方法論記事

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

DOI：

10.3791/63057

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2021年9月23日

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1Department of Biochemistry and Structural Biology and Greehey Children’s Cancer Research Institute, The University of Texas Health Science Center at San Antonio

この記事について

サマリー

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天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。

要約

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天然変性タンパク質およびタンパク質内の天然変性領域は、ヒトプロテオームの大きく機能的に重要な部分を構成しています。これらの配列の柔軟性が高いため、多様な生体分子パートナーと弱く、長距離で、一過性の相互作用を形成することができます。特異的でありながら親和性の低い相互作用は、無差別結合を促進し、単一の天然変性セグメントが多数の標的部位と相互作用することを可能にします。これらの相互作用は一過性であるため、タンパク質に依存して単一の優勢な立体配座を形成する構造生物学的手法では、それらを特徴付けるのが難しい場合があります。常磁性緩和増強NMRは、弱い相互作用や過渡的相互作用の構造的基盤を同定し、定義するための有用なツールです。常磁性緩和増強を使用して、天然変性タンパク質とそのタンパク質、核酸、または他の生体分子パートナーとの間に形成される低人口エンカウンター複合体を特徴付けるための詳細なプロトコルが記載されている。

概要

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内因性障害(ID)は、安定した二次構造または三次構造に自発的に折りたたまれないが生物学的に活性であるタンパク質(IDP)またはタンパク質内の領域(IDR)を表します。一般に、IDP/IDRの機能は、生理学的条件1で生体分子との特異的でありながら可逆的な相互作用を促進することです。したがって、IDPおよびIDRは、多タンパク質複合体の動員、組織化、および安定化、例えば、スプライソソーム2の組み立ておよび活性、DNA損傷部位における成分の動員および組織化3、転写複合体4、またはクロマチンリモデリングBAF5の組織化および安定化を含む、様々な細胞機能に関与している.さらに、IDPはシグナル伝達ネクサスに見られ、異なる結合パートナーとの乱交により、細胞タンパク質ネットワークを介した情報伝達を媒介することができます6。最近の研究では、IDR領域が液-液相分離のプロセスを通じて生体分子凝縮物を自己会合形成する傾向も明らかになりました7。IDを含む前述の機能の多くは、現在、凝縮物形成8のいくつかの側面を含むと考えられています。生体分子複合体の組み立て、安定化、足場、およびシグナル伝達にとってIDは重要であるにもかかわらず、IDPおよびIDRは通常、X線結晶構造解析または極低温電子顕微鏡を使用した構造調査に適していないため、それらの特異的相互作用の原子の詳細を特定することは困難です。

核磁気共鳴(NMR)は、剛直または均質な構造アンサンブルの存在に依存せず、個々の原子核の直接の局所環境を報告するため、IDを調べるための理想的な手法です。所与の分子内の原子核の共鳴周波数または化学シフトは、局所的な電子分布によって誘発される弱い磁場の影響を受け、結合長、角度、他の原子核の近さ、結合パートナーとの相互作用、およびその他の要因に依存します9。したがって、各核は、その局所的な化学環境の変化に敏感な独自の部位特異的構造プローブとして機能します。これらの利点にもかかわらず、NMRはバルク技術であり、観測された化学シフトは特定の核によってサンプリングされたすべての環境の平均です。この号で取り上げるNMR技術の多くは、平均化された化学シフトに含まれる高エネルギーで人口の少ない生体分子立体構造に関する構造的、動的、および速度論的情報を回復するために開発されました10,11。一過性に人口が存在しますが、これらの状態の同定と定量化は、機能メカニズムの詳細を決定するために重要です12。例えば、IDPおよびIDRの場合、立体配座アンサンブルは、生理学的結合パートナーとの遭遇複合体の形成に生産的である立体配座を優先的にサンプリングするように偏っている可能性がある。これらの状態の検出、ならびに残基特異的な分子間および分子内相互作用およびダイナミクスの同定は、タンパク質機能と複合体形成の根底にある構造メカニズムを決定するために重要です。

常磁性緩和増強(PRE)NMRを使用して、IDP/IDRを介した生体分子複合体の形成に重要な過渡的で人口の少ない状態を調べるためのプロトコルについて説明します13。このアプローチは、α-シヌクレイン14,15からのアミロイド線維の集合やFUS 16の自己会合を促進するような一過性のタンパク質間相互作用の研究や、シグナル伝達タンパク質間などの特定のタンパク質間相互作用を特徴付けるのに役立ちます17。自己会合性IDPの例が提示され、特定の分子間および分子内相互作用が優先的に圧縮された状態をもたらし、自己会合を促進する部位特異的相互作用をもたらします。

