集束イオンビーム走査型電子顕微鏡データを用いた細胞内神経細胞の細い構造の3次元再構成と解析

Summary

ユーザーフレンドリーなオープンソースソフトウェアパッケージを使用して、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡画像ボリューム内の薄い細胞内ニューロンプロセスを同定、可視化、定量化するための柔軟な方法論的パイプラインです。

Abstract

近年の走査型電子顕微鏡技術の進歩により、極薄の細胞内プロセスの迅速な3次元(3D)解析が可能になりました。ここでは、他のニューロンのシナプス前ボタン(「スピヌレ」と呼ばれる)に投射するような細いニューロンプロセスを特定、視覚化、分析するための方法論的パイプラインが提示されます。このプロトコルは、無料で入手できるソフトウェアパッケージを使用して、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)の画像ボリューム内の形態学的基準を使用して一般的なニューロン細胞内構造を同定する方法を示しています。特に、シナプス前部に投射する多様なスピノールの同定に特に注意を払っています。特に、このプロトコルでは、ニューロンシナプス内の棘骨を追跡して、これらの薄い細胞内突起、それらの親神経突起、およびシナプス後パートナーの3D再構成を生成する方法について説明します。さらに、このプロトコルには、FIB-SEMデータを分析するための無料で利用できるオープンソースソフトウェアプログラムのリストが含まれており、視覚化と公開のための3D再構成を改善するためのヒント(スムージング、照明など)を提供します。この適応性のあるプロトコルは、FIB-SEM画像ボリューム内の細胞内構造の迅速なナノスケール解析へのエントリーポイントを提供します。

Introduction

ナノメートルの薄さの細胞内部品の構造と機能の関係を調べるには、3Dの可視化と解析が役立つことがよくあります¹。しかし、シリアルセクション透過型電子顕微鏡法の研究は、ダイヤモンドナイフを使用して数百から数千の≥40 nmのシリアル超薄型切片を切断および整列させる必要があるため、時間的および空間的に制約を受けてきました。これらの制約により、薄い(直径<40 nm)細胞内構造をサンプリングして効果的に解析する能力が制限されており、極薄のシリアルセクショニングに習熟する必要性が3D構造解析の応用を妨げてきました^2,3。しかし、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)の最近の進歩により、取得可能な画像ボリュームの速度と解像度に革命が起こり、現在では、滑らかな小胞体^4,5、ニューロンシナプス^3,6、シナプス小胞^7,8などの薄い細胞内構造の定量分析が可能になりました

Protocol

1. 画像量データと細胞内オブジェクトサイズ:考慮事項と登録

1. 関心のある細胞内オブジェクトを含む関心領域の高品質のFIB-SEM画像ボリュームを取得します。
   注:このプロトコルは、思春期後期のフェレット一次視覚野(24.2×16.2×2.4μm、4nm等方性ボクセル)からのFIB-SEM画像ボリュームのセグメントと、成体ラットCA1海馬(10.2×7.7×5.3μm、5nm等方性ボクセル)からの自由にアクセス可能なFIB-SEMボリュームを使用しますノット研究所(https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/)によって利用可能になりました。FIB-SEMイメージング条件下で超微細構造の詳細を保持し、高いコントラストを生成するプロトコルを使用して、FIB-SEM用の組織ブロックを調製することが重要です^23,24。重要なことは、得られたFIB-SEM画像ボクセル解像度が、目的の最小の細胞内構造の直径のサイズ<0.5×になるように組織をイメージングする必要があるということです。例えば、シナプス前部に突出するスピニュールの部位は直径30 nm程度の小ささである可能性があるため、これらの構造をナイキスト基準より上にサンプリングするには、ボクセルサイズ<15 nmが適切です。さらに、等方性....

Results

フェレット一次視覚野における興奮性シナプス前ブートン集団内のシナプス棘の割合の定量化
神経突起から興奮性のシナプス前ボタンへの棘状突起は何十年にもわたって観察されてきたが^19,26、シナプス機能に対するそれらの潜在的な重要性は不明のままである。これらの実験は、フェレットの一次視覚野(V1)における出生後の発達を通じて棘を含む興奮性シナプス前ボタンの割合を決定し、発達のマイルストーンに関連してシナプス機能に対する棘骨の潜在的な重要性を確認するために設計されました。したがって、出生後 (p)21 (15.1 x 14.1 x 2.8 μm)、p46 (9.7 x 8.4 x 2.7 μm)、p60 (24.2 x 16.2 x 2.4 μm)、および >p90 (24.2 x 16.2 x 2.4 μm) フェレット V1 から、52° チルトで FEI Helios 660 DualBeam FIB-SEM を使用してイメージングした、アライメントされた 4 nm/ボクセル等方.......

Discussion

このFIB-SEM画像ボリューム解析パイプラインは、信頼性の高い3D再構成と薄い細胞内構造の定量的測定を行うことができます。深層ニューラルネットワークとセグメンテーションアルゴリズムを用いた現在の半自動技術は、大きな画像ボリューム内で比較的高い膜コントラストを持つ細胞構造を再構築する速度と効率を向上させることができるが³³、多くの細胞内構造(例えば、棘、平滑小胞体、エンドソーム)は、それらの低い膜コントラストおよび/またはねじれのために、自動化された方法を使用して確実に捕捉することは依然として困難である。 しかし、新しい方法では、コントラストの高いミトコンドリアと粗い小胞体を捕捉し始めています^34,35。さらに、非標識細胞内構造(例えば、クラスリン媒介性エンドサイトーシスとクラスリン被覆先端を有するスピヌル、またはエンドソーム対小胞体)との間の微妙な区別は、自動再構成技術の反復的な手動校正を必要とするであろ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
フィジー (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org