寄生性線虫 Strongyloides stercoralis および Strongyloides ratti のための機能的ゲノムツールキットには、トランスジェネシス、CRISPR/Cas9媒介突然変異誘発、およびRNAiが含まれる。このプロトコルは、生殖腺内マイクロインジェクションを使用して、導入遺伝子およびCRISPR成分を S. stercoralis および S. rattiに導入する方法を実証する。
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この記事について
サマリー
要約
ストロンギロイデス属は、ストロンギロイデス・ステロイドおよびストロンギロイデス・ラティを含む、異なる宿主範囲を有する皮膚貫通線虫の複数種からなる。S. stercoralisは、約6億1000万人に感染するヒト寄生性の皮膚透過性線虫であり、ラット寄生虫S. rattiはS. stercoralisと密接に関連しており、S. stercoralisの実験室モデルとしてしばしば使用されている。 S. stercoralisとS. rattiの両方は、生殖腺内マイクロインジェクションの外因性核酸送達技術によるトランスジェニックおよびノックアウトの生成に容易に順応性であり、したがって、この技術にまだ順応していない他の寄生性蠕虫のモデルシステムとして浮上している。
寄生性 ストロンギロイデス 成虫は宿主の小腸に生息し、糞便を介して子孫を環境に放出する。環境に入ると、幼虫は糞便に住み、新しい宿主を見つけて侵入しなければならない子孫を産む自由生活の成虫に発達する。この環境生成は ストロンギロイデス 種に特有のものであり、モデルの自由生活線虫 Caenorhabditis elegansに形態が十分に類似しており、 C. elegans のために開発された技術は、性腺内マイクロインジェクションを含むこれらの寄生性線虫での使用に適合させることができる。生殖腺内マイクロインジェクションを用いて、多種多様な導入遺伝子を ストロンギロイデスに導入することができる。CRISPR/Cas9成分をマイクロインジェクションして、変異型 ストロンギロイデス 幼虫を作成することもできる。ここでは、自由生存成人の調製、注射手順、およびトランスジェニック子孫の選択を含む、 ストロンギロイデス への性腺内マイクロインジェクションの技術について説明する。CRISPR/Cas9突然変異誘発を用いて作製されたトランスジェニックスト ロンギロイデス 幼虫の画像が含まれる。この論文の目的は、他の研究者がマイクロインジェクションを使用してトランスジェニックおよび変異型の ストロンギロイデスを作成できるようにすることです。
概要
ストロンギロイデス・ステコラリスは、より広く認識されている鉤虫や回虫のアスカリス・ルンブリコイデス1と比較して、重要なヒト病原体として長い間見過ごされてきた。ワームの負担に関する以前の研究では、S.スターコラリス2の一般的な診断方法の感度が低いため、S.スターコラリスの有病率をしばしばひどく過小評価していました。近年、改良された診断ツールに基づく疫学的研究は、S.ステルコラリス感染症の真の有病率は、以前に報告されたよりもはるかに高く、世界中で約6億1000万人と推定されている2。
S. stercoralisと他のストロンギロイデス種(近縁のラット寄生虫および共通ラボモデルS. rattiを含む)は、寄生世代と自由生活(環境)世代の両方からなるため、実験的ゲノム研究に有利な異常なライフサイクルを持っています3(図1)。具体的には、S. stercoralisとS. rattiの両方が単一の自由生活世代を循環させることができます。自由生活世代は、自由生活の成人男性と女性に発達する寄生後の幼虫からなる。自由生活の成虫のすべての子孫は感染性の幼虫に発達し、ライフサイクルを継続するために宿主に感染しなければならない。さらに、この環境世代または自由生活世代は、実験室で実験的に操作することができる。自由生活のストロンギロイデス成虫とC.エレガンス成虫は類似の形態を共有しているため、もともとC.エレガンスのために開発された性腺内マイクロインジェクションなどの技術は、自由生活の成体ストロンギロイデス4,5での使用に適合させることができる。DNAは一般に自由生活の成人女性に導入されるが、ストロンギロイデスの男性と女性の両方にマイクロインジェクションすることができる6。したがって、機能的ゲノムツールは、ストロンギロイデスの生物学の多くの側面を調査するために利用可能である。他の寄生性線虫は自由生活世代を欠いており、その結果、機能的ゲノム技術に容易に順応していない3。
