆虫媒介動物によって伝染し、アジアでイネの重篤な病気を引き起こすことが最初に報告されました24,25。ビリオンは二十面体で二重層の球状であり、外層はP8外側キャプシドタンパク質22を含む。N. cincticepsにおけるRDVの循環伝達期間は14日26,27,28,29,30である。RDVが唾液腺に到達すると、ビリオンはエキソサイトーシス様機構を介して唾液腺の唾液貯蔵空洞に放出される23。ビテロゲニン(Vg)は、雌昆虫の卵母細胞発生に必須の卵黄タンパク質前駆体です31、32、33。ほとんどの昆虫種は、約220kDaの前駆タンパク質をコードする6〜7kbの少なくとも1つのVg転写産物を有する。Vgのタンパク質前駆体は、通常、卵巣に入る前に、大きな断片(140〜190 kDa)と小さな断片(<50 kDa)に切断することができます18,19。これまでのプロテオミクス解析では、ヨコバイの分泌唾液中にVg由来のペプチドが存在することが明らかになったが、その機能は不明である(未発表データ)。ウンカから経口分泌されるVgが、植物の防御を損傷するエフェクターとして機能することが新たに報告されている34。N. cincticepsのVgも唾液流で植物宿主に放出され、植物防御を妨害する役割を果たすことができるかどうかは不明です。N. cincticepsがVgなどの唾液タンパク質を利用して植物の防御を阻害または活性化するかどうかに対処するための最初のステップは、摂食中に植物に放出されるタンパク質を特定することです。植物中に存在する唾液タンパク質の同定方法を理解することは、唾液タンパク質の機能や半翅目と植物の相互作用を説明するために不可欠である可能性があります。

ここで提示されたプロトコルでは、 N. cincticeps は、昆虫の摂食によって導入された植物宿主における唾液タンパク質の存在を調べる方法を提供するための例として使用されています。このプロトコルは、主に唾液タンパク質の収集と検出について詳しく説明しており、ほとんどの半翅目のさらなる調査に役立ちます。

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プロトコル

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非ウイルス性の成体ヨコバイは、中国の福建農林大学にあるベクター媒介ウイルス研究センターで繁殖しました。

1. 非ウイルス性昆虫の飼育

  1. 成虫を40 cm x 35 cm x 20 cm(長さx幅x高さ)の立方体ケージに入れて稲の苗で飼育します。ケージの片側を換気用の防虫ネットで覆ってください。
    1. ヨコバイの入ったケージを、湿度コントローラーを内蔵したインキュベーターに保管し、相対湿度26°C、相対湿度60〜75%、光長16時間、暗8時間。
  2. 吸引器を使用して、すべての成虫をケージから毎週新鮮な米の苗が入った新しいケージにそっと移します。
    1. 200人以上の大人が交尾し、ご飯に卵を産ませます。
    2. ニンフが出現するために古いイネの苗を保持します。これらの新しい非ウイルス性のニンフを2齢の段階に引き上げます。

2. ウイルスの獲得とウイルス性昆虫の収集

  1. 2齢の非ウイルス性ニンフをガラス培養チューブ(直径2.5 cm、高さ15 cm)に1〜2時間注意深く移し、吸引器を使用して飢餓させます。
    1. 鍋で育てたRDVに感染したイネが入っているケージにニンフを放します。
    2. ニンフが感染したイネを2日間食べさせます。
      注:慎重に稲に水をやり、ニンフを洗い流さないでください。2齢幼虫の長さは約1.6〜2 mmです。
  2. これらのニンフを、16時間の明暗と8時間の暗闇の日長の下で、相対湿度60〜75%の新鮮なウイルスのないイネの苗を含む新しいケージに慎重に移します。ニンフが感染したイネを12日間食べさせて、RDVの循環伝達期間を完了します。

3. 給餌ケージを用いた唾液タンパク質の採取

  1. 一端が防虫ネットで覆われている5つの小さなパイプ状の給餌ケージ(直径2.5 cm、高さ4 cm)を準備します。
  2. 各給餌ケージに15〜20匹のヨコバイを閉じ込めてから、ケージのもう一方の端を薄いフォームマットで覆います。
    1. ケージの端とテープでフォームマットの間に1本の稲苗(高さ5〜6 cm)を固定します。給餌ケージ内のヨコバイがケージの内部に露出したイネの苗を餌にできることを確認してください。
  3. 稲が生き続けるように苗の根を水に浸します。ヨコバイが2日間それらを食べられるようにします。
  4. ヨコバイを餌ケージから取り出し、餌を与えた稲の苗を集めます。ケージの外側の苗の部分を切り取り、苗の餌場を回復します。
    注:このサンプルは、検出に即座に使用されない場合、-80°Cで最大3か月間保存できます。

