可視域で動作する単純な分光光度計を使用して、グリコーゲン代謝の重要な酵素の活性を測定する技術が提示されます。
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この記事について
サマリー
要約
グリコーゲンは、細菌から動物に至るまで、さまざまな生物によってグルコースの貯蔵形態として合成されます。この分子は、α1,6結合の付加によって導入された分岐を有するα1,4結合グルコース残基の直鎖を含む。グリコーゲンの合成と分解がどのように制御され、グリコーゲンがその特徴的な分岐構造をどのように達成するかを理解するには、グリコーゲン貯蔵の酵素の研究が必要です。しかしながら、これらの酵素活性を研究するために最も一般的に使用される方法は、典型的には、すべての研究者が利用できるわけではない試薬または技術を使用する。ここでは、技術的に単純で費用効果が高く、それでもグリコーゲン貯蔵の制御に関する貴重な洞察を提供できる一連の手順について説明します。この技術は、330〜800nmの範囲で動作する分光光度計へのアクセスを必要とし、ユーザーが使い捨てのプラスチックキュベットを使用することを想定して説明されています。ただし、手順は容易に拡張でき、マイクロプレートリーダーで使用するために変更できるため、高度な並列分析が可能です。
概要
グリコーゲンは自然界に広く分布しており、化合物は細菌、多くの原生生物、真菌、および動物に含まれています。微生物では、栄養素が制限されている場合、グリコーゲンは細胞の生存に重要であり、哺乳類などの高等生物では、グリコーゲンの合成と分解が血糖値を緩衝するのに役立ちます1,2,3。したがって、グリコーゲン代謝の研究は、微生物学や哺乳類生理学などの多様な分野にとって重要です。グリコーゲン代謝を理解するには、グリコーゲン合成(グリコーゲン合成酵素と分岐酵素)とグリコーゲン分解(グリコーゲンホスホリラーゼと枝切り酵素)の重要な酵素を研究する必要があります。グリコーゲン合成酵素、ホスホリラーゼ、分岐、および枝切り酵素活性のゴールドスタンダードアッセイは、放射性同位元素を使用します。例えば、グリコーゲンシンターゼは一般に、UDP-[14C]グルコース(動物および真菌酵素の場合)またはADP-[14C]グルコース(細菌酵素の場合)からのグルコースのグリコーゲン4,5への取り込みに続いて、停止した放射化学的アッセイで測定される。同様に、グリコーゲンホスホリラーゼは、[14C]グルコース....
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プロトコル
1. グリコーゲン合成酵素活性の測定
- 表1に示すように必要な試薬のストック溶液を調製する(実験日より前)。
| コンポーネント | 経路 | |
| 50 mM トリス pH 8.0 | 0.61 g のトリス塩基を ~ 80 mL の水に溶解します。 4°Cに冷却します。 HClでpHを8.0に調整し、水で容量を100mLまで上げます。 | |
| 20 mM HEPESバッファー | HEPES 0.477 g を ~ 80 mL の水に溶解します。 NaOHでpHを7.0に調整し、水で容量を100mLに補います。 | |
| 132 mM トリス/32 mM KCl バッファー pH 7.8 | 1.94 g のトリス塩基と 0.239 g の KCl を~90 mL の水に溶解します。 HClでpHを7.8に調整し、水で容量.... | |
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結果
グリコーゲン合成酵素活性の測定
図1 は、精製酵素を用いたグリコーゲン合成酵素アッセイの代表的な結果を示す。パネルAでは、わずかな遅れの後、約12分間、時間の経過とともに340nmでの吸収が直線的に減少しました。 図1A の吸収の変化率は~0.12吸光度単位/分であった。吸光度の変化速度は~0.010〜~0.20吸光度単位/分の間で最適であり、グリコーゲン合成酵素の添加量は、この範囲内の収率に調整する必要があります。パネルBでは、アッセイにグリコーゲンシンターゼを添加しすぎた結果が示されています。ここで、反応は最初の2分以内に完了した。これらの場合、グリコーゲンシンターゼを含まない対照反応は、経時的な吸光度の測定可能な減少を示さなかった。ディスカッションで詳述したように、このアッセイでの組織ホモジネートの使用は完全に実行可能ですが、追加の制御反応が必要です。
ここで説明するプロトコルは、カキグリコーゲンを基質として使用してお.......
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ディスカッション
一般に、提示されたすべての方法の主な利点は、低コスト、容易さ、速度、および特殊な機器への依存の欠如です。それらすべてに共通する主な欠点は、他の利用可能な方法と比較した感度です。NADH / NADPHの生産または消費を伴う手順の感度は簡単に推定できます。NADH/NADPHの吸光係数が6.22 M-1 cm-1であることを考えると、単純な算術で10~20 μMの濃度変化を容易に検出できることがわかります。現在の論文に記載されているアッセイ量では、これは~10-20 nmolの範囲の量を測定する能力に相当します。間違いなく、これはかなり敏感です。しかしながら、放射性標識基質の比活性を調整して、感度を分光光度アッセイの限界を超えて非常に容易に増加させることができるようにすることができる。分岐酵素アッセイとグリコーゲン分岐の定性的評価はどちらもヨウ素とα1,4結合グルコースポリマーの間の複合体の形成に依存していますが、各アッセイからの出力は異なり、それらの感度も同様に異なります。記載されるアッセイの各々についての具体的な考慮事項は、以下で論じられる。
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開示事項
この作業に関連する既知の利益相反はなく、その結果に影響を与えた可能性のあるこの作業に対する財政的支援はありませんでした。
謝辞
著者は、Karoline DittmerとAndrew Brittinghamの洞察と多くの有益な議論に感謝したいと思います。この作業は、アイオワオステオパシー教育研究基金(IOER 03-17-05および03-20-04)からの助成金によって部分的に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アミロペクチン(アミロースフリー)ワックス状トウモロコシ | フィッシャーサイエンティフィック | A0456 | |
| アミロース | バイオシンス カルボシンス | YA10257 | |
| ATP、二ナトリウム塩 | ミリポアシグマ | A3377 | |
| D-グルコース-1,6-ビスリン酸、カリウム塩 | ミリポアシグマ | G6893 | |
| D-グルコース-6-リン酸、ナトリウム塩 | ミリポアシグマ | G7879 | |
| グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グレード I、酵母 | ミリポアシグマ | 10127655001 | |
| グリコーゲン、タイプ II カキ | ミリポアSigma | G8751 | |
| ヘキソキナーゼ | ミリポアシグマ | 11426362001 | |
| メタクリレート キュベット、1.5 mL | フィッシャー サイエンティフィック | 14-955-128 | メタクリレートは、一部の手順が340nm以下で実施 |
| &β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩 | ミリポアSigma | N0505 | |
| &β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型二ナトリウム塩 | ミリポアSigma | 43420 | |
| ヌクレオシド5'-二リン酸キナーゼ | MilliporeSigma | N0379 | |
| ホスホエノールピルビン酸、モノカリウム塩 | ミリポアシグマ | P7127 | |
| ウサギの筋肉からのホスホグルコムターゼ | ミリポアシグマ | P3397 | |
| の筋肉からのホスホリラーゼA | ポアシグマ | P1261 | |
| ピルビン酸キナーゼ/ウサギの筋肉からの乳酸デヒドロゲナーゼ酵素 | シグマ | P0294UDP | |
| グルコース、二ナトリウム塩 | ミリポアシグマ | U4625 |
参考文献
- Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
- Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasiti....
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再版と許可
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