図1:ストロンギロイデス・ステロイドのライフサイクル S.ステルコラリス寄生雌は、哺乳類宿主(ヒト、非ヒト霊長類、イヌ)の小腸に生息する。寄生雌は単為生殖によって繁殖し、小腸内で卵を産む。卵は宿主の内部に留まっている間に孵化し、寄生後幼虫に孵化し、糞便とともに環境に渡される。寄生後の幼虫が雄である場合、それらは自由生活の成人男性に発達する。寄生後幼虫が雌である場合、それらは自由生活の成体雌(間接発達)または第3段階の感染性幼虫(iL3s;直接発達)のいずれかに発達することができる。自由生活の男性と女性は、iL3になるように制約されている子孫を作り出すために性的に繁殖します。特定の条件下では、S. stercoralisはまた、寄生後幼虫の一部が糞便中の環境に入るのではなく宿主腸内に留まる自己感染を受ける可能性がある。これらの幼虫は、宿主内で自己感染性幼虫(L3a)に発達し、腸壁を貫通し、体内を移動し、最終的に腸に戻って生殖成虫になることができる。S. rattiの生活環は、S. rattiがラットに感染し、自己感染サイクルを持たないことを除いて、類似している。環境生成は、遺伝学的研究にストロンギロイデス種を使用するための鍵です。自由生活の成人女性(P0)にはマイクロインジェクションすることができます。それらの子孫は、すべてiL3sになり、潜在的なF1遺伝子導入薬である。この図はカステルレットらから修正されたものである。3. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
S. stercoralisは 、宿主の侵入や宿主の免疫調節を含む他の胃腸ヒト寄生性線虫と生物学の多くの側面を共有しています。例えば、 Necator 属および Ancylostoma 属のヒト寄生性鉤虫も皮膚浸透によって感染し、同様に体内をナビゲートし、そして最終的には小腸に寄生成体として存在する7。したがって、多くの胃腸線虫は、一般的な感覚行動および免疫回避技術を使用する可能性が高い。その結果、 ストロンギロイデス から集められた知識は、他の遺伝的に扱いにくい線虫の発見を補完し、これらの複雑で重要な寄生虫のより完全な理解につながるでしょう。
このマイクロインジェクションプロトコルは、トランスジェニックおよび突然変異体の子孫を作るために 、ストロンギロイデス の自由生活の成人女性にDNAを導入する方法を概説しています。マイクロインジェクションのための成虫の発生時期およびトランスジェニック子孫の収集を含む、株維持要件が記載されている。プロトコルと完全なマイクロインジェクション技術のデモンストレーション、トランスジェニック子孫の培養とスクリーニングのためのプロトコルが、必要なすべての機器と消耗品のリストとともに含まれています。
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プロトコル
注:スナネズミはS. ステルコラリスの継代に使用され、ラットは S.ラッティの継代に使用された。すべての手順は、AAALAC規格および実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しているUCLA動物研究監督局(議定書番号2011-060-21A)によって承認されました。以下のタスクは、マイクロインジェクションの少なくとも1日前に完了しなければならない:ワームの培養、マイクロインジェクションパッドの調製、マイクロインジェクションミックス用の構築物の作成、および細菌(大腸菌 HB101)を6cm線虫増殖培地(NGM)プレート上に広げる8。自由生活の女性は、マイクロインジェクションを受ける前に若年成人に発達するために、25°Cで最低24時間の糞便収集を必要とします。マイクロインジェクションパッドは完全に乾燥している必要があります。バクテリアプレートは乾燥して小さな芝生を確立しなければなりません。
1.マイクロインジェクションスライドの調製:注射の少なくとも1日前
注:ワームは、注射用の乾燥寒天パッドを備えたマイクロインジェクションカバースリップに取り付けられています。
- ヒートブロックを90°Cに設定します。
- 5mLのddH2O、次いで100mgのアガロースをホウケイ酸ガラス管に加える。
- チューブ内のアガロースミックスを、アガロースが溶解するまで炎で加熱する。
- 90°Cに設定したヒートブロックにチューブを置き、アガロースを液体状態に維持した。
- 約180μLのアガロース溶液を、ガラス製パスツールピペットまたはプラスチックチップ付きピペットを使用してカバースリップに滴下します。すぐに2枚目のカバースリップを上に落とし、アガロースを薄いパッドに平らにします。
- 5~10秒後、2つをスライドさせてトップカバースリップを外します。寒天パッドがどのスライド上にあるかを確認し、上を向いて置きます。
- 壊れたカバースリップから小さなガラス片を選択し、鉗子を使用してパッドの上端近くの寒天に静かに押し込みます(補足図S1)。
- アガロース溶液でマイクロインジェクションパッドを作り続けます。
- アガロースパッドをベンチまたはオーブンで一晩乾燥させます。カバースリップボックスに保管してください。
注:アガロースパッドは最大2ヶ月間使用できますが、1回の注入実行にのみ使用されます。
2.マイクロインジェクション用のワームを得るための ストロンギロイデス の培養:注射の1〜2日前
注:株維持プロトコルは、スナネズミやラットに線虫を感染させ、感染した動物の糞便から線虫を収穫する方法の詳細な説明を含む 補足資料に記載されています。
- 注射日の2日前に、感染した動物9,10を一晩収集ケージに入れる。
- 翌朝、蔓延した糞便を集め、糞便 - 木炭プレート9,10を作る。
- プレートを25°Cで24時間置いて、自由生活のワームが若年成人に発達できるようにします。