PREは、原子核から常磁性中心への磁気双極子相互作用から等方性gテンソルで生じ、一般にニトロキシド基上の不対電子の形で、または常磁性金属原子として供給されます18(図1)。異方性のgテンソルを持つ原子もPRE効果を生じますが、これらの系の解析は、擬似接触シフト(PCS)または残留双極子結合(RDC)によって引き起こされる交絡効果のためにより困難です13,19。原子核と常磁性中心との間の相互作用の強さは、両者の間の<r-6>距離に依存する。この相互作用は核緩和率の増加をもたらし、不対電子の磁気モーメントが非常に強いため、長距離相互作用(~10-35 Å)でも検出可能な線の広がりを引き起こします20,21。PREによる過渡状態の検出は、次の2つの条件が満たされている場合に可能です。(1)過渡的相互作用はNMRタイムスケールで高速交換中である(観察された化学シフトは交換状態の集団加重平均である)。(2)原子核から常磁性中心までの距離は、過渡的な人口状態の方が主状態11よりも短い。横PREはΓ2と表され、実用的な目的のために、常磁性中心を含むサンプルと反磁性コントロールとの間の1H横緩和率の差から計算されます。PREの理論と、高速交換レジームと低速交換レジームにおける関連する疑似接触シフトの詳細な扱いについては、読者はCloreと同僚による包括的なレビューを参照します13,22。ここでは、1H N-Γ2が高速交換レジームにある状況のみが考慮され、PREのr-6依存性のために、観測された緩和率は、常磁性中心が核に近づく距離とそのコンフォメーションに費やす時間の両方に関連しています。したがって、近接アプローチを伴わない過渡配座は小さなPREを生成し、より近い相互作用は、たとえ短命であっても、より大きなPREを生成します。

IDPの場合、PREは、単一分子内(分子内)および別々の分子間(分子間)で発生する相互作用を測定および区別するために使用されます。NMR可視(例えば、15N標識)またはNMR不可視(例えば、天然存在比14N)タンパク質に常磁性中心を結合させることにより、PREの供給源(分子間または分子内)を決定することができます(図2)。システイン残基を導入する部位特異的突然変異誘発は、常磁性中心(スピン標識)をタンパク質23に結合させるための便利なアプローチである。スピン標識として使用するために、金属キレート化(EDTAベース)およびフリーラジカル(ニトロキシドベース)を含むいくつかのタイプの分子が提案されています24。さまざまなニトロキシドスピン標識が記載されており、メタンチオスルホン酸塩、マレイミド、ヨードアセトアミドなどのさまざまなシステイン反応性化学物質で利用できます25,26(図1)。タグまたはリンカーの固有の柔軟性は、特定の分析にとって問題となる可能性があり、このような状況では、かさばる化学基を追加したり、タグをタンパク質に固定するための第2のリンカーの使用(2部位の結合)など、タグの動きを制限するためのさまざまな戦略が提案されています27。28。さらに、市販のタグはジアステレオマータンパク質を含み得るが、一般にこれは観察されたPRE29に寄与しないであろう。マレイミド化学を介して遊離システインに結合した3-マレイミド-PROXYLの使用は、容易に入手可能で、費用効果が高く、非可逆的であり、還元剤トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)が標識反応全体を通して溶液中に維持できるため、説明されています。3-Maleimido-PROXYLは等方性のgテンソルを有するため、PCSまたはRDCは誘導されず、常磁性および反磁性サンプルの両方に同じ化学シフト割り当てを使用することができる13。

1HN−T 2は、8〜12の時点30からなる完全な進化系列を収集するのと同じくらい正確であることが以前に示されている2つの時点戦略(Ta、Tb)を使用して測定される。第1の時点(Ta)は、実用可能な限りゼロに近く設定され、第2の時点の最適な長さは、所与の試料について予想される最大PREの大きさに依存し、Tb ~ 1.15/(R2,dia + Γ2)から推定することができ、ここでR2,diaは反磁性試料13のR2を表す。最大のPREの大きさが不明な場合は、Tbをタンパク質の1H T2の~1倍に設定することが適切な初期推定値であり、T2を調整してS/N比を改善することによってさらに最適化されます。この2点測定戦略は、PRESの測定に必要な実験時間を大幅に短縮し、特に分子間の非特異的接触の影響を最小限に抑えるために比較的希薄なサンプルが使用されるため、より多くのシグナル平均化のための時間を可能にします。HSQCベースのパルスシーケンスは、1HN−T2を測定するために使用され、他の場所で詳細に説明されている30。感度を向上させるために、順方向および後方のINEPT転送のハードパルスを成形パルスに置き換えることができます。あるいは、配列は、TROSYベースの読み出し31に容易に変換される。IDPは通常、横方向の緩和速度がはるかに長いため、同様のサイズの球状タンパク質よりも(固有の障害のために)線幅が狭くなるため、間接次元での長い取得時間を使用して、スペクトル分解能を向上させ、IDPに固有の化学シフト分散の制限を緩和できます。

