マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム

サマリー

我々は、細胞数を識別するために一般化可能な領域ベースの画像解析アプローチを利用する方法を提示する。異なる細胞集団の分析は、適応アルゴリズム内の異なる細胞型間の有意な細胞高さおよび構造の違いを利用した。

要約

細胞の定量化は、幅広い生物学的および生化学的研究に必要です。細胞の従来の画像解析では、通常、免疫蛍光染色や蛍光タンパク質によるトランスフェクション、またはエッジ検出技術などの蛍光検出アプローチのいずれかが採用されますが、これはノイズやその他の画像背景の不理想性のためにエラーが発生しやすいことがよくあります。

我々は、組織再生中にしばしば共局在化する異なる表現型の細胞であるマクロファージと線維芽細胞を正確に数えて区別できる新しいアルゴリズムを設計した。MATLABを使用してアルゴリズムを実装し、背景との身長の違いに基づいて異なる細胞タイプを区別しました。主要なアルゴリズムは、セルサイズ/構造と高密度シード条件の変動を説明するために、面積ベースの方法を使用して開発されました。

細胞構造における非理想性は、所与の細胞型の実験データを用いて計算された細胞被覆率などの内部パラメータを利用する二次的な反復アルゴリズムを用いて考慮された。最後に、画像内の相対的な高低差の評価に基づいて、様々な細胞型を選択的に除外した単離アルゴリズムを用いて、共存環境の分析を行った。このアプローチは、単一培養細胞では5%の誤差範囲内、共存細胞では10%の誤差範囲内の細胞を正確に計数することが判明した。

概要

画像解析技術中にソフトウェアが日常的に実装され、結果が正確、効率的、かつ偏りのないものになるようにします。細胞ベースのアッセイの場合、一般的な問題は細胞の誤同定です。焦点とコントラストの設定が不適切な画像では、細胞のぼやけが生じ、個々の細胞の境界が識別しにくくなる可能性があります¹。毛穴、気泡、またはその他の望ましくない物体などの無関係な画像特徴の存在は、計数プロセスを遅らせ、誤識別につながることによって計数手順を妨げる可能性がある。さらに、細胞カウントは厄介な場合があり、数百回の反復のカウントは非常に時間がかかる可能性があります。さらに、手動計数中に固有の主観的バイアスが存在するため、細胞同定に関する意思決定はしばしば不正確である²。自動化されたソフトウェアは、研究者バイアスの影響を軽減する明確に定義された識別基準に基づいて、人間の正確な検出能力をはるかに超えた物体を含む無関係な物体から細胞を迅速かつ正確に区別することによって、これらすべての問題を回避するエキサイティングな可能性を提供します。自動化されたソフトウェアを使用して細胞を識別するための一般的な技術には、セグメンテーションと閾値化の2つの主要な方法^{が含まれます。}ここでは、広くアクセス可能なソフトウェアフレームワーク内で迅速、正確、かつ安価なセルカウントを可能にする一般化可能な領域ベースのプロトコルを実証する。

エッジ検出などのセグメンテーション技術は、画像内の強度差を利用して個々の細胞を分離しようとします。セルを画像の残りの部分と区別する強度の変化は、ほとんどの場合、明るさの急激な変化^{で構成されています 4}。エッジ検出には、正則化フィルタリングステップと、強度変化が検出される微分ステップが含まれます。分化プロセスは、高強度変化の画像内の辺および輪郭を識別し、これらの辺および輪郭は細胞の存在と相関している。ノイズの多い画像はノイズ除去アルゴリズム⁴で実行できますが、エッジ検出技術は背景ノイズの少ない画像の解析に理想的です。このプロセスは、細胞境界が明確かつ容易に区別可能であり、細胞の存在、細胞のぼやけ、無関係な物体、または定義された内部細胞構造^1,2とは無関係の輝度輪郭によって妨げられない場合に最適に機能する。画像が特にノイズが多い場合、細胞は蛍光染色または蛍光タンパク質^2,5によるトランスフェクションによってさらに区別され得る。これにより、セグメンテーション技術の精度が大幅に向上しますが、イメージング用の細胞培養物を準備するには、追加のコストと追加の時間投資が必要です。

閾値化手法では、画像を前景と背景の 2 つのカテゴリに分割し、セルを前景³ に割り当てます。これらの手法では、色/コントラストの変更を利用して、オブジェクトの見かけの高さを定義します。日常的に背景よりも「背が高い」オブジェクトは、セルとして簡単に識別できます。集水域変換は、サーフェスを明るいピクセルを前景、暗いピクセルを持つサーフェスを背景 ^6,7 に関連付けることによって、このように機能します。高さベースの識別を通じて、閾値化技術は、ノイズが同じ焦点面内に存在する限り、ノイズを所望のオブジェクトと日常的に区別することができる。エリアベースの定量化と組み合わせると、集水域変換は、エッジ検出などの一般的なセグメンテーション手法が不正確である環境でオブジェクトのグループを正確に識別できます。

