マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

サマリー

細胞および分子機能実験の心臓病学のゴールドスタンダードは心筋細胞です。この記事では、マウス心筋細胞を単離するための非ランゲンドルフ法への適応について説明します。

要約

高品質の心筋細胞を生成する再現性がありながら技術的に単純な方法の必要性は、心臓生物学の研究に不可欠です。心筋細胞に関する細胞および分子機能実験(収縮、電気生理学、カルシウムサイクリングなど)は、疾患のメカニズムを確立するためのゴールドスタンダードです。マウスは機能実験に最適な種であり、記載された技術は特にマウス心筋細胞の単離のためのものです。ランゲンドルフ装置を必要とする以前の方法では、大動脈カニュレーションのために高レベルのトレーニングと精度が必要であり、しばしば虚血を引き起こします。この分野は、シンプルで再現性があり、生理学的データの取得と培養のために生存可能な筋細胞を生成するランゲンドルフフリーの分離方法に移行しています。これらの方法は、大動脈カニュレーションと比較して虚血時間を大幅に短縮し、確実に心筋細胞を得る。ランゲンドルフフリー法への適応には、氷冷透明化溶液による初期灌流、灌流中に安定した針を保証する安定化プラットフォームの使用、および機能測定および培養に使用する心筋細胞を確実に取得するための追加の消化ステップが含まれます。この方法は簡単かつ迅速に実行でき、技術的なスキルはほとんど必要ありません。

概要

何十年もの間、心臓生物学の文献に不可欠なアイデアは、分子作用機序です。信頼できる研究を発表するためには、作用機序を確立する必要があります。分子メカニズムを決定するための確立された戦略は、信頼できるデータを得るために高品質の心筋細胞を必要とする単離心筋細胞研究です。作用機序を決定するために心筋細胞に対して行われる細胞および分子実験は、収縮1、電気生理学²、カルシウム(Ca2+)サイクリング³、筋フィラメント^Ca2+感受性⁴、細胞骨格⁵、代謝⁶、ホルモンの影響7、シグナル伝達分子^8、薬物研究⁹等。マウスは、遺伝子操作の容易さ、サイズが小さく、寿命が比較的短く、低コストなどにより、ほとんどの心臓生物学実験に最適な種になっています¹⁰。しかし、高品質のマウス心筋細胞の信頼性の高い単離は、現在の技術では自明ではありません。

ラボは、ほぼ70年間心筋細胞を分離してきました<....

プロトコル

この研究で実施されたすべての手順は、NIHガイドラインに従って、オハイオ州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 溶液調製

注:バッファー濃度については 、表2 を参照してください。

1. 分離前(筋細胞分離の2週間前まで)
   1. 灌流バッファーベース:1 Lの超高純度18.2 MΩ·cm H 2 Oに1Lの灌流バッファーベース(NaCl、KCl、NaH₂PO 4、HEPES、グルコース、およびBDM)を調製し、0.22 μmの滅菌ろ過の前にpH_7.4に調整します。隔離当日まで4°Cで保存してください。
   2. 透明化バッファー:1 Lの超高純度18.2 MΩ·cm H 2 O中に1Lの透明バッファー(NaCl、KCl、NaH₂PO 4、HEPES、グルコース、EDTA、およびBDM)を調製し、0.22 μmの滅菌ろ過の前にpH_7.4に調整します。隔離当日まで4°Cで保存してください。
   3. 100 mM CaCl 2ストック溶液:1.11 gのCaCl 2を秤量し、100 mLの超高純度18.2 MΩ・cm H_2....