PREは、タンパク質間およびタンパク質間相互作用、特に一過性または人口の少ない相互作用を研究するための有用なツールです。タンパク質精製、部位特異的スピン標識、パルスプログラムの設定とキャリブレーション、NMRデータの処理と解釈の手順など、PREの測定に適したNMRサンプルを調製するための詳細なプロトコルが提供されています。サンプル濃度、スピン標識の選択、常磁性成分の除去など、データ品質と実験結果に影響を与える可能性のある重要な実験上の考慮事項が全体を通して注目されています。

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プロトコル

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プロトコルの一般的な要件:タンパク質精製施設、UV-Vis分光計、高磁場NMR分光計および操作ソフトウェア、以下を含む後処理分析ソフトウェア。NMRPipe32, Sparky33, (または CCPN Analysis 34, or NMRViewJ35).

1. PRE測定のためのタンパク質の組換え発現と精製

  1. 単一のシステイン残基が存在するように目的のタンパク質の発現コンストラクトを設計します。目的のタンパク質の異なる位置に遊離のシステインを導入するには、複数の変異が必要になります36。
  2. 確立されたプロトコル37を用いて、目的のタンパク質の天然存在量(14N)または15N標識サンプルを発現および精製する。
    注: 大腸菌 発現システムは、 15Nの同位体濃縮が生体分子異核NMR分光法の最小要件であるため、組換えタンパク質発現のための費用効果が高く堅牢な方法を提供します。典型的なステップは、最小培地での発現、クロマトグラフィー精製、およびアフィニティー精製タグの除去です。このプロトコルは、NMR研究に適した品質の十分なタンパク質を産生できる堅牢な発現および精製プロトコルが確立されていることを前提としています。
    1. すべての精製ステップでバッファー中に1 mMの還元剤(DTTまたはTCEP)を維持し、遊離システインの反応とIDPの分子間ジスルフィド結合の形成を防ぎます。
      注:一部のシステムは、タンパク質の特定の特性、および精製用に選択された温度、pH、およびバッファーシステムに応じて、より耐性が高く、凝集が少なく、非還元条件になりやすい場合があります38。
    2. 精製に使用したアフィニティータグは、予測できない方法でタンパク質と非特異的に相互作用したり、意図しない付着部位として不注意に機能する可能性のある反応性システイン残基を含む可能性があるため、先に進む前に削除してください。
    3. システイン変異のない 15N標識参照サンプルを可溶性バージョンのスピン標識と混合して調製し、溶媒PREの寄与を評価します。

2. 3-マレイミド-PROXYLニトロキシドスピン標識の結合

  1. 精製したタンパク質を、50 mM Tris pH 7および1 mM TCEPを含む脱気バッファーに保存または交換します。バッファーには、タンパク質の溶解性を高めるために必要に応じて最大 8 M の尿素を含めることもできます。
    あるいは、タンパク質ストック溶液を、少なくとも10容量当量の脱気した50 mM Tris pH 7および1 mM TCEPバッファーに急速に希釈します。スピン標識を添加する前に、タンパク質濃度が少なくとも100 μMであることを確認してください。
  2. ストック溶液から3-マレイミドプロキシルを、目的のタンパク質の20倍モル過剰に加えます。サンプルを光と酸素から保護し、室温または4°Cで一晩インキュベートします。穏やかな揺れやナットは、ラベリング効率を向上させる可能性があります。
  3. 3-マレイミドプロキシル粉末を95%エタノールに溶解してスピンラベルのストック溶液を調製します。ストックのアリコートは、-80°Cで6ヶ月未満保存できます。
  4. 重要なステップ:非特異的溶媒PREを防ぐために、非反応の遊離スピン標識を除去します。 これは、ゲルろ過または(できれば)タンパク質サンプルの広範な透析によって達成されます。また、このステップでは、NMRに適したバッファーにタンパク質を導入します。
    注:還元剤は新鮮に調製し、緩衝液成分間の適合性を考慮する必要があります。例えば、TCEPはリン酸ベースの緩衝液中で急速に分解するため、この組み合わせは避けるべきである39。
  5. このステップから使用するすべてのバッファーを、常磁性イオンまたはスピン標識クエンチャーを除去するために、二価および遷移金属に選択的なキレート樹脂で処理します。NMRバッファーに保存できない場合は、急速希釈するタンパク質をNMRに適したバッファーに濃縮してください。
  6. スピンラベルの取り込み効率のモニタリング。
    1. 溶液40中の遊離スルフヒドリル基の定量には、エルマン試薬(5,5-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)を使用します。
      メモ: 詳細なプロトコルは製造元から入手できます。ここでの目的のために、スピン標識の取り込みを決定することが重要であり、遊離スルフヒドリル基の濃度が総タンパク質濃度と比較される。遊離スルフヒドリル基の割合は、ニトロキシドスピン標識が結合していない分子の割合です。
    2. タグ付きシステイン残基に対応するピークの強度をモニターして、目的のタンパク質へのスピンラベルの取り込みを判断します。
      注:これは、タンパク質のスピン標識の程度を決定するための迅速かつ効果的なアプローチです。スピンラベルを完全に組み込むと、スペクトルからピークが消えます。IDPsの分散特性が低いため、変異型システイン残基に対応するピークが常に容易に同定されるとは限らないため、Ellman試薬(ステップ2.6.1)の使用が推奨されます。