集水域変換は、一般にセグメンテーション技術と組み合わせて、よりクリーンな解析のために画像を準備するため、セルカウントの精度が向上します。このプロセスでは、集水域変換を使用して、セグメンテーションの前に潜在的な関心領域を強調表示します。集水域変換は、画像の前景にあるセルを識別することによって独自の利点を提供し、背景の不均一なパッチなど、細胞の潜在的な偽陽性を除去することによってセグメンテーション分析の精度を向上させることができます。ただし、セルベースの画像を集水域変換に適応させようとすると、問題が発生する可能性があります。細胞密度の高い画像は、細胞の集合体が個々の成分としてではなく特異なグループとして識別される過小セグメンテーションに悩まされる可能性があります。ノイズや急激な強度変化の存在はまた、アルゴリズムが細胞を過剰に分離し、過剰で不正確な細胞数をもたらすオーバーセグメンテーション^{をもたらす可能性がある8}。

ここでは、 図1に示すように、面積ベースの定量化アルゴリズム内に閾値化分析のコンポーネントを組み込むことによって、集水域変換の主な欠点を最小限に抑える方法を詳述します。特に、このアルゴリズムはオープンソースおよび/または広く利用可能なソフトウェアで実装され、この細胞計数フレームワークの適用は高価な試薬または複雑な細胞調製技術なしで可能であった。RAW264.7マクロファージは、結合組織維持および創傷治癒プロセスの調節におけるそれらの重要な役割のために、この方法を実証するために使用された⁹。さらに、NIH/3T3線維芽細胞は、組織の維持および修復において重要な役割を果たすため、分析された。線維芽細胞はしばしばマクロファージと共存し、サポートし、共存研究においてこれらの表現型的に異なる細胞型を区別する必要性を生じさせる。

高い生細胞密度(VCD)を有する画像からの細胞数は、細胞が被覆する面積と、特異な細胞が占める平均面積を計算することによって、確実かつ効率的に定量化することができた。細胞同定のためのセグメンテーションとは対照的に閾値化を使用することで、共存培養中の異なる細胞タイプを同時に分析する実験など、より複雑な分析も可能になりました。NIH/3T3線維芽細胞は、創傷治癒部位内でRAW264.7マクロファージと共局在することがしばしば見出され、マクロファージの焦点面とは異なる焦点面で増殖することが見出された¹⁰。したがって、複数の閾値化アルゴリズムを実行して、分析対象の細胞型に応じて背景と前景を定義し、同じ画像内の2つの異なる細胞型を正確にカウントすることができました。

プロトコル

1. 細胞培養と画像取得

1. RAW264.7マクロファージを、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1.5g/L炭酸水素ナトリウム、および5μM β-メルカプトエタノールを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で37°Cおよび5%_CO2 で培養した。
   1. 単一培養イメージングのために、RAW264.7細胞を1mL培地を含む5mL細胞培養フラスコ中で25,000細胞/^cm2 の密度で培養する。
2. NIH/3T3細胞を37°Cで培養し、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシン¹¹を添加したDMEM中で5%_CO2培養した。
3. 共培養イメージングでは、RAW264.7マクロファージとNIH/3T3線維芽細胞を様々な比率で、合計密度25,000細胞/^cm2で一緒に培養した。RAW264.7培地(10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、1.5g/L炭酸水素ナトリウム、5μM β-メルカプトエタノールを添加したDMEM)およびNIH/3T3培地1部(10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM)である共存培地を使用してください。
4. 播種後、細胞を37°Cおよび5%_CO2 でインキュベートして、80%細胞コンフルエントの生細胞密度に達する。
5. 40倍の対物レンズを搭載した倒立顕微鏡で細胞を画像化します。すべての画像をグレースケールで取得し、生の '.czi'ファイルにエクスポートします。
   1. さまざまな画質の画像を正確に評価するアルゴリズムの能力を決定します。さまざまな病巣を持つ画像を集録し、「球根以外の」画像(図2)と「球根」の画像(図3)の両方を生成します。
   2. MATLAB分析の前に、生の '.czi'ファイルの「バッチ変換」関数を使用して、ImageJを使用してセル画像をエクスポートし、8ビットtiff(.tiff)画像形式に変換します。変換された画像をローカルフォルダに保存し、これらの画像ファイルを関連するMATLABビンに手動で転送します。