4. 試薬の調製

  1. 15.1 gのトリス塩基、94 gのグリシン、および5 gのSDSを1 Lの滅菌水に溶解し、5xTris-グリシンバッファーを調製します。200 mLの5xTris-グリシンバッファーを800 mLの滅菌水で希釈して、1xTris-グリシンバッファーを調製します(バッファー組成については 表1 を参照)。
  2. NaCl80 g、トリス塩基30 g、およびKCl2 gを滅菌水1 Lに溶解し、10xTris緩衝生理食塩水(TBS)バッファーを調製します。溶液を121°Cで15分間オートクレーブします。
  3. 8 gのSDS、4 mLのβ-メルカプトエタノール、0.02 gのブロモフェノールブルー、および40 mLのグリセロールを40 mLの0.1 M Tris-HCl(pH 6.8)に溶解し、4xタンパク質サンプルバッファーを調製します。
  4. 800 mL トリスグリシンバッファーと 200 mL メタノールを混合して、トランスファーバッファーを調製します。
  5. 100 mL 10xTBS溶液と3 mLトゥイーン20〜900 mL滅菌水を加えて、トゥイーン20(TBST)溶液でTBSバッファーを調製します。

5. 唾液およびウイルスタンパク質を検出するためのウェスタンブロッティング

  1. 組織が粉末になるまで、0.1 gの米サンプルを液体窒素で粉砕します。200 μLの4xタンパク質サンプルバッファーをサンプルに加え、10分間煮沸します。サンプルを12,000 x g で室温で10分間遠心分離します。
    1. 上清を取り除き、新しいバイアルに入れます。10 μLのサンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、トリスグリシンバッファー中で150 Vで45〜60分間実行します。
      注:遠心分離後の残留物は廃棄できます。
  2. 0.45 μmのニトロセルロースメンブレンとその他のサンドイッチサプライをトランスファーバッファーに30分間入れます。
    注:この手順は、ゲルの実行が完了する前に実行できます。
  3. ゲルをサンドイッチし、転送バッファーに100 Vで90〜120分間転送します。
  4. メンブレンを取り、TBST溶液中の7%脱脂粉乳ブロッキング溶液に20分間入れます。RDV P8またはVgに対する特異的抗体をTBST中の脱脂粉乳の7%溶液に加えます。メンブレンを染色するための抗体と2時間または一晩インキュベートします。
  5. 膜をTBST溶液で3回洗浄し、毎回5分間洗浄します。
  6. 二次抗体としてヤギ抗ウサギIgGをTBSTを含む7%脱脂粉乳に加えます。抗体とともに室温で60〜90分間インキュベートします。
  7. 膜をTBST溶液で毎回5分間3回洗浄します。
  8. 化学発光法にはECLウエスタンキットを使用してください。キット内の検出試薬1と2をチューブ内で1:1の比率で混合します。混合試薬をメンブレン上に置き、ブロットを5分間インキュベートします。
  9. 余分な試薬を排出し、化学発光画像の比色写真を撮ります。それらを組み合わせて、タンパク質バンドとはしごを見てください。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図1は、昆虫の飼育、ウイルスの獲得、稲の給餌による唾液タンパク質の収集、およびウェスタンブロットなど、このプロトコルのすべてのステップを示しています。ウェスタンブロットの結果は、Vgに対する抗体をインキュベートした膜上の昆虫の摂食イネと唾液腺のサンプルで約220 kDaの特異的および予想されるバンドが観察されることを示しました。対照的に、無給餌イネサンプルではバンドは観察されなかった。図2の結果は、Vgが唾液タンパク質として植物宿主に放出されたことを示している。RDV P8に対する抗体をインキュベートしたメンブレンでは、摂食を受けたイネのサンプルとウイルス性昆虫体の体からも、約46 kDaの特異的で予想されるバンドが観察されました。対照的に、図3に示すように、非摂食イネサンプルと非ウイルス性ヨコバイ体ではバンドは観察されませんでした。この結果は、ウイルスタンパク質が摂食植物でも検出できることを証明しました。<...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

刺し吸う昆虫の唾液腺から直接分泌される唾液は、宿主組織とベクターのクロスキングダム生物学的因子を宿主に事前に消化して解毒するため、極めて重要な役割を果たします1,3,4。エリシター、エフェクター、低分子RNAなどの異性界の生物学的因子は、昆虫と宿主のコミュニケーションにとって重要です14,15,16。したがって、唾液成分のより多くの種類と機能を明らかにすることは、昆虫と宿主の関係を理解することを促進します。ここでは、植物宿主中の唾液タンパク質の検出システムが提供され、植物宿主における唾液タンパク質の機能に関するさらなる調査が可能になります。