3. 分子内または分子間のPRE測定用NMRサンプルの調製

  1. 分子内PRE測定用サンプルの調製
    1. NMRに適したバッファー中で、 15N同位体濃縮スピン標識タンパク質を100 μM以上300 μM以下の濃度に調製します。総サンプル量(D2Oを含む)は500〜550 μLです。
      注:一般的なNMRバッファーには、リン酸塩、酢酸塩、(重)炭酸塩、およびTRISがあります。MES、HEPESなどのグッド緩衝液も適切であり得る。バッファーを選択する際は、他の溶液成分との交差反応性がないよう注意してください。
    2. 水とのアミドプロトン交換の影響を最小限に抑えるために、pHが~7.2以下であることを確認してください。塩の濃度をできるだけ低く(通常は150 mM未満)保ちますが、主な考慮事項はタンパク質の安定性を維持することです。
      注:高塩条件下でNMR実験を行うためのアプローチは、他の場所で説明されています41。
  2. 分子間PRE測定用サンプルの調製
    1. この手順または手順3.1に従います。これらは同時には実行されません。選択したNMRバッファーで 14N天然存在量のスピン標識タンパク質を調製します。
    2. 15N同位体濃縮非スピン標識タンパク質を1%-50%14N天然存在量のスピン標識タンパク質と混合して、最終濃度が3.1.1で調製したサンプルと同じになるようにタンパク質サンプルを調製します。総サンプル量(D2Oを含む)は500〜550 μLです。
    3. 研究した各タンパク質の 15Nタンパク質と 14Nタンパク質の比率を経験的に最適化します。 14個のN-スピン標識タンパク質の1%、5%、および20%の比率は、良い出発点です。
      注:添加された 14N-スピン標識タンパク質の関数としてのPREの蓄積は、特定の効果を示します。観察されたPREは、距離と集団(前述のように)に依存するためサンプル特異的であり、したがって、相互作用が特に一過性である場合、 14N-スピン標識タンパク質のより高い比率が必要になります17。
  3. NMR(分子内または分子間)サンプルを、ロングステム(9インチ)ガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、高磁場磁石での使用に適した5 mm NMRチューブに移します。フィールドロックを容易にするために、すべてのNMRサンプルに5%〜10%のD2Oが含まれていることを確認してください。
    注:ポリマープラグを使用して必要なサンプル量を減らすNMRチューブは、効果的なサンプルシムに関連する困難のため、PRE測定には推奨されません。