- 注射日の前夜に、感染していない宿主動物を収集ケージに入れる。
- 注射日に、注射後栽培のために蔓延していない糞便を集める。
3.マイクロインジェクションミックスを作る:注射の前または当日
注:マイクロインジェクションミックスは、ワーム緩衝生理食塩水(BU)中で所望の濃度に希釈された目的のプラスミド(50mM Na2HPO4、22mMKH2PO4、70mM NaCl)11からなる。
- プラスミドストックの濃度およびマイクロインジェクションミックス中の所望の濃度を決定する(表1)。
| マイクロインジェクションミックス:レポーターコンストラクト | |||
| コンポーネント | 在庫濃度 | 量 | 最終濃度 |
| pMLC30 GPA-3::gfp | 300 ng/μL | 1.7 μL | 50 ng/μL |
| ティッカー | ナ | 8.3 μL | ナ |
| トータル | 10 μL | 50 ng/μL | |
| マイクロインジェクションミックス:CRISPR/Cas9突然変異誘発 | |||
| コンポーネント | 在庫濃度 | 量 | 最終濃度 |
| pMLC47 tax-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2.7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-tax-4 HDRプラスミド | 400 ng/μL | 2.0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9プラス ミド | 350 ng/μL | 1.1 μL | 40 ng/μL |
| ティッカー | ナ | 4.2 ミリリットル | ナ |
| トータル | 10 μL | 200 ng/μL | |
| マイクロインジェクションミックス:ピギーバック統合 | |||
| コンポーネント | 在庫濃度 | 量 | 最終濃度 |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2.0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402トランスポザーゼプラスミド | 450 ng/μL | 0.9 μL | 40 ng/μL |
| ティッカー | ナ | 7.1 μL | ナ |
| トータル | 10 μL | 100 ng/μL | |
表1:マイクロインジェクションミックスの例3つの例えばマイクロインジェクションのためのプラスミドおよび濃度は、gpa−3::GFPレポーター構築物10のための1つ、Ss−tax−4遺伝子座14,15のCRISPR/Cas9媒介性破壊のための1つ、およびSs−gpa−3::GFP構築物13、17、18のpiggyBac媒介性統合のための1つを混合する。strCas9は、ストロンギロイデスコドン最適化Cas9遺伝子を示す。記載されている最終濃度は、ストロンギロイデスマイクロインジェクションミックスで一般的に使用されます。
- プラスミドをBU中の全量10〜20μLに希釈する。
- 5,000 × g のフィルターカラムを通してミックスを 1 ~ 2 分間回転させます。
- マイクロインジェクションミックスはすぐに使用するか、将来の使用のために-20°Cで保存してください。
4.マイクロインジェクションのためにヤング アダルトストロンギロイデス を集める:注射日の朝
- 若い成人の ストロンギロイデス の糞便チャコールプレート1枚でBaermann装置をセットアップします(図2)。
注:糞便 - 木炭プレートには、いくつかの感染性幼虫が含まれている可能性があります。個人用保護具は、ラボコート、手袋、および目の保護具で構成されています。手袋と白衣の袖の間に皮膚を露出させないでください。
図2:培養物10から寄生虫を採取するために使用したBaermann装置。 糞便 - 木炭プレートの内容物は、温水の柱の上部に配置される。ワームは水に移動し、漏斗の底に集まります。(A)Baermann装置を設置するには、Baermann漏斗用のスタンドをCクランプでベンチにクランプします。漏斗の端に取り付けられたゴムチューブをピンチクランプで閉じ、チューブの下にキャッチバケツを置いて滴り止めます。温水をガラス漏斗に加える。(B)糞便 - 木炭混合物用のプラスチックリングホルダーに、3枚の実験室組織(左)を裏打ちする。木製の棒または舌圧迫器(中央)を使用して、糞便炭プレート(右)の内容物をプラスチックリングホルダーに移します。(C)糞便-木炭ミックス用のプラスチックリングホルダーの底部のクローズアップで、ホルダーの底部にナイロンチュールの二重層を示す。(D)次いで、糞便炭ホルダーをガラス漏斗の上部に置く。(E)実験室組織を水で湿らせ、糞便 - 木炭混合物上で閉じる。より多くの温水が加えられ、主に糞便 - 木炭を沈める。(F) 糞便-木炭培養物を温水に沈めた完全なベアマン・セットアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- Oリングを使用してリングスタンドにゴム製収集チューブ付きのガラスロートを取り付け、クランプで固定します。2つのピンチクランプで収集チューブを閉じます(図2A)。
