集束イオンビーム走査型電子顕微鏡データを用いた細胞内神経細胞の細い構造の3次元再構成と解析

Summary

ユーザーフレンドリーなオープンソースソフトウェアパッケージを使用して、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡画像ボリューム内の薄い細胞内ニューロンプロセスを同定、可視化、定量化するための柔軟な方法論的パイプラインです。

Abstract

近年の走査型電子顕微鏡技術の進歩により、極薄の細胞内プロセスの迅速な3次元(3D)解析が可能になりました。ここでは、他のニューロンのシナプス前ボタン(「スピヌレ」と呼ばれる)に投射するような細いニューロンプロセスを特定、視覚化、分析するための方法論的パイプラインが提示されます。このプロトコルは、無料で入手できるソフトウェアパッケージを使用して、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)の画像ボリューム内の形態学的基準を使用して一般的なニューロン細胞内構造を同定する方法を示しています。特に、シナプス前部に投射する多様なスピノールの同定に特に注意を払っています。特に、このプロトコルでは、ニューロンシナプス内の棘骨を追跡して、これらの薄い細胞内突起、それらの親神経突起、およびシナプス後パートナーの3D再構成を生成する方法について説明します。さらに、このプロトコルには、FIB-SEMデータを分析するための無料で利用できるオープンソースソフトウェアプログラムのリストが含まれており、視覚化と公開のための3D再構成を改善するためのヒント(スムージング、照明など)を提供します。この適応性のあるプロトコルは、FIB-SEM画像ボリューム内の細胞内構造の迅速なナノスケール解析へのエントリーポイントを提供します。

Introduction

ナノメートルの薄さの細胞内部品の構造と機能の関係を調べるには、3Dの可視化と解析が役立つことがよくあります¹。しかし、シリアルセクション透過型電子顕微鏡法の研究は、ダイヤモンドナイフを使用して数百から数千の≥40 nmのシリアル超薄型切片を切断および整列させる必要があるため、時間的および空間的に制約を受けてきました。これらの制約により、薄い(直径<40 nm)細胞内構造をサンプリングして効果的に解析する能力が制限されており、極薄のシリアルセクショニングに習熟する必要性が3D構造解析の応用を妨げてきました^2,3。しかし、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)の最近の進歩により、取得可能な画像ボリュームの速度と解像度に革命が起こり、現在では、滑らかな小胞体^4,5、ニューロンシナプス^3,6、シナプス小胞^7,8などの薄い細胞内構造の定量分析が可能になりました大規模に。さらに、FIB-SEM画像ボリュームの広範な使用により、自由にアクセスできるFIB-SEM画像ボリュームリポジトリ⁹および3D解析ソフトウェア(Espina¹⁰、IMOD¹¹、Neuromorph¹²、Reconstruct¹³、TrakEM¹⁴など)の開発が加速し、この技術の範囲が広がり、微細な細胞内構造の構造と機能の調査が可能になりました。

そのようなナノスケールの細胞内機能の一つが、ニューロンのシナプス「棘」です。棘は細く(幅0.06-0.15μm、長さ0.1-1μm)、指のような突起で、1つのニューロンから発せられ、別のニューロンの神経突起(例えば、シナプス前ブートン)によってカプセル化されるようになる^15,16。ニューロン突起に埋め込まれた棘は、ほぼ60年間電子顕微鏡の文献で報告されており¹⁷、棘のような突起は、興奮性シナプスの保存された18,19,20および遍在する^21,22の特徴です。それにもかかわらず、シナプス棘が広く普及しているにもかかわらず、その機能は不明瞭なままであり、その存在量と構造的保存を説明するために必要なデータが不足しています。棘骨の実験的特性評価の欠如は、主に棘骨の有病率とサイズを定量的に分析することの難しさによるものです。その小さな寸法は、これまで達成できなかったz(深さ)分解能(つまり、≤15nm)を使用した分析に最も適しています。