4. NMR分光計と実験固有のパラメータを設定する

  1. 超伝導高磁場NMR分光計を扱うときは細心の注意を払ってください。
    注意: 危険には、磁石に向かって金属物体が突然加速することによる怪我、埋め込まれた医療機器との干渉、および磁石クエンチが発生した場合のN 2およびHe2ガスの突然の放出による窒息が含まれます。次の手順は、リーダーが必要なトレーニングを受け、これらおよびその他の地域の危険を認識し、NMR分光計を操作するための施設管理者から承認を受けていることを前提としています。手順や指示に疑問がある場合は、施設管理者または経験豊富なユーザーに相談して、人身傷害や分光器の損傷の可能性を防ぎます。
  2. 以下の手順は、市販のNMR分光計が最新バージョンのデータ収集制御ソフトウェアを実行していることを前提としています。パルスプログラムとパラメータファイルをダウンロードし、適切なディレクトリに配置します。
    注:ブルカー分光計およびTopSpin(3.2以降)での使用に適したパルスプログラムとパラメータセットは、著者からのリクエストに応じて入手できます。
    1. 重要なステップ:非ネイティブNMRパルスプログラムのインストールに精通していることを前提としています。必要に応じて、施設管理者または経験豊富なユーザーに相談してください。
  3. サンプルを磁石に入れ、Lockコマンドを使用して2H信号をロックし、施設プロトコルに従って1Hチャンネルを調整および一致させます(正確な手順は、プローブにリモートチューンアンドマッチモジュールが装備されているかどうかによって異なります)。
  4. topshim サブルーチンを使用してシムを調整し、溶媒シグナル抑制を最適化します。
  5. 標準的な方法を使用して 、1Hおよび 15N 90°パルスを校正します。
    1. poptプログラムを使用して1Hパルスを校正します(最初にパルス長を推定するにはパルスカルを使用します)。
    2. 標準サンプルに対して 15Nパルスを校正します。テクニカルディレクターまたは経験豊富なユーザーと話し合って、この値が最近調整されたことを確認してください。
    3. あるいは、HMQC実験の90°パルスの1つをヌル信号が得られるまで変化させて、サンプル上の 15Nパルスを校正します。
    4. 整形パルスの正しい減衰は、整形ツール (stdisp) サブルーチンを使用して決定します。
    5. フォルダアイコンをクリックして、適切なパルス形状ファイルを開きます。成形パルスは、 ACQUPARSのパルスパラメータセクションにあります。
    6. パルス定義ファイルをロードし、 波形解析>形状積分をクリックします。校正済みの 1H 90°ハードパルス、希望の形状のパルス長、および回転(90°または180°)を入力します。
    7. 校正された90°パルスの減衰に電力レベルの変化を加えて、成形パルスの電力レベルを計算します。
  6. 標準の 1H、 15N HSQC(hsqcetfpf3gpsi)を記録して、掃引幅、キャリア周波数を最適化し、水抑制25を確認します。
  7. スイープ幅と間接寸法増分数は、 sw コマンドと td コマンドを使用して調整するか、適切なダイアログ ボックスで直接調整します。通常、PREを収集するには、スペクトルが折りたたまれないようにスペクトル幅が選択されます。

5. 1HN-T 2 実験を設定する

  1. 上記のように成形パルスを較正します(4.4.5-4.5.7)。PRE実験用の成形パルスパラメータファイルは、Eburp2.1000(90°パルス)、Reburp.1000、およびIburp2.1000です。 ACQUPARS タブのパルスパラメータセクションに校正済みのパルス長を入力します。
  2. この実験は、2つの時間遅延点アプローチ30を用いて1時間N−T2を測定する。
    1. vdlistファイルを編集して時間遅延を設定すると、最初の遅延(Ta)は0.01ミリ秒に設定されます。
    2. 第2の遅延(Tb)は、予想される最大PRE(Tb~1.15/(R2,dia+Γ 2)との関係を用いて、R2,diaは反磁性試料13のR2を表す。観測された緩和に対するPREの寄与の大きさについての事前の知識がなければ、T bを~1x 1H T2に設定することをお勧めします。
    3. 次に、TaスペクトルとTbスペクトルの最初の増分(efpコマンドで処理)を比較し、信号が初期値の40%〜50%に減衰するようにTbを調整することにより、適切な値を決定します。
      注:このアプローチはスペクトル信号対雑音比を最適化し、高濃度(< 50 μM)できないサンプルに必要な考慮事項です。Tbの適切な値はサンプルに依存しますが、通常、平均サイズのタンパク質では8〜40ミリ秒の範囲です。
  3. 十分な信号平均化のために、記録する複素点の数とスキャンの数を決定します。IDPは、同程度の大きさの折り畳まれたタンパク質よりも長い15N T2を有するので、間接次元におけるより長い取得時間が使用され得る。
    注:この値はタンパク質の特異的特性に依存するが、 15N T2 から大まかに推定し、FIDにおけるシグナル減衰をモニタリングすることによって最適化することができる。直接寸法の場合、ほとんどのサンプルで1024*複素点(掃引幅13ppm、アクイジション時間112.6ms)で十分です。
  4. expt コマンドを使用して実験時間を計算し、コマンド zg で実験を開始します。