- 点滴をキャッチするために漏斗の下にキャッチバケツを置きます。
- リムから5cm下の漏斗に暖かい(約40°C)水を加えます。システムが漏れていないことを確認します。
- Baermannホルダーは、2つのプラスチックリングで作られたふるいに並び、2層のナイロンチュールネットがそれらの間に固定され、3つの重なり合ったラボ組織があります。糞便 - 木炭混合物をBaermannホルダーに加える(図2B、C)。
- 糞便 - 木炭混合物を含むBaermannホルダーを漏斗に入れます。糞便 - 木炭ミックスの周りの組織を折り畳み、糞便 - 木炭のほとんどを沈めるのに十分な水を加える。漏斗の縁から2cm以上を充填しないでください(図2D、E)。
- 臭いを封じ込めるために15cmのプラスチック製のペトリ皿の蓋で漏斗の上に。必要に応じて漏斗にラベルを付けます(図2F)。
- Baermann装置からワームを収集するために30分から1時間待つ。
- 漏斗の底にあるゴムチューブの下に50 mLの遠沈管を持ちます。底部のクランプを慎重に開き、ワームを含む30〜40mLの水を50mLチューブに分配する。
- ワームを含む15 mLのベアマン水を15 mL遠沈管に移す。15 mL 遠沈管を ~750 × g (低速) で 1 分間回転させます。あるいは、ワームに重力が10〜15分間沈降するのを許してください。
- 上清を〜2mLまで除去し、上清をヨウ素を含む廃液容器に捨てて、ワームを殺す。
- さらに15mLの収集管にバールマン水を加え、スピンを繰り返す。上清を約 2 mL まで取り出し、ステップ 4.11 のように廃棄します。
- すべてのワームが 15 mL 遠沈管に収集されるまで、手順 4.11 と 4.12 を繰り返します。最後のスピンの後、できるだけ多くの水を取り除きます。
- チューブの底にあるワームのペレット(40〜100μL)を検査する。ワームが見えない場合は、さらに1〜2時間待ってから、Baermann装置からさらにワームを集めてみてください。
- ワームをできるだけ少ない水で 大腸菌 HB101の芝生で6cm2%NGMプレートに移す。このプレートをマイクロインジェクションの ソースプレート として使用します。
- 糞便と木炭の混合物は、希釈ヨウ素(ルゴールのヨウ素を水に50%希釈したもの)で処理し、滴りをキャッチするためにプラスチックフィルムで包み、バイオハザード廃棄物容器に入れて廃棄します。
- 10mLの希釈ヨウ素をキャッチバケツに加え、余分な水をBaermannからその中に排出する。
- 再利用可能なコンポーネント(漏斗、キャッチバケツ、チュール付きプラスチックホルダー、プラスチック蓋、クランプ)を10%漂白剤で洗い流し、十分にすすいでください。
5.マイクロ注射針の引っ張りと装填:注射直前
- ニードルプーラーを用いてガラスキャピラリーチューブを引っ張ってマイクロインジェクション針を調製する。
メモ: 3 mm プラチナ/イリジウムフィラメントを搭載した市販のニードルプーラーの設定例は、ヒート = 810-820、プル = 800-820、マイクロメーター = 2.5 です。 - 解剖顕微鏡で先端を見る。針が所望の形状をしている場合(図3A-F)、4~6本の針(2~3本の毛細管)を引っ張ります。針の形状を正しくするには、必要に応じて設定を変更します。[ヒート] または [プル] の設定を 10 ずつ調整し、テーパーとシャフトの形状がより適切になるまで新しい針を引っ張ります。
図3:マイクロインジェクション針と、マイクロインジェクションに最適な部位が特定されたストロンギロイデス・ステロイド・アダルト・メス。(A-B)マイクロインジェクション用に正しい形状の針のシャフトテーパ(A)および先端(B)。先端はキューティクルを突き刺すほど鋭く、過度の損傷を引き起こさないほど狭い。(C-D)マイクロインジェクション用形状が間違っているマイクロインジェクション針のシャフトテーパ(C)および先端(D)。先端は鈍くて広く、ワームに過度の損傷を与えます。(E-F)針のシャフトテーパ(E)と先端(F)は、マイクロインジェクションに作用するには長すぎて細い可能性があります。F の先端は D の先端と非常によく似ています。しかし、シャフトはより狭く、柔軟性がありすぎてキューティクルを効果的に突き刺すことができません。また、非常に細い針が詰まりやすい。(G) マイクロインジェクションのために正しく配置されたワーム全体の画像で、針が右から入ってくると仮定して。前部は下向きで左側にあります。外陰部は矢印で示されます。生殖腺は女性の右側に沿って見えます。この女性は子宮内に卵子を1つだけ持っています(アスタリスクで示されます)。(H、I)マイクロインジェクション部位の拡大図。矢印の角度は注射針の角度に近似している。外陰部はランドマークとして使用することができます。それは生殖腺の腕からワームの反対側にあります。生殖腺の腕は腸の周りを湾曲し、分裂核の端は外陰部の反対側にあります。(H) 生殖腺の後腕;(i)前腕。一方または両方の腕を注入することができる。H、Iの場合、規約はGと同様である。スケールバー = 50 μm (B, D, F, H, I);100 μm (A, C, E, G).この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 引っ張った針を15cmのプラスチック製のペトリ皿にロールテープで保管し、針を固定し、先端にほこりが蓄積しないようにします。