結果

分離の成功を判断する際に調べる要素がいくつかあります。まず、心筋細胞は、 図1で単離された細胞のように、膜のブレブのない棒状でなければなりません。典型的な単離では、筋細胞の~80%が棒状になります。単離によって50%未満の棒状細胞が得られる場合、それは失敗した単離と見なされ、心筋細胞は使用されません。最後に、心筋細胞は静止している必要があります。自発的に収縮する筋細胞はCa2+不耐性を示し、信頼性の低いデータを生成します。上記の手法を使用して実行されたすべての分離のうち、ほぼすべての分離が成功したと見なされます。培養心筋細胞は、膜のブレブのない棒状または高い生存率で丸みを帯びたエッジである場合に成功と見なされます(図2)。

表 1.私たちの方法、ランゲンドルフ法、および以前に発表されたランゲンドルフフリーのマウス心筋細胞単離法との顕著な違いの表。

ディスカッション

当社のランゲンドルフフリー心筋細胞分離技術の主な利点は、ランゲンドルフ装置へのカニューレ挿入を必要としないため、低酸素症と虚血時間を制限することです。心臓の除去、洗浄、吊り下げに数分かかり、筋細胞に虚血性損傷をもたらすことが多い古典的なランゲンドルフ技術の代わりに、私たちの方法には、氷冷透明化溶液を介したin vivo血液透明化が含まれます。氷冷透明化バッファーはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含み、二価カチオンを不可逆的にキレート化してカルシウムを効率的に除去し、優れた抗凝固剤にし、したがって収縮を停止します²³。氷冷溶液の使用は、イオン交換および細胞代謝速度を遅くすることによって収縮を阻害し、虚血によって引き起こされる損傷を防止する²⁴。大動脈カニュレーションの必要性を排除することにより、ランゲンドルフフリー技術は堅牢な筋細胞を生成し、信頼性の高いデータを生成するためのより信頼性の高い調製をもたらしますが、ランゲンドルフの分離法では必ずしもそうではありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cc Bd Luer-Lokシリンジ	Fisher	Sci 14-827-52
10 mL パイレックス ローフォーム ビーカー	コール パーマー	UX-34502-01
100 mL ポリプロピレン キャップ ガラス メディア ストレージ ボトル	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL 丸底ポリプロピレン試験管 キャップ付き	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-ブタンジオン モノキシム	シグマ	B0753	>98%
3 cc BD ルアーロック シリンジ	フィッシャー Sci	14-823-435
35 mm ガラス底皿	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
針なし 50 mL BD シリンジ 針なし	フィッシャー Sci	13-689-8
50 mL 円錐形遠心分離管	コール・パーマー	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMSスペースゲル加熱パッド	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2 "皮下注射針	ベクトン・ディキンソン	305109
ウシ血清アルブミン	シグマ	A3803	ヒートショック画分、凍結乾燥粉末、基本的に脂肪酸フリー、>98%
塩化カルシウム二水和物	シグマ	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	細胞培養に適した >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&Dシステムズ(バイオテクノロジー)	S11195
ッシャーブランドIsotemp加熱浸漬サーキュレーター	フィッシャーSci	13-874-432
マン蚊止血鉗子	ワールド精密機器	15921
ハウサーサイエンティフィックHy-Liteカウンティングチャンバーセット	フィッシャーSci	02-671-11
HEPES	シグマ	H4034	>99.5%
ラベリングテープ	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 シリンジポンプ	kdScientific	788100
L-グルタチオン	Fisher Sci ICN19467980
Liberase TH 研究グレード	シグマ	5401135001	高熱分解濃度
M199	Fisher Sci	MT10060CV
塩化	マグネシウムInvitrogen	AM9530G
マウス ラミニン	コーニング	354232
ペン/連鎖球菌	Fisher Sci
塩化カリウム		Σ P5405	>99%
精密デジタル レシプロ ウォーター バス	サーモフィッシャー サイエンティフィ	TSCIR19
重炭酸ナトリウム	Σ	S5761	細胞に適しています培養
塩化ナトリウム	シグマ	S5886	>99%
リン酸ナトリウム一塩基性	シグマ	S5011	>99%
滅菌セルストレーナー70µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR 吸収性アンダーパッド	Fisher Sci NC9481815

フィハートック