6. アスコルビン酸でスピンラベルを還元して反磁性サンプルを作成

  1. アスコルビン酸ナトリウムをNMRバッファーに溶解し、元のNMRバッファーと一致するようにpHを調整します。
  2. アスコルビン酸ナトリウムストックの濃度を計算して、スピンラベルの濃度の10倍モル過剰のアスコルビン酸塩をサンプル量の変化を最小限に抑えて添加できるようにします。例えば、100 μMのタンパク質サンプルの場合、100 mMのアスコルビン酸塩ストックが適切です。スピンラベルを減らすには、5.5 μLのアスコルビン酸ストック溶液を追加する必要がありますが、これは総サンプル量のわずか1%です。
  3. チューブの縁の下に液滴を置いて必要量のアスコルビン酸をNMRチューブに加え、チューブに蓋をし、チューブを注意深く反転させて混合した後、手回し遠心分離機で200〜400 x g で10〜20秒間回転させて、サンプルをチューブの底に沈降させます。
  4. NMRチューブをホイルで包み、光から保護し、反応を少なくとも3時間進行させます。
  5. 常磁性サンプルに使用したのと同じパラメータを使用して、反磁性サンプルに1HN-T 2を記録します。
  6. パルスを再校正します。しかし、それらは常磁性測定から変わるべきではありませんでした。それらが有意に異なる場合(0.5μs>差)、サンプルの品質(劣化、沈殿など)を考慮してください。
  7. 指定された緩和遅延(vdlist)、ダミースキャンの数、収集されたスキャンの数、収集された複素点の数、取得時間、掃引幅、およびキャリア周波数を含むすべての取得パラメータが、反磁性サンプルと常磁性サンプルで同じであることを確認してください。

7.常磁性スペクトルと反磁性スペクトルを処理します

  1. NMRPipe と Sparky がインストールされ、構成されているローカル コンピューターまたはワークステーションにデータをコピーします。ser ファイルを含む実験データ ディレクトリに proc という名前のフォルダーを作成します。
  2. NMRPipe スクリプト fid.com、 p3d.com、および nmrproc.com を proc にコピーします (処理スクリプトは、著者からの要求に応じて入手できます)。
    1. fid.com スクリプトを使用して、ブルカーのデータ形式(ser)をNMRPipe形式に変換します。
    2. p3D.com スクリプトを使用して、擬似 3D 平面を個々のスペクトルに分割します。
    3. nmrproc.com スクリプトを使用して、fid.com スクリプトの出力の読み取り、溶媒抑制の適用、ウィンドウ関数の適用、生データへのゼロの追加(ゼロフィル)、位相補正の適用、フーリエ変換の実行、表示用のデータのトリミング、処理済みデータのディスクへの書き込みを行います。スクリプトは、記録された緩和遅延(T a および Tb)ごとに 1 つのファイルを出力します。
      注: これらの各スクリプトは、各実験の特定の詳細に合わせて処理を最適化するようにカスタマイズできます。チュートリアルおよびサンプルデータセットは、NMRPipeウェブサイト32から入手可能なNMRPipeディストリビューションに含まれている。NMRDrawは、処理中のスペクトル表示(適切な位相角の設定など)に使用できます。NMRPipe コマンドで使用できるオプションは、 コマンド nmrPipe -help を使用して表示できます。

8.共振割り当てを転送し、ピーク高さを抽出します

  1. コマンド sethdr [ファイル名] -ndim 2 を使用して、各スペクトル ファイルのファイル ヘッダー情報 (常磁性サンプルと反磁性サンプルの両方の Ta、Tb) を変更します。
  2. Sparkyを使用して、手順8.3〜8.5に従ってピーク高さ33を抽出します。NMRPipe(NMRDraw)32、CCPN分析34、NMRViewJ35などの他のソフトウェアパッケージも適切です。
  3. スペクトル ファイルを Sparky に読み込みます。このステップでは、データセットは、タンパク質内のスピンラベルの各位置について測定された常磁性サンプルと反磁性サンプルの両方について、各時点スペクトル(Ta、T b)の1つのスペクトルで構成されます。
  4. Sparkyを使用してピークを選択し(コマンド:F8、次にクリックしてドラッグ)、参照ピークリストからピークリストの転送ツールを使用して割り当てを転送します。
    注:目的のタンパク質の共鳴割り当ては、観察されたPRESの配列特異的な解釈に必要です36。
    1. 常磁性スペクトルと反磁性スペクトルの両方の輪郭を同じレベルに設定します。時間遅延後に収集されたスペクトルが意図的にピークを除外しないように、 Ta スペクトルが過度にノイズにならないように十分に高くなるように、コンターを設定してください。
  5. 各スペクトルの新しいピークリストを保存し、測定されたピーク強度とSparkyで計算された信号対雑音比を含めます(コマンド:ピークリストを開くにはlt、強度とSNR列を含めるにはオプションをクリックし、コマンド:保存)。