ここでは、FIB-SEMの新規参入者や専門家のエントリーポイントとして役立つ可能性のある薄い(断面積≤40 nm幅)細胞内構造を同定、視覚化、分析するためのFIB-SEM分析パイプラインを紹介します。このプロトコルは、3D FIB-SEM画像ボリューム内のニューロン細胞内構造を同定するための入門書として機能し、特定の基準を使用してスピノールとシナプスのサブタイプを認識および分類する方法を強調しています。さらに、このプロトコルは、画像ボリュームを無料の3D解析ソフトウェアプラットフォーム(Reconstruct)にインポートし、このソフトウェアを使用して興奮性ニューロンシナプス内の棘を追跡し、これらの細胞内投影、その親神経突起、およびカプセル化されたシナプス前ボタンの3D再構成を生成する方法を示しています。最後に、このプロトコルでは、無料のオープンソース3Dレンディングソフトウェア(Blender)を使用して、視覚化と公開の可能性のために3D再構成の「スキン」を滑らかにする方法を示し、この手法の利点と潜在的な落とし穴について詳しく説明します。

Protocol

1. 画像量データと細胞内オブジェクトサイズ:考慮事項と登録

1. 関心のある細胞内オブジェクトを含む関心領域の高品質のFIB-SEM画像ボリュームを取得します。
   注:このプロトコルは、思春期後期のフェレット一次視覚野(24.2×16.2×2.4μm、4nm等方性ボクセル)からのFIB-SEM画像ボリュームのセグメントと、成体ラットCA1海馬(10.2×7.7×5.3μm、5nm等方性ボクセル)からの自由にアクセス可能なFIB-SEMボリュームを使用しますノット研究所(https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/)によって利用可能になりました。FIB-SEMイメージング条件下で超微細構造の詳細を保持し、高いコントラストを生成するプロトコルを使用して、FIB-SEM用の組織ブロックを調製することが重要です^23,24。重要なことは、得られたFIB-SEM画像ボクセル解像度が、目的の最小の細胞内構造の直径のサイズ<0.5×になるように組織をイメージングする必要があるということです。例えば、シナプス前部に突出するスピニュールの部位は直径30 nm程度の小ささである可能性があるため、これらの構造をナイキスト基準より上にサンプリングするには、ボクセルサイズ<15 nmが適切です。さらに、等方性(すべての次元で等しい)解像度(5 x 5 x 5 nmボクセルなど)で組織をイメージングすると、すべてのx/y/z平面で等しい寸法を持つ微細構造の視覚化と再構成が可能になります。
2. ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads) のフィジーディストリビューションをダウンロードしてインストールします。
3. 画像のボリュームを揃えます。
   注:最新のFIB-SEMシステムは、ほぼ整列した画像ボリュームを生成しますが、画像から画像へのレジストレーションは依然としてサブピクセルドリフトに悩まされる可能性があります。
   1. フィジーで、[ プラグイン] |[Registration ] をクリックし、[ Register Virtual Stack Slices] を選択します。サポートについては、ユーザーマニュアル(https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices)を参照してください。リジッド登録から開始し、必要に応じてアフィン手法を使用します。
4. 画像のボリュームをスケーリングします。
   1. フィジーで整列された画像ボリュームを開くには、[ ファイル] |インポート |Image Sequence をクリックし、整列された画像があるフォルダーに移動します。
   2. ダイアログウィンドウで、画像の名前が番号順に並んでいる場合は、[ 名前を数字順に並べ替え る]をクリックします。 [仮想スタックを使用して フィジーのパフォーマンスを高速化する]をクリックします。
   3. 画像が開いたら、[ 画像] |[プロパティ ] をクリックし、ピクセルの高さ、幅、および深度ボックスに、画像ボリューム ピクセルの物理サイズ (マイクロメートル単位) を挿入します。右端の各ボックスに um OR μm と入力します。この位置合わせされたイメージ ボリュームを .tiff ファイルとして保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。
      注:画像が拡大縮小された場合、画像の上部は画像のサイズをマイクロメートルで示す必要があります(例:9.82 x 8.65 μm)。