- 0.7 μL のマイクロインジェクション ミックスをシャフトの開放端に置きます。ロール状のテープを使用して針を棚に垂直に吊り下げ、10分以内にテーパーシャフトをミックスで満たします。最初の針が機能しない場合に備えて、一度に2本の針を準備します。
6. 顕微鏡の準備と針の折れ
注:マイクロインジェクションは、針の動きを制御するためにマイクロインジェクタセットアップを備えた5xおよび40x対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用します。倒立顕微鏡は、振動騒音を低減するために、重いテーブルまたは防振エアテーブルに置く必要があります。マイクロインジェクターニードルホルダーは、マイクロインジェクションミックスを送達するために必要な圧力を加える窒素ガスに接続されています。近くの小さな解剖顕微鏡がワームを移すために使用されます。
- 液体の流れに応じて、ガスタンクの圧力を針を壊す場合は〜40〜60psi、マイクロインジェクションの場合は〜30〜50psiに設定します。
- 解剖顕微鏡で、マイクロインジェクションパッドカバースリップのガラスの破片を、標準的なプラチナワームピックを使用してハロカーボンオイルで覆います。
- マイクロインジェクションパッドカバースリップをマイクロインジェクションスコープに置き、オイルで覆われたガラスの破片を見つけます。針の方向に対してエッジが垂直になるようにガラスの破片を揃えて、針を壊すために使用する表面として機能します。
- 解剖顕微鏡を使用して、針のテーパーシャフトに気泡や破片がないことを確認します。次に、針を1〜1.5cm加圧ホルダーに固定します。
- 針の先端を顕微鏡の視野の中心に目で合わせる。次に、低倍率下で、針の先端をガラスの破片の側面に垂直に、視野内に配置します。
- 高出力に切り替えて、針の先端をガラスの端に合わせます。
メモ: 引っ張ると、針はヒューズを閉じて閉じます。 - 液体の流れを可能にするために針の先端を壊すには、ガスから連続的な圧力をかけながら、ガラス片の側面を静かに叩きます(補足図S1)。液体が流れ始めたら、先端の形状を確認し、流れやすい液体で鋭利であることを確認してください。
メモ:液体の流れが速すぎるか、端が鈍すぎると、マイクロインジェクション中にワームが損傷します(ビデオ1および図3A-F)。 - 液体が針からよく流れたら、マイクロインジェクションスライドを解剖範囲に移動し、1〜2μLのハロカーボンオイルの滴を寒天パッドの上に置き、ワームを配置する。
- 20〜30匹の若年成人 ストロンギロイデス を細菌なしで2%NGMプレートに少なくとも5分間移し、過剰な表面細菌を除去し、マイクロインジェクション用の単一ワームを選択する。注入中に必要に応じてNGMプレートにワームを追加します。
7. ストロンギロイデスのマイクロインジェクション
- ワームピックに少量のハロカーボンオイルを使用して、細菌を含まない2%NGMプレートから生殖腺に1〜4個の卵を持つ ストロンギロイデス の若年成人女性を選択します。
- 寒天パッド上の油の小さな滴にワームを移します。ワームピックを使用して、ワームがコイル状にならず、生殖腺が見えてアクセスしやすいように、ワームを静かに配置します。生殖腺の方向をメモします(図3G)。
- マイクロインジェクション顕微鏡の視野にワームを配置します。生殖腺が針と同じ側にあり、針がわずかな角度で生殖腺に接触するように配置されていることを確認します(図3H、I)。
- 針の先端を同じ焦点面内のワームの側面に持って行きます。ワームの中央付近の生殖腺の腕を目指します。マイクロインジェクターを使用して、針を生殖腺に優しく挿入します(ビデオ2)。
- 直ちに針に圧力をかけ、生殖腺アーム全体をDNA溶液で穏やかに充填する。十分な液体が注入された時期を目で確認します(ビデオ2)。
注:生殖腺を埋めるのに最大2秒かかることがあります。 - 針を外し、傷口が閉じているかどうかを確認します。
注:生殖腺が体壁から突き出ている場合、ワームはあまりにも損傷しているため、子孫を生み出すことはできません(補足ビデオS1)。 - 生殖腺のもう一方の腕が見える場合は、それを繰り返します。
- 注入が終わったら、寒天パッドに針の先端で圧力をかけて針が詰まっていないことを素早く確認する。注入したワームでスライドを解剖顕微鏡に移します。
- 注入されたワームを回復するには、まずワームに数滴のBUを入れて寒天パッドから浮かべます。
- ワームピックに少量のHB101バクテリアを集めます。ワームピックの付着菌でワームに触れて、液体から取り除きます。
- ワームを 回収 プレートに穏やかに移し、HB101芝生を含む2%NGMプレートとする。
注: ワームは数分以内にクロールを開始するはずです。 - 数匹の雌を注射した後、注射されていない雄をソースプレートから加える。