9.各残留物の1HN-T 2レートを抽出し、PREを計算します

  1. ピークリストをスプレッドシートソフトウェアまたはPythonなどの優先プログラミング言語にインポートします。
    注:タンパク質上の各スピンラベル位置について、データセットは、常磁性実験と反磁性実験の両方でT aとTbのそれぞれ1つずつ、関連するピーク強度を持つ4つのピークリストで構成されます。
  2. 次の式を使用して、常磁性サンプルと反磁性サンプルの両方について 1HN R2 を計算します。
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
  3. 上記の式を使用して、常磁性サンプルと反磁性サンプルの各残基の緩和率を決定します。
  4. 次の式を使用して、各残基の1HN-Γ 2 レートを決定します。
    figure-protocol-3
  5. Sparkyで計算された信号対雑音比(SNR)を使用して、各残渣のピーク高さの不確実性を計算します。
  6. 次の式を使用してエラーを伝播します。
    figure-protocol-4
  7. プロット1は、残基数の関数として、N-Γ2、9.6で計算された誤差を含む散布図を用いた。

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結果

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RNA結合タンパク質EWSR142の低複雑性ドメインに由来する自己会合性天然変性フラグメント(残基171-264)に分子内1H N-Γ2 PREを記録しました(図3)。スピン標識付着点に連続して近接する残基(例えば、図3の残基178または260)は、有意に広がることが予想され、スペクトルでは検出できません。付着点から連続して間隔を空けているが、増強Γを示す残基2は、スピン標識に空間的に近い(10〜35 Å)。EWSR1 171-264の場合、PRE効果の原因は、残基間接触と残基内接触の組み合わせから生じる可能性があり、原子核から常磁性中心までの距離、その立体配座の集団、および電子スピンと核スピンを接続するベクトルのダイナミクスに依存するため、複雑です。さらに、分子内接触から生じるPREの大きさは濃度に依存しませんが、分子間接触から生じるPREは濃度だ...

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ディスカッション

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PREを用いて、天然変性タンパク質と様々な結合パートナーとの間の低集団に存在する一過性相互作用を特徴付ける方法が提示されている。示されている例では、タンパク質は自己会合性であるため、PREは分子間相互作用と分子内相互作用の組み合わせから生じる可能性があります。この方法は、2つの異なるタンパク質間の相互作用を特徴付けることができる不均一なサンプルに容易に拡張できます。タンパク質の異なる領域がどのように相互作用するかについての相補的な情報は、タンパク質内の異なる位置にスピン標識を配置することによって得られる。さらに、NMR活性(15N)種とNMR不活性(14N)種の間でスピン標識を交互に行うことで、観察されたPREの分子内および分子間の供給源を互いに区別し、遭遇した複合体に関する情報を提供することができます。ここで概説した実験は、マイクロ秒のタイムスケールで発生した場合でも、複雑な相互作用に遭遇したことを報告できます13。

この方法の中心となるのは、システイン残基への結合による目的のタンパク質へ...

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開示事項

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すべての著者が原稿を読み、承認しました。利益相反は宣言されていません。