このプロトコルは、摂食植物を採取することにより、口の部分を穿刺吸引するヨ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国家自然科学財団(31772124および31972239)および福建農林大学(Grant KSYLX014)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
TrisベースロシュD609K690325×トリスグリシン緩衝液および10倍;TBS緩衝液調製
グリシンSigma-AldrichWXBD0677V5回;トリス-グリシン緩衝液
調製 SDSSigma-AldrichSLCB43945回;トリスグリシン緩衝液調製
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001931810×TBS緩衝液調製
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001631810回;TBS緩衝液
調製ß-メルカプトエタノールXiya試薬B144924倍用;タンパク質サンプル緩衝液調製
モフェノールブルーSigma-AldrichSHBL36684倍用;タンパク質サンプル緩衝液調製
グリセロールSinopharm化学試薬Co.、Ltd100106184倍用;タンパク質サンプル緩衝液調製
メタノールSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118トランスファーバッファー調製用
Tween 20Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGYCT30111220TBST調製
用 脱脂粉乳Becton.Dickinsoと会社252038膜ブロッキング、抗体希釈ヤ
ギ 抗ウサギ IgGサンゴンバイオテックD110058-0001一次およびチボディ
ECLウェスタンキットサーモフィッシャーサイエンティフィック32209化学発光基質
ニトロセルロースメンブレンポールコーポレーション25312915タンパク質の転写
バッファーおよび溶液
BufferCompositionComments/Description
 5回;トリスグリシン緩衝液15.1 g トリス塩基
94 g グリシン
 1 L滅菌水		 ストックソリューション
1×トリスグリシン緩衝液200mLを5回;トリスグリシン緩衝液
800 mL 滅菌水		作業溶液、SDS-PAGE
10×トリス緩衝生理食塩水(TBS)緩衝液80 g NaCl
30 g Tris塩基
2 g KCl
1L滅菌水に1Lの滅菌水		TBSをストック溶液
TBSとTween 20(TBST)溶液100 mL 10回;TBS solution
3 mL Tween 20
900 mL 滅菌水		作業溶液
4× タンパク質サンプル緩衝液8 g SDS
4 mL ß-メルカプトエタノール
0.02 g ブロモフェノール blue
40 mL グリセロール
40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		タンパク質抽出用
転写バッファー800 mL Tris-glycine バッファー
200 mL メタノール		タンパク質転写
Instruments
ブロモフェノールブルーSigma-AldrichSHBL36684xタンパク質サンプルバッファー調製用
恒温インキュベーターNingbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.PRX-1200Bヨコバイの飼育用
電気泳動タノンサイエンス &テクノロジー株式会社タノンEP300SDS-PAGE
電気泳動転写コアモジュールBIO-RAD1703935SDS-PAGE
グリセロールSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100106184xタンパク質サンプルバッファー調製
用 グリシンSigma-AldrichWXBD0677V5xトリス-グリシンバッファー調製用
ヤギ抗ウサギIgGSangon BiotechD110058-0001プライマリおよびtibody
ハイパスティッシュ研削装置Shanghai Jingxin Industrial Development Co.、Ltd.JXFSIPRP-24植物組織を粉砕するため
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001631810x TBS緩衝液調製用
メタノールSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118転写緩衝液調製用
ミニ湿式熱転写トラフBIO-RAD1703930SDS-PAGE用
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.1001931810x TBS緩衝液調製
ニトロセルロース膜ポールコーポレーション25312915タンパク質の非
脱脂粉乳Becton.Dickinsoと会社252038膜ブロッキング、抗体希釈
ピアスECLウェスタンキットサーモフィッシャーサイエンティフィック32209化学発光基質
タンパク質カラー機器GEヘルスケアバイオサイエンスABAmersham lmager 600タンパク質検出用
SDSSigma-AldrichSLCB43945x Tris-glycine buffer preparation
Tris baseRocheD609K690325x Tris-glycine buffer and 10×TBSバッファー調製
Tween 20Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGYCT30111220TBST調製用
縦型プレート電気泳動タンクBIO-RAD1658001SDS-PAGE
用ウォーターバスShanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.XMTD-8222タンパク質サンプルを沸騰させるため
β-メルカプトエタノールXiya試薬B144924xタンパク質サンプルバッファー調製用
ブロの再認識 に5 g SDSに用 の認識を移送するため

参考文献

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