2. 神経突起とシナプス棘の同定

1. (矢印キーまたはマウスホイールを使用して)スタックをスクロールしながら、神経突起識別決定木(図1)と切片化された神経突起の例(図2)を参照して、目的のオブジェクトを見つけて識別します。
   1. シナプス棘は、シナプス前神経またはシナプス後神経突起に完全に包み込まれる神経突起からの膜結合突起として識別します。
      注:正のシナプス棘の同定には、シナプス前またはシナプス後構造の逆膜に陥入する棘突出物体膜の視覚的な証拠と、少なくとも1つの画像でシナプス前またはシナプス後構造の膜によって完全にカプセル化された膜結合棘の存在が必要です。
2. フィジーにおける関心領域(ROI)の作成
   1. フィジーのツールバーで適切なツール(楕円ツールなど)をクリックし、画像をクリックしてドラッグし、ROIを形成します。この ROI を ROI マネージャーに記録するには、文字 "T" を入力します。
      注: ROI マネージャーは 、画像座標をデフォルト名として表示されるはずです。
   2. ROI マネージャーの [名前の変更] ボタンをクリックし、表示されるテキスト ボックスに目的の名前を入力します。定量的基準に基づいて ROI の名前を変更します (たとえば、分析され、シナプス後棘を持つ 2 つのシナプスを持つ 12^番目のシナプス前ボタンは、B12_s,s という名前が付けられます)。
      注:各ROIを(画像スタック全体に存在するのではなく)1つの画像の「スライス」に関連付け、ROI名を1つの画像に表示するには、ROIマネージャー|もっと |[オプション] ウィンドウをクリックし、ROI マネージャーの下部にある [すべて表示] チェック ボックスと [ラベル] チェック ボックスをオンにします。この手順は、ROIを個々の画像ではなく画像ボリューム全体に関連付けると、ボリューム内のオブジェクトが二重にカウントされる可能性があるため、画像ボリューム内にROIを保存する場合に重要であることに注意してください。
   3. ROI マネージャーに現在あるすべての ROI をファイルとして保存するには、まず、ROI マネージャーの [選択解除] ボタンをクリックし、[その他] ボタンをクリックして、[保存] まで下にスクロールします。
      注:この保存された.zipファイルをフィジーで開いて、これらすべてのROIを ROIマネージャーに再ロードできるようになりました。

3. 対象領域を特定し、画像量を3D解析ソフトウェアに転送します

1. 画像ボリューム全体を3D再構成および解析ソフトウェアに転送することが望ましいか、または元のスタックから少数の画像や関心領域を分析するために、より小さなサブスタック(3.3.2を参照)を作成する必要があるかを判断します。
2. 対象オブジェクトを含む比較的小さな領域で小規模な「パイロット」スタディを実行し、効果サイズと、統計的比較に必要な検出力を得るために必要な対象オブジェクトの数を推定します。これらの細胞内オブジェクトが画像ボリューム内に不均一に分布している場合、対象オブジェクトをサンプリングするために必要な画像ボリュームのサイズを控えめに見積もってください。
3. 画像ボリュームの一部を3D解析に使用するには、まず[Image |[複製]。
   1. 画像のトリミングされた部分を分析に使用するには、フィジーのツールバーから 長方形ツール を選択し、目的の関心領域を描画します。これが望ましくない場合は、次の手順に進みます。
   2. 画像に移動 |スタック |ツール |サブスタックを作成します。サブスタックに含める画像の範囲を入力します (たとえば、テキスト ボックスに 1 から 500 を入力して画像 1 から 500 を含めます)。
   3. 上記のサンプリングに関する考慮事項(1.1以降に注意してください)を参照して、対象のオブジェクトのサイズに基づいて必要なz解像度を決定します。たとえば、画像ボリュームのボクセル深度が 5 nm の場合、Z 次元で 10 nm 間隔で対象オブジェクトをサンプリングして、フィジーがサブスタック内の他のすべての画像を保持できるようにすることができます。これを行うには、範囲の後に n 番目の画像の番号を入力します (たとえば、1 から 500 の画像範囲に他のすべての画像のみを含めるには、 1 - 500 - 2 と入力します)。
      注:各3D解析ソフトウェアパッケージ( 表1を参照)には、独自のファイルインポート要件があります。このプロトコルは、.tiffファイルとして保存されたイメージボリュームをイメージボリュームソフトウェア Reconstructにインポートすることに焦点を当てています。