注:5人の女性に対して最低1人の男性が良いベースラインです。過剰な男性が好ましい。 - 実験のために十分な数の女性が注射されるまで、すべてのステップを繰り返します。
- ワームが回復して交尾できるように、注射後少なくとも1時間、成虫を回復プレートに残します。
8. 注射されたストロンギロイデスの回収と培養
- 感染していない宿主動物から一晩糞便を採取し、感染した動物と同じプロトコルを使用します。
- 蔓延していない糞便を少量の木炭と混ぜる(これらのプレートの糞便対木炭比は約2対1)。
- 少量の糞便 - 木炭混合物を湿ったろ紙で裏打ちされた6cmのペトリ皿に注ぐ。ミックスが皿のふたに触れないようにしてください。
- 回収プレートにBUを流し込みます。3 μLに設定したピペットを使用して、ワームを糞便 - 木炭プレートの糞便に移します。ワームを木炭ではなく、糞便に直接置きます。
- 解剖スコープを使用して、成虫が糞便 - 木炭プレート上にあることを確認します。
- ワームを培養するには、プレートを加湿した部屋、 すなわち湿ったペーパータオルが並ぶしっかりとフィットする蓋付きのプラスチック製の箱に入れます。
注:2日後、幼虫期が混在します。5日後、幼虫の大部分はiL3に発達する。いくつかの若い幼虫が残るでしょう。7日後、すべての幼虫はiL3であるはずです。
9. トランスジェニック/ノックアウトを回収するための F1 幼虫の収集とスクリーニング
- Baermannセットアップを使用して、注入後の小規模糞便 - 木炭培養プレートから幼虫を採取する。できるだけ多くの幼虫を得るには、Baermann装置からワームを回復する前に少なくとも2時間待ってください。
- ステップ4.10〜4.14のように幼虫を15mL遠沈管に濃縮し、幼虫をBUで小さな時計皿に移す。
- 幼虫を行動実験に使用する場合は、HB101の厚い芝生を含む2%NGMプレートをスクリーニングに使用してください。
- 20〜30匹の幼虫をHB101芝生に移す。
注:細菌は幼虫の動きを遅らせます。 - 蛍光解剖顕微鏡下で、目的の導入遺伝子を発現する幼虫を同定する。ワームピックを使用してトランスジェニック幼虫を選択し、BU付きの小さな時計皿に移動します。
- 新しいHB101プレートを使用して、幼虫の別の小さなバッチをスクリーニングします。実験用に十分な幼虫が収集されたら、HB101プレートと余分なワームを希釈ヨウ素(水で希釈したルゴールのヨウ素の50%)で処理し、バイオハザード廃棄物として廃棄します。あるいは、アルキルベンジルアンモニウムクロリドを含む濃縮犬小屋クリーナーを使用して余分なワームを殺す。
- ワームをすぐに使用するか、一晩中少量のBUで浅い時計皿に入れたままにします。
注:液体が深すぎると、ワームが低酸素になることがあります。幼虫を一晩BUに残すことは、特定の行動に影響を与える可能性があります。したがって、6時間以内に行動実験に幼虫を使用してください。
- 20〜30匹の幼虫をHB101芝生に移す。
- 幼虫が行動アッセイではなく顕微鏡検査に使用される場合は、スクリーニングのためにニコチン麻痺によって可逆的にワームを固定化する。
- カミソリの刃を使用して、10cmの走化性プレート12 のプラスチック底部にグリッドをスコアリングして、プレート上のワームの位置を追跡しやすくする。
- BU中の約3μLの幼虫をグリッド上の正方形に落とす。必要な数の正方形を塗りつぶします。幼虫がプレートの側面に這う可能性があるため、プレートの端の近くのものを使用しないでください。
- 15〜20μLの水中の1%ニコチンをワーム滴に加える。
注:4分後、ワームは麻痺します。 - 蛍光解剖顕微鏡を用いてワームをスクリーニングする。
- ワームピックを使用して、トランスジェニック幼虫を1〜2mLのBUを含む小さな時計皿に移します。
注:幼虫は数時間麻痺し、顕微鏡観察のために顕微鏡スライドに簡単に取り付けることができます。BUに一晩放置すると、iL3sは回復し、いくつかのアッセイまたは哺乳動物宿主感染に使用することができる。しかし、ニコチン麻痺およびBUでの一晩のインキュベーションは、特定の行動に影響を与える可能性がある。
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結果
実験が成功した場合、F1幼虫は目的の導入遺伝子および/または変異表現型を発現する(図4)。しかし、形質転換率は非常に変動し、構築物、ワームの健康状態、注射後の培養条件、および実験者のスキルに依存する。一般に、実験が成功すると、注射された雌あたり>15F1幼虫が得られ、蛍光マーカーの形質転換率は>3%となる。生きている子孫の総数が平均して10匹未満の幼虫/雌である場合、構築物は有毒であり、形質転換された幼虫は生存していない可能性がある。蛍光幼虫ではなく蛍光卵を多数見つけることは、注入混合物が有毒である可能性があるという別の指標である。この手法を初めて学ぶときは、体壁筋13の堅牢な表現を駆動するact-2::mRFPmarsなど、よく表現するコンストラクトを使用することをお勧めします(図4)。
CRISPR/Cas9媒介標的突然変異誘発によって変異...