謝辞

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ジンファ・イン博士とクリスティン・カノ博士の有益な議論と技術支援に感謝します。DSLは聖バルドリック奨学生であり、聖バルドリック財団(634706)の支援を認めています。この研究の一部は、ウェルチ財団(AQ-2001-20190330)からDSL、Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund(Voelcker Foundation Young Investigator Grant to DSL)、UTHSA Startup Up FundsからDSL、Greehey Graduate Fellowship in Children's HealthからCNJに支援されました。この研究は、テキサス大学サンアントニオ校健康科学センターの機関研究コアの一部である構造生物学コア施設で実施された研究に基づいており、研究担当副学長室およびメイズがんセンターの創薬および構造生物学共有リソース(NIH P30 CA054174)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 以上mおよび0.22 µmシリンジフィルターミリポアシグマSLHVM33RS
SLGVR33RS		最初の精製ステップの前とサイズ排除クロマトグラフィーの前に溶解液をろ過します。
100 mmシャーフィッシャーFB0875713細菌形質転換用の寒天プレート。
14N 塩化アンモニウムSigma Aldrich576794M9培地で15Nを使用すると、NMR可視タンパク質が生成されます14NはNMR不可視タンパク質を生成します
15N塩化アンモニウムSigma Aldrich299251M9培地で15Nを使用すると、NMR可視タンパク質が生成されます 14NはNMR目に見えないタンパク質を生成します
3 L Fernbach バッフルフラスココーニング431523細菌発現培養
3-Maleimido-ProxylSigma Aldrich253375Nitroxideスピンラベル
50 mL 円錐形遠心チューブサーモフィッシャー14-432-22溶液/タンパク質貯蔵
アミコン遠心フィルターミリポア シグマUFC900308タンパク質濃度
アンピシランシグマ アルドリッチA5354選択的マーカーのための抗生物質、正確な選択は発現コンストラクト プラスミド
分析バランスオアフス30061978エクスプローラー プロ、試薬の計量用
アスコルビン酸シグマ アルドリッチAX1775ニトロキシドスピンラベルの削減
オートクレーブガラス器具と培養培地の滅菌
塩化カルシウムシグマ・アルドリッチC4901M9培地成分
遠心分離ボトルサーモフィッシャー010-1459組換えタンパク質発現後の大腸菌細胞の採取
遠心分離機、手回しクランクトーマス・サイエンティフィック0241C68Boekelの手動駆動低速遠心分離機、NMRチューブを収容できる15mLバケット付き
Chelex 100Sigma AldrichC7901緩衝液から汚染常磁性化合物を除去
コンピュータワークステーションLinuxまたはMac OSと互換性があり、NMRPipeやSparky酸化重水素などのNMRデータ処理および分析ソフトウェアパッケージ
Sigma Aldrich151882NMRロックシグナルに必要
デキストロースSigma AldrichD9434M9 培地成分
二塩基性リン酸ナトリウムΣ AldrichS5136M9 培地成分
エルマン試薬 (5,5-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)サーモフィッシャー22582遊離シスチエン残基の定量
高速遠心チューブサーモフィッシャー3114-0050細菌溶解物を除去するために使用されます。
ハイフィールドNMR装置(600 - 800 MHz)ブルカーマルチチャンネル極低温プローブと温度制御
IMACカラムを装備、HisTrap FFCytvia17528601粗細菌溶解物
イソプロピルB-D-チオガラクトシド(IPTG)Sigma AldrichI6758制御下で遺伝子のタンパク質発現を誘導
フィッシャー22700025アイテムは、目的のタンパク質を発現するために大腸菌を変換するために使用され、これらのアイテムのいずれかと同様の製品との代替物は許容されます。
LBブロスサーモフィッシャー12780052
低圧クロマトグラフィーシステムBio-Rad7318300BioRad BioLogicは、IMACカラムなどの低圧チョコレートグラフに使用されます
硫酸マグネシウムSigma AldrichM7506M9 培地コンポーネント
中圧クロマトグラフィーシステムBio-Rad7880007BioRad NGC は、多波長検出器、pHおよび導電率モニター、自動フラクションコレクター
MEMビタミン溶液Sigma AldrichM6895M9 培地成分
マイクロフルイダイザーAvestinEmulsiFlex-C3迅速かつ効率的な細菌細胞溶解
マイクロピペットサーモフィッシャー適切にフィットする使い捨てチップを備えたマイクロピペットの較正セット(エッペンドルフなどの複数のメーカーから入手可能)
モノ塩基性リン酸カリウムシグマアルドリッチ1551139M9培地成分
NMRピペットシグマアルドリッチ255688NMRチューブからサンプルを取り外すには
NMRサンプルチューブNewEraNE-SL5高磁場NMR分光計に適しています
分取遠心機ベックマン・コールターアバンティ J-HC組換えタンパク質発現後の大腸菌細胞の収穫
丸底ポリスチレン遠心チューブコーニング352057透明な細菌溶解物
振とうインキュベーターエッペンドルフS44I200005大腸菌のスターターおよび発現培養物の温度制御された増殖
塩化ナトリウムグマ・アルドリッチS5886M9メディアコンポーネント
超音波処理 水浴と真空源トーマス・サイエンティフィ緩衝液の脱気に使用
ソニケーターサーモフィッシャーFB505110細菌細胞の溶解または細菌のDNAのせん断に使用
分光光度計インプリメンOD600 希釈光度計大腸菌タンパク質発現培養物の成長を監視する
Superdex 200 16/600サイズ exculsioncolumCytvia28989333最終タンパク質精製ステップ
Topspinソフトウェア、バージョン3.2以降ブルカーNMR装置用オペレーティングソフトウェア
形質転換能力 大腸菌細胞サーモフィッシャーC600003ワンショット BL21 スター (DE3) ケミカルコンピテント大腸菌、他の菌株は互換性があるかもしれません
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP)サーモフィッシャー20490一部のスルフヒドリル反応性抱合体と互換性のある還元剤
UV-Vis分光光度計NP80を実装タンパク質濃度を測定します。
ウォーターバス、温度制御サーモフィッシャーFSGPD25細菌形質転換のヒートショックステップ用
酵母抽出物Sigma AldrichY1625必要に応じてM9培地を補充するため
レに対応 の初期分画 lacオペレーターLB寒天熱のを装備 を提供 シック

参考文献

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