Reconstructにおける4. 3Dの再構築と薄い細胞内構造の解析

注: Reconstructを使用する際にホイール付きのマウスを使用すると非常に有利です。さらに、ほとんどまたはすべてのトレースを手動で実行する場合は、タッチスクリーンを備えたコンピューターでスタイラスを使用してアウトラインを描画すると、トレースの効率が大幅に向上します。

1. ネイティブ環境または仮想環境でMicrosoft Windowsを実行しているコンピューターで使用するために 、Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)をダウンロードしてインストールします。
2. 新しい再構築を開始するには、再構築ファイル用の新しいフォルダを作成し、[ Series |[新規作成]を選択し、この再構築(.serファイル)を目的のファイル名で作成したばかりのフォルダに保存します。
3. 保存した.tiff画像ボリュームを Reconstructにインポートします。
   1. シリーズに移動 |インポート |「イメージ」をクリックし、「イメージのインポート」ウィンドウで「選択」をクリックし、イメージ・ボリューム・ファイルを見つけます。「イメージのインポート」ウィンドウで、ボリューム内のイメージごとに別々の行として表示されるイメージ・ボリューム・ファイルを探します。
   2. 重要: [ピクセル サイズ] テキスト ボックスに、画像ボリュームの x/y ピクセル サイズ (μm) に対応する正しいピクセル サイズを入力します。これが完了したら、[画像のインポート]ウィンドウの[インポート]ボタンをクリックします。
      注: 画像がインポートされると、[ 再構築 ] ウィンドウの中央に画像が表示され、[ 画像のインポート] リスト は空になります。
   3. 再構築ウィンドウの中央に画像があり、画像のインポートリストが空の場合は、画像のインポートウィンドウで終了をクリックします。
   4. 断面の厚さ(ボクセルの高さまたはz寸法)を設定するには、[断面]をクリックします。セクションを一覧表示し、リストされたすべてのセクションを強調表示してから、[変更] |[Section List]メニューに厚さを入力し、テキストボックスにセクションの厚さ(μm単位)を入力します(たとえば、厚さ5 nmのセクションの場合は0.005)。
      注:n番目のセクションのみを含む大きな元の画像ボリュームのサブスタックで作業する場合(ステップ3.3.3を参照)、セクションの合計厚さでこれらの「欠落している」セクションを考慮に入れる必要があることを思い出してください。たとえば、元の画像ボリュームのセクションの厚さ (別名ボクセルの高さ) が 0.005 μm で、サブスタックに 3 つおきのセクション (1-500-3 など) のみが含まれている場合、このサブスタックのセクションの厚さは 0.015 μm (0.005 μm x 3 セクション) です。
4. 関心のあるオブジェクトのトレースを作成します。
   1. シリーズ一覧へ |オプション |「名前/色」タブで は、新しいオブジェクトに名前を付けます。オブジェクトのトレースのアウトラインと内部の塗りのカラーを選択し、[ OK]をクリックします。
      注: Reconstruct は、同じ名前のすべてのトレースを 1 つのオブジェクトとして接続しようとします。トレースの命名規則については、 Reconstruct のマニュアルを参照してください (たとえば、名前にスペースを含めないでください)。トレースの色は、トレースを視覚化するためのものです。このオブジェクトの 3D 再構築の色は、後で簡単に変更できます。
   2. ツールバーで、鉛筆のような形をした [フリーハンドで描画 ]ツールを選択します。マウスの左ボタンを押したままマウスをドラッグして、オブジェクトの膜をトレースします。マウスの左ボタンを離すと、トレースがオートコンプリートされます。 「Page Up」/「Page Down 」をクリックするか、マウスホイールを使用して画像ボリューム内の次の光学セクションに進み、構造が完成するまで徐々にトレースを作成します。
5. シナプス棘のトレース
   注:シナプス前部ボタン内に埋め込まれた棘は、膜に結合した透明な構造として現れ、時折、その内部にアクチン様の電子不透明な材料および/または膜のような折り目があります。