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ディスカッション
このマイクロインジェクションプロトコルは、トランスジェネシスおよびCRISPR/Cas9媒介突然変異誘発のための構築物を S. stercoralis および S. ratti に導入するための方法を詳述する。S. stercoralis と S. rattiの両方について、注射後の生存率およびトランスジェネシスまたは突然変異誘発の速度は、微調整可能ないくつかの変数の影響を受けます。
トランスジェネシスを成功させるための最初の重要な考慮事項は、プラスミド導入遺伝子がどのように構築されるかです。以前の研究では、ストロンギロイデスにおける外因性導入遺伝子の発現には、ストロンギロイデス5'プロモーターおよび3'UTRエレメント3、13、19の使用が必要であることが分かっている。C. ele...
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開示事項
著者らは利益相反がないと宣言しています。
謝辞
pPV540とpPV402は、ペンシルベニア大学のジェームズ・ロック博士からの親切な贈り物でした。原稿に関する有益なコメントをくれたAstra Bryantに感謝します。この研究は、バローズ・ウェルカム基金の研究者から、疾患の病因賞、ハワード・ヒューズ医学研究所教員奨学生賞、国立衛生研究所R01 DC017959(E.A.H.)から資金提供を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| (&マイナス;)-ニコチン、≥99% (GC)、液体 | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | ニコチン 麻痺虫用 |
| 3" 鉄 C クランプ、3" x 2" (容量 x 深さ) | VWR | 470121-790 | C クランプ ベンチトップ |
| アガロース LE | Phenix | RBA-500 | アガロース スライド用 |
| 骨炭、4 ポンド バケツ、10 x 28 メッシュ | Ebonex | n/a | 糞便炭培養 |
| 用木炭骨炭、顆粒、10 x 28メッシュ | 、Reade | bonechar10x28 | 、木炭(上記に代わるもの)、 |
| 粗いマイクロマニピュレーター | 、成茂 | 、MMN-1 | 、粗いマイクロマニピュレーター |
| 、コーニング、Costar Spin-X、遠心分離管フィルター | 、フィッシャー | 、07-200-385 | 、マイクロフィルターカラム |
| 、カバーガラス、48 x 60 mm、厚さNo.1 | ブレインリサーチラボ | 、4860-1 | カバースリップ(48 x 60 mm) |
| 深いペトリ皿、6つの通気口、直径100 mmの | VWR | 82050-918 | 10 cmのペトリ皿(糞便炭文化用) |
| Eiscoレトルトベースw /ロッド | フィ | ッシャー12-000-101 | スタンドベアマン装置 |
| Eppendorf FemtoJetマイクロインジェクターマイクロローダーチップ | VWR | 89009-310マイクロインジェクション針充填用VWR89009-310 | |
| ッシャーブランド吸収性アンダーパッドフィ | ッシャー | 14-206-62 | ベンチペーパー(準備用) |
| フィッシャーブランド鋳鉄リング | フィ | ッシャー14-050CQ | ベアマンOリング |
| フィッシャーブランド三角ポリプロピレンビーカー | フィ | ッシャー14-955-111F | プラスチックビーカー(混合用) |
| フィッシャーブランド三角ポリプロピレンビーカー | フィ | ッシャー14-955-111F | プラスチックビーカー(キャッチバケツ・水バケツ用) |
| フィッシャーブランドの三角ポリプロピレンビーカー | フィ | ッシャー14-955-111F | プラスチックビーカー(x2)(ホルダーを作るため) |
| シリンジのゴリラエポキシ | McMaster-Carr | 7541A51 | 接着剤(チューブを取り付けるため) |
| ハロカーボンオイル700 | シグマ-アルドリッチ | H8898-50ML | ハロカーボンオイル |
| 食品および飲料用高温シリコーンゴムチューブ、1/2 "ID、5/8 "OD | マクマスターカー | 3038K24 | チューブ(漏斗用) |
| KIMAX漏斗、ロングステム、60°;角度、キンブルチェイス | VWR | 89001-414 | ベアマン漏斗 |
| キンバリークラークプロフェッショナル Kimtechサイエンスベンチトッププロテクター | フィ | ッシャー15-235-101 | ベンチペーパー(準備用) |
| 蛍光付きライカ実体顕微鏡 | ライカ | M165 FC | GFP実体顕微鏡 トランスジェニックワームの識別と選別用 |
