本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。
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この記事について
サマリー
要約
脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞は、適切な特徴を示し、再生臨床応用のためのアクセス可能な供給源であるため、ますます魅力的になっています。脂肪由来幹細胞を得るために、異なるプロトコルが使用されている。この記事では、より大量のADSCを得るために改良された時間節約プロトコルのさまざまなステップについて説明し、ADSCを凍結保存および解凍して培養増殖用の生細胞を取得する方法を示します。その後待機的腹部形成術を受けた9人の患者の腹部から、26cmの3穴および3mm口径のシリンジ脂肪吸引を使用して、100ミリリットルの脂肪吸引液を採取した。幹細胞の単離は、カルシウムを添加したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液およびコラゲナーゼの使用による一連の洗浄で行った。間質血管画分(SVF)細胞を凍結保存し、その生存率をイムノフェノタイピングによって確認しました。SVF細胞収量は15.7 x 105 細胞/ mLであり、6.1〜26.2細胞/ mLの範囲でした。接着性SVF細胞は平均7.5(±4.5)日後にコンフルエントに達し、平均細胞収量は12.3(± 5.7)x 105 細胞/mLでした。8ヶ月、1年、2年後の解凍SVFの生存率は23.06%〜72.34%の範囲で、平均47.7%(±24.64)であり、2年間の凍結の場合と相関する生存率は最も低かった。カルシウムとバッグの休止時間を補ったDPBS溶液を使用して脂肪を沈殿させ、コラゲナーゼ消化時間を短縮すると、幹細胞の最終細胞収量が増加しました。生幹細胞を高収率で得るための詳細な手順は、以前の研究の技術よりも時間と細胞収率に関してより効率的でした。長期間の凍結保存後でも、SVFに生菌ADSC細胞が見出された。
概要
ヒト間葉系幹細胞は、基礎研究と応用研究の両方で有利です。この成体細胞型の使用は、胚や他の細胞の使用と比較して倫理的問題を克服し、腫瘍領域、変性疾患の治療、再建手術領域2,3,4の治療など、自家組織再生工学および細胞治療における最も有望な研究分野の1つです。5.脂肪組織の間質血管細胞画分には間葉系多能性および多能性幹細胞の豊富な供給源があることが以前に報告されている6,7。これらのADSCは、最小限の侵襲的手順から、ex vivoでの強力な増殖能力を有するかなりの数の細胞を高収率で容易に得ることができるため、細胞療法および移植/注入に使用するための優れた候補と考えられている5,8。
また、脂肪組織は、他の2つの供給源(骨髄および臍帯組織)よりも間葉系幹細胞を提供する能力が高いことも実証されました
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プロトコル
本研究は、UNIFESPの倫理委員会(プロトコル番号:0029/2015 CAAE:40846215.0.0000.5505)によって承認され、 ヘルシンキ宣言(2004)に従って患者から書面によるインフォームドコンセントを取得した後に実施されます。本研究のサンプルは、33〜50歳(平均年齢41.5歳)および平均初期ボディマス指数(BMI)24.54(22.32〜26.77の範囲)(表1)の9人の女性患者で構成されています 妊娠後の皮膚の過剰のために審美的腹部形成術を受けた人、 サンパウロ連邦大学(UNIFESP)の形成外科部門で、 ブラジル。バイアスを減らすために、患者は性別、年齢、およびBMIを考慮して同種グループとして選択されました。この研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。
1.脂肪吸引液の採取
注:この手順は手術センターで実行する必要があります。
- 皮膚の準備と無菌のために4%グルコン酸クロルヘキシジン( 材料の表を参照)を使用してください。
- 2 mmの皮下皮膚切開(真皮下と腱膜の間)を行います。口径26 mm 3 Gの3穴と3 mm口径のクラインカニューレとシリンジを挿入して、生理食塩水(1:1,000,000)で....
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結果
年齢、体重、身長、BMIなど、調査した9人の個人の特徴を 表1に示します。
最初に提示した細胞収量に従って、培養液に接種される細胞量は、75cm2 培養フラスコの容量にできるだけ近いと計算した。それぞれの場合において播種したサンプル量を 表2に記載する。次に、初期細胞収量に従って、各サンプルの可変容量の細胞を決定しました:細胞収量が高いサンプルの場合は1 mL、中間の細胞収量を持つサンプルの場合は1.1 mL、細胞収量が低いサンプルの場合は2 mLで、ケース間でより類似した細胞播種を実行します。培養が約80%〜90%のコンフルエント(図2A)に達した時点で(約7.5±4.5日目)、接着細胞のトリプシン処理を行った(表2 および 図2B)。
継代1前の細胞収率は、トリプシン処理前に同じコン.......
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ディスカッション
単離収率
細胞療法で頻繁に必要とされる凍結保存プロセスは、時には50%を超える重大な細胞損失をもたらすことは十分に確立されています29,30,35。したがって、単離して高い初期細胞収量を得るための技術的改善が基本である。脂肪吸引液の採取方法と細胞の単離方法は、細胞の長期培養と操作を考慮しながら、より多くの細胞を保存し、高い生存率を維持し、初期材料から最大数の細胞を抽出することに焦点を当てる必要があります。したがって、細胞療法は患者にとって効果的で安全である可能性が高いため、細胞をアポトーシス、老化、または遺伝的不安定性から遠ざけるために、まっすぐな培養維持が必要です。
私たちの知る限り、脂肪吸引に由来する間葉系幹細胞の単離にこの一連の手順を使用した以前の記事はなく、その結果、時間の節約と費用便益の技術が得られます。この研究では、各方法論的ステップは、細胞単離.......
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開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
謝辞
ボランティアで参加してくださった患者さん、サンパウロ病院の医療・看護スタッフに感謝します。この研究は、サンパウロ州アンパロ・ペスキサ・ド・エスタード・デ・サンパウロ財団(FAPESP)およびブラジルのコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロヒコ(CNPq)の支援を受けた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.8 mL クライオバイアル | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL ポリ塩化ビニル トランスファーバッグ | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% アリザリン レッド S 溶液、pH 4.2 | シグマ アルドリッチ | A5533 | |
| アドレナリン (1 mg/mL) | ヒポレイバー | NA | |
| アルシアン ブルー 溶液 | シグマ アルドリッチ | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| 塩化カルシウム 10% | メルク | 102379 | |
| グルコン酸クロルヘキシジン 4% | VIC PHARMA | NA | |
| コラゲナーゼ、I型、粉末 | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with Calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal wevine serum | Gibco | 10500056 | |
| ホルムアルデヒド 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| 倒立光学顕微鏡 | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| モノクローナル抗体 CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| モノクローナル抗体 CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| モノクローナル抗体:CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| モノクローナル抗体:CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| モノクローナル抗体:CD45 | DAKO | M0701 | |
| モノクローナル抗体:CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| モノクローナル抗体:CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| モノクローナル抗体:HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty 冷凍容器 | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (リン酸緩衝生理食塩水) 1x pH 7.4 | Gibco | ||
| StemPro 脂肪形成分化キット | Gibco | A1007001 | |
| StemPro 軟骨形成分化キット | Gibco | A1007101 | |
| StemPro 骨形成分化キット | Gibco | A1007201 | |
| 針注入部位付きスパイク1本付き滅菌コネクタ | Origen Biomedical Connector, USA | NA | コードマークIBS |
| トリパンブルー溶液0.4% | シグマアルドリッチ | 93595 | |
| トリプシン-EDTA0.25%1x、フェノールレッド | Gibco | 25200056 |
参考文献
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a....
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