   1. 画像ボリュームを進め、スピヌレがシナプス前ボタンに陥入する部位を特定し、スピヌレを小胞体、液胞、エンドソーム、オートファゴソーム、およびその他の細胞内小器官と区別するように注意します。
      注:膜結合オルガネラとは異なり、シナプス棘は常に神経突起/グリア(すなわち、斜視膜)から突出し、シナプス前またはシナプス後構造(すなわち、逆膜)によって受け取られることを確認してください。この棘骨陥入の視覚的証拠は、≥2画像で発生し、完全にカプセル化された膜結合棘が≥1画像のシナプス前またはシナプス後構造内に存在するはずです。小さなスピヌルはクラスリンコーティングされている場合があります。クラスリン被覆エンドサイトーシスからシナプス前神経またはシナプス後神経へのスピヌレ陥入イベントを区別するには、クラスリン被覆スピヌルの確実な同定には、同じ画像内のシナプス前またはシナプス後構造の逆膜に突出するスピヌル親オブジェクトからの一致するエバーティング膜を視覚的に確認する必要があります。
   2. 画像ボリュームを前進して、親神経突起/グリアからの棘突起/起源の部位を特定します。 図 1 と 図 2 を参照して、これらの親構造を識別します。
   3. 受容構造(例えば、シナプス前ブートン)への膜突出の部位で棘のトレースを開始し、カプセル化するシナプス前または後神経突起内に膜結合構造として現れる限り、棘を描き続けます。
   4. マウスの左ボタンを押し続けます(または、タッチスクリーンコンピューターを使用している場合はスタイラスで棘膜に沿って描き続けます)マウスポインタで棘の膜をトレースします。
   5. トレースが開始されたポイントに到達したら、マウスの左ボタンを離します。
      注: マウスの左ボタンを離すのが早すぎると、トレースがオートコンプリートされ、多くの場合、望ましくない結果が生じます。これが発生した場合は、このトレースがトレースリストで強調表示されている間に削除を押すだけです。
   6. スピノールが出現するすべてのセクションについて、手順4.5.2〜4.5.5を繰り返します。
      注:必要に応じて、棘をブートン内のカプセル化された膜結合構造としてトレースすることを忘れないでください。 Reconstruct は、カプセル化された細胞内構造(例えば、棘小骨、細胞内小器官)をカプセル化構造の体積から自動的に引き落とすことを許可しないため、これは 事後 的に行うことができます(例えば、単にシナプス前部ブートンの総体積から棘の体積を差し引くことによって)。
6. Reconstructで3Dでオブジェクトを再構築する
   1. シリーズに移動 |オプション |[3D] タブに移動し、[ トレース] ラジオ ボタンがクリックされていることを確認します。
   2. オブジェクトリストを開くには、「 オブジェクト |オブジェクトを一覧表示します。
   3. トレースされたオブジェクトの名前がウィンドウに読み込まれたら、 オブジェクトリストで オブジェクトの名前をダブルクリックして3Dで表示します。 3D Scene ウィンドウが表示されるのを待ちます。
   4. 各オブジェクトの [オブジェクト リスト ] でトレースの開始、終了、およびカウントが正しいこと ([カウント] = [終了 - 開始]) であることを確認します。オブジェクトの Count ≠ End - Start の場合、このオブジェクトの 1 つ以上のトレースが誤って省略されている可能性があります。
   5. オブジェクトの3Dトレースを回転させるには、マウスの左ボタンを押したままマウスを動かすか、マウスの右ボタンを押したままマウスを前後に動かしてズームインおよびズームアウトします。オブジェクトのトレースが適切に位置合わせされていること、および連続する各トレース間でスムーズな遷移があるように見えることを確認します。
   6. 必要に応じて、個々のトレースをリトレースして、シャープなエッジやトレース間の遷移につながるエラーを削除します。
   7. 四面体メッシュ スキン をオブジェクトに配置するには、[ Series |オブジェクト |3Dタブ をクリックし、 Boissonnatサーフェス のラジオボタンをクリックします。
   8. 3D Sceneウィンドウで、Scene |クリアしてから、オブジェクトリストで目的のオブジェクト名をダブルクリックします。
   9. オブジェクトを回転させてトレース間の遷移をスムーズにし、必要に応じてトレースを再描画します。