| マイクロインジェクター 真鍮製ストレートアームニードルホルダー | トライテック | MINJ-4 | マイクロインジェクションニードル |
| ホルダーmicroINJECTORシステム | Tritech | ミンJ-1 | マイクロインジェクションシステム |
| モンゴルのスナネズ | チャールズリバー研究所 | スナネズ | オス4-6週間 |
| のNasco Whirl-Pakの簡単な閉じる袋、18オン | VWR | 11216-776 | Whirl-Pakサンプル袋 |
| ナイロンチュール(メッシュ) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | Baermannホルダー用ナイロンメッシュ |
| プラチナワイヤー、36ゲージ、1インチあたり | トーマスサイエンティフィック | 1233S72 | プラチナ/イリジウムワイヤー、ワームピックピ |
| ューリタン舌圧子、152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | ウッドスティック (サンプルの混合用) |
| QIAprep スピン ミニプレップキット (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN ミニプレップキット |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE S | . rattiのメンテナンスのためのLE Long Evansラット、女性 4-6週間 |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | ラット S. rattiのメンテナンス用、女性 4-6週間 |
| 本当に便利なボックス 蓋付き半透明収納ボックス、容量1.6 L、7-5/8インチ x 5-5/16インチ x 4-5/16インチ | オフィスデポ | 452369 | 加湿チャンバー |
| 用プラスチックボックスシェパードテックボード、8 x 16.5インチ | Newco | 999589 | techboard |
| ステンレス鋼、隆起ワイヤーフロア | 、アンケア | R20SSRWF | ワイヤーケージボトム、 |
| StalkMarket堆肥化可能なカトラリースプーン、6インチ、白、1,000オフィス | デポ | 9587303 | スプーンス |
| テンダーディッシュのパック、スタッキングタイプ、37 x 25 mm | カロライナ(科学) | 741012 | 時計メガネ(小、丸) |
| 実体顕微鏡 | Motic | K-400 LED | 解剖準備スコープ |
| 収納トート、カラー クリア/ホワイト、外高 4-7/8 インチ、外の長さ 13-5/8 インチ、Sterilite | グレインジャー | 53GN16 | 加湿チャンバー用プラスチックボックス |
| サッター P-30 マイクロピペット プーラー | サッター | P-30/P | プラチナ/イリジウム フィラメント付きニードル プラー |
| シラキュース ウォッチ グラス | フィッシャー | S34826 | 時計メガネ(大・丸型) |
| Thermo Scientific Castaloy 固定角クランプ | Fisher | 05-769-2Q | ファンネルクランプ (2x) |
| 3 軸吊り下げジョイスティック オイルハイドロリックマイクロマニピュレーター | Narishige | MM0-4 | ファインマイクロマニピュレーター |
| United Mohr ピンチコッククランプ | Fisher | S99422 | ピンチクランプ (2x) |
| ベント付きシャープエッジシャーレ (直径 60 mm) | Tritech研究 | T3308P | 6センチメートルのペトリ皿(小規模の糞便炭培養用) |
| VWR軽量ティッシュワイ | パーVWR | 82003-820 | 裏地Baermannホルダー |
| 時計ガラス、正方形、カ | ロライナ州1-5 | 742300 | メガネ(小、正方形) |
| Whatman定性的グレードのプレーンサークル、グレード1、直径5.5 | ッシャー09-805B | 濾紙(6センチメートルのペトリ用)皿) | |
| Whatman定性的グレードのプレーンサークル、グレード1、直径9 cm | フィ | ッシャー09-805D | 濾紙(10 cmシャーレ用) |
| World Precision Instrumentホウケイ酸ガラス毛細管、1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | マイクロインジェクション針用ガラス毛細血管 |
| X-Actoナイフ、No.11ブレード付きNo.1ナイフ | デポ | 238816 | ワームピックを保持するためのブレードなしX-Actoナイフ |
| ツァイス AxioObserver A1 | ツァイス | 倒 | 立顕微鏡 |
参考文献
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