   10. オブジェクトの色と透明度を変更するには、オブジェクトリストでオブジェクトの名前をクリックし、次にシーン|色/透明度...(オブジェクトリスト) メニュー。[オブジェクト リスト] でオブジェクト名をダブルクリックすると、この変更が 3D シーン ウィンドウに表示されます。
       注:オブジェクトの色、透明度、およびスムージングは、Blenderを使用して、より高度な制御と特異性で変更できます(5.4-5.6を参照)。
7. 3Dオブジェクトの定量分析
   1. シリーズに移動 |オプション |「リスト」タブ をクリックし、このウィンドウの 「オブジェクトリスト 」セクションと 「トレースリスト 」セクションで必要な測定値をすべてクリックします。
   2. オブジェクトリスト(オブジェクト|オブジェクトをリスト...)をクリックし、[リスト] |保存します。
   3. オブジェクトリストに表示されているオブジェクトの測定値をカンマ区切りのファイル(.csv)として保存します。
   4. .csvファイルを任意のデータ分析ソフトウェアにインポートします。スプレッドシート(Microsoft Excelなど)にインポートするには、ファイルをダブルクリックするか、新しい空白のワークブックを開き、[ ファイル]|インポート |CSV ファイル オプションを選択し、指示に従います。
   5. 3Dでオブジェクト間の距離を測定する(たとえば、シナプス前ボタン内のシナプス棘の投影距離を測定する)には、ReconstructのZ-trace関数を使用します。
   6. まず、トレースに新しい名前を付けるには、 Series |オプション |「名前」/「色」タブ をクリックし、Z トレースの名前を入力します。
   7. 次に、ツールバーの Z-trace ツールをクリックします。
   8. シナプス棘の投影距離のZトレースを描画するには、マウスの左ボタンをクリックしてシナプス棘の始点をクリックし、 次にPage Up または Page Down ボタンを押して、各セクション内のシナプス棘の膜に沿った連続する点をクリックしながら、画像ボリュームを進めます。
   9. このZ-トレースを完了するには、マウスの右ボタンをクリックします。
   10. Z-trace測定値をエクスポートするには、Trace |トレースを一覧表示...をクリックしてトレースリストを表示し、[リスト] |「保存」は、トレース・リストの測定値を.csvファイルとして保存します。
8. スケール キューブの追加
   1. スタック内の最初または最後の画像のいずれかに移動します
   2. シリーズ一覧へ |オプション |「名前/色」タブ をクリックし、スケールキューブの名前を入力します。
   3. ツールバーで、長方形の描画ツールを選択し、オブジェクトに隣接して小さな正方形(サイズは重要ではありません)を描画しますが、オブジェクトを隠さないようにします。シリーズ一覧へ |オプション |[3D]タブで、[生成]エリアの[ボックス]ラジオボタンオプションをクリックし、[サイズ]エリアの[A:]、[B:]、[C:]ボックスに寸法を入力して、スケールキューブのサイズ(μm単位)を指定します(たとえば、A、B、Cに0.5を入力して0.5 μm/辺のスケールキューブを生成します)。
      注:スケールキューブを3Dで再構築する前に、 トレース または Boissonnatサーフェス オプションを使用して、目的の3Dオブジェクトが3Dシーンですでに再構築されていることを確認してください。スケール キューブを再構築した後 (つまり、手順 4.8.5 の後) に、[ 生成 ] オプションを Boissonnat サーフェス に戻し、A、B、C のサイズを -1 に戻すことを忘れないでください。
   4. オブジェクトリストを開き、スケールキューブの名前をダブルクリックします。スケール キューブが 3D シーン ウィンドウに表示されるのを待ちます。
   5. スケール キューブを他のオブジェクトに対して相対的に移動するには、[Series |オプション |[3D]タブに移動し、スケールキューブをX、Y、および/またはZボックスに移動するために必要なμm数を入力します。[OK] をクリックしてウィンドウを閉じ、[オブジェクト一覧] でスケール キューブの名前をダブルクリックします。
      注:または、これはBlenderを使用して行うこともできます(以下を参照)。

5. Blenderでの3D再構築のインポート、色の変更、スムージング、および透明度の追加

注意: Blenderの使用に関する詳細なサポートについては、 Blender のマニュアルおよび/または各 Blender 機能の使用に関する無数の「ハウツー」ビデオを参照してください(単に Webブレンダー と 目的の機能を検索します)。以下では、3D再構築の色を変更し、滑らかにし、透明度を追加する方法について簡単に説明します。

1. 無料のオープンソース 3D ソフトウェアスイート (www.blender.org) である Blender の最新バージョンをダウンロードしてインストールします。
2. Reconstructで、3Dシーンウィンドウで目的のオブジェクトを表示し、[シーン]|名前を付けてエクスポート |VRML 2.0 です。
3. Blenderで、File |インポート |X3D 拡張可能 3D (.x3d/.wrl)。Reconstructから保存したVRML 2.0ファイルをクリックし、次にImport X3D/VRML2ボタンをクリックします。
4. 再構築の色を変更します。
   1. [シーン コレクション]ウィンドウの右上隅で、既定の Cube オブジェクトの目のアイコンをクリックまたは選択解除し、個々のオブジェクトの名前をクリックしてシーン内の各オブジェクトをハイライト表示します。必要に応じて、これらのオブジェクトの名前を変更します。
   2. シーンコレクションウィンドウで色を変更する最初のオブジェクトの名前をクリックします。
   3. 円形の コンテキストをクリックします。 右側の アイコンの下部にあるマテリアルアイコンをクリックし、[ マテリアルの追加]をクリックします。オプションのリストは下に表示されます。次に、 ベースカラー オプションを選択し、オブジェクトに必要な輝度と色相を選択します。
   4. オブジェクトのメタリックな外観、光沢、反射品質を変更するには、 メタリック、スペキュラー、ラフネス、 および光沢 のオプションを調整して、目的の効果を生み出します。
      注: シーンに特定のオプション(透明度、光沢など)を表示するには、[ ビューポート シェーディング: ルック デベロップ](Viewport Shading: Look Dev )または [ビューポート シェーディング: レンダリング](Rendered Viewport)設定に含める必要がある場合があります。いずれかのビューポート設定に変更するには、右上の 地球儀 のアイコンにカーソルを合わせ、目的のビューポート設定をクリックします。
   5. ライティング角度を変更するには、シーン コレクション ウィンドウでライト オブジェクトをクリックし、右上の Show Gizmo アイコンをクリックしてから、シーンの周りでライトをドラッグして目的のライティング効果を実現します。ライト オブジェクトを選択したときにシーン コレクション ウィンドウの下に表示されるオブジェクト データ ウィンドウで、ライトの強度を変更します。
   6. 選択した軸のオブジェクトを個別に回転させるには、シーンコレクションウィンドウでオブジェクトの名前をクリックし、Rキーを押してから、回転軸の文字(x、y、zキー)をクリックし、マウスを動かして目的の回転を生成します。オブジェクトをつかんで移動するには、シーンコレクションウィンドウでオブジェクトを選択し、Gキーを押してから、マウスを使用してシーン内でオブジェクトを移動します。
5. 再構築をリメッシュ(つまり、スムーズ)します。
   1. シーンコレクションウィンドウで目的のオブジェクトの名前をクリックし、ジンボールとマウスホイールを使用してオブジェクトの中央にズームインします。
   2. 右側のアイコン ストリップにある Context.Modifiers レンチ アイコンをクリックし、[ モディファイアを追加] をクリックしてから、[ 再メッシュ ] ( [生成 ] 見出しの下) をクリックします。ドロップダウンメニューを使用して [スムーズ]を選択し、[ スムーズシェーディング ]ボタンをクリックして、[ オクツリーの深さ ]と [スケール ]を変更して目的の滑らかさを実現します。
      注: リメッシュ中にビューポート シェーディング: ワイヤフレーム ウィンドウ (右上の地球 儀アイコン オプション) で結果を直接表示すると便利です。リメッシュは、オブジェクト上に異なるサイズの四面体メッシュを作成します。オブジェクトをスムージングしてセクショニングやトレースアーティファクトを削除するときは、元の形状と輪郭を保持するように注意してください。 オクツリーの深さ = 7 とスケール = 0.95 から開始し、必要に応じてこれらの数値をゆっくりと減らします。棘骨やシナプス後密度などの小さくて薄い物体は、体積が小さいため、元の形状を変更せずに実行できるスムージングの範囲が狭くなるため、特に注意してください。
6. オブジェクトに透明度を追加します。
   注:オブジェクトを透明にすることは、別のオブジェクト(シナプス前ボタンなど)内に存在する1つのオブジェクト(例:棘、シナプス前小胞、ミトコンドリア、エンドソーム)の3D関係を示すことが望ましい場合に重要です。
   1. シーンコレクションウィンドウで目的のオブジェクト名をクリックします。コンテキストの一番下までスクロールします。マテリアルウィンドウ(右側のリストの右下のアイコン)で[設定]セクションを開き、ドロップダウンメニューを使用して[ブレンドモード]を[アルファブレンド]に変更します。次に、[サーフェス] セクションを開き、[アルファ] までスクロールして、数値を 1 未満の値 (1 = 完全に不透明、0 = 完全に透明) に変更します。
7. 3D再構築のスナップショットをエクスポートします。
   1. 3D再構築に最適な色付け、スムージング、および照明を取得したら、メニュー見出し の[ウィンドウ]をクリックし、[ スクリーンショットを保存]を選択して、シーン内に画像を保存します。
   2. 左下の[ スクリーンショットを保存 ]オプションで、ファイルの種類、色形式、および圧縮を選択します。
   3. 上のファイル名テキストボックスに新しいスクリーンショット の名前 を入力し、スクリーンショットを目的の場所に保存します。

Results

フェレット一次視覚野における興奮性シナプス前ブートン集団内のシナプス棘の割合の定量化
神経突起から興奮性のシナプス前ボタンへの棘状突起は何十年にもわたって観察されてきたが^19,26、シナプス機能に対するそれらの潜在的な重要性は不明のままである。これらの実験は、フェレットの一次視覚野(V1)における出生後の発達を通じて棘を含む興奮性シナプス前ボタンの割合を決定し、発達のマイルストーンに関連してシナプス機能に対する棘骨の潜在的な重要性を確認するために設計されました。したがって、出生後 (p)21 (15.1 x 14.1 x 2.8 μm)、p46 (9.7 x 8.4 x 2.7 μm)、p60 (24.2 x 16.2 x 2.4 μm)、および >p90 (24.2 x 16.2 x 2.4 μm) フェレット V1 から、52° チルトで FEI Helios 660 DualBeam FIB-SEM を使用してイメージングした、アライメントされた 4 nm/ボクセル等方...

Discussion

このFIB-SEM画像ボリューム解析パイプラインは、信頼性の高い3D再構成と薄い細胞内構造の定量的測定を行うことができます。深層ニューラルネットワークとセグメンテーションアルゴリズムを用いた現在の半自動技術は、大きな画像ボリューム内で比較的高い膜コントラストを持つ細胞構造を再構築する速度と効率を向上させることができるが³³、多くの細胞内構造(例えば、棘、平滑小胞体、エンドソーム)は、それらの低い膜コントラストおよび/またはねじれのために、自動化された方法を使用して確実に捕捉することは依然として困難である。 しかし、新しい方法では、コントラストの高いミトコンドリアと粗い小胞体を捕捉し始めています^34,35。さらに、非標識細胞内構造(例えば、クラスリン媒介性エンドサイトーシスとクラスリン被覆先端を有するスピヌル、またはエンドソーム対小胞体)との間の微妙な区別は、自動再構成技術の反復的な手動校正を必要とするであろ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
フィジー (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org