2. 画像解析-「単一培養.m」ファイルを主に利用した単一培養

メモ: 次の手順は、MATLAB を使用して実行しました。MATLAB プロトコルには、アルゴリズムを含むファイルである "process.m" (補足コーディング ファイル 1)、"monoculture.m" (補足コーディング ファイル 2)、単一培養イメージの分析用に実行するファイル、および "coculture_modified.m" (補足コーディング ファイル 3) の 3 つのファイルが使用されました。

1. 面積ベースの方法を使用して、相対的な高さの変化を示すセルの画像を取得します。各サブイメージの 'imshow()' 関数を利用して、各サブステップのイメージ出力を行います。解析用のイメージ ファイルをコピーしてビンに貼り付け、次のコマンドにファイル名を入力します。 実行 を押してプログラムを起動します。
   imread('ファイル名.tiff')
   1. ソース関数⁸ を使用して、「再構築によって開く」に続いて「再構築によって閉じる」ことによって画像を分析し、背景から前景を拡大します。再構築によって開くには最初のコマンドを使用し、再構築によって閉じるには2番目と3番目のシーケンスを使用します
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. 再構成された画像を、百分位数ベースの識別システムを利用して純粋な黒と純粋な白のピクセルに二値化します。このシステムでは、セルは純粋な白のピクセル値 '255' に変換されますが、背景と無関係な (セル以外の) オブジェクトは純粋な黒のピクセル値 '0' に変換されます。
   1. 特定の画像の少なくとも 0.5% を構成する最大のピクセル値である「最大関連ピクセル」との百分位差を使用して、セルを背景から区別します。
   2. RAW264.7マクロファージのピクセル値を分析および評価する。これらの値が関連する最大ピクセルの 4.5% 以内にある場合は、ピクセルをセルラーとしてマークします。
      メモ: このコマンドは、単純な if ステートメントを使用して発行できます。
   3. 図 2 に示すような球根状の細胞プロファイルを含む画像の場合、次のように反復手順を実装して、細胞の中心 (「アイランド」と呼ばれます;下記参照) での誤った 2 値化を補正します。
   4. セルの総カバレッジの初期推測を決定します。60%がこの研究に利用された。画像内に存在する細胞の数は、細胞被覆率に依存するべきであることに留意し、したがって、細胞数と細胞被覆率との関係は実験的に決定することができる。この関係を使用して、変数 'アルファ' と 'カッパ' を決定します。
      注: 'Alpha' は、次の相対高さ百分位数を含む 3 x 1 ベクトルを表します: 細胞が識別された高さ百分位数、背景が識別された高さ百分位数、および強度値がセル値よりも有意に低い島 - 領域が典型的に存在する高さ百分位数。「カッパ」は、画像内のセルがカバーする総面積を表します。
   5. アルゴリズムを実行して、(i) アルファとカッパの初期推定値を使用して画像を分析し、島の一部を塗りつぶし、(ii) 解析後のセル数とカバレッジを使用してカッパを再計算します。κ値が最初の推測の 10% 以内にある場合は、次の手順に進みます。
      注: RAW264.7 および NIH/3T3 セルを含む画像では、アルファは [4.3, 5.5, 10] であることがわかりました。言い換えると、最大関連ピクセルからの4.3%の差が、細胞が識別された高さ百分位数を決定し、最大関連ピクセルからの5.5%の差が、背景が識別された高さ百分位数を決定した。関連する最大ピクセルとの 10% の差によって、島が通常存在する高さの百分位数が決定されました。
3. 画像の二値化に続いて、オープンソースの円発見アルゴリズムを用いて平均セル面積を自動的に決定し、これは二値化画像¹²、^13、14に対してハフ変換を実行する。次のコマンドを使用して、画像内で見つかったすべての中心位置と円の半径のベクトルを取得します。
   '[中心、半径] = インファインドサークル(A, [マイナス半径, 最大半径])'
   このコマンドの 'A' は選択した画像で、[minradius, maxradius] はアルゴリズムが検出しようとする半径の範囲です。
   注:平均細胞面積を決定するこの手順は、マクロファージ細胞の形態が細胞間で円形かつ一貫していたと仮定する¹⁰。実験データから、マクロファージの半径は、40倍の倍率で30〜50ピクセルの間であることが最も一般的であることが観察される。このピクセル範囲は、円検出アルゴリズムの許容範囲として定義されます。半径は他の細胞型では有意に異なる可能性があり、実験分析を用いた決定が必要となる。
   1. 半径出力を使用して、平均化によって平均セル面積を計算します。少なくとも 10 個のセルを分析して、正確な領域識別を確保します。
4. 平均セル面積を使用して、画像内のセルの総数を決定します。
   1. イメージ マトリックスをループ処理し、セル ピクセルの合計数をカウントします。セルのピクセル数を画像内の合計ピクセル数で割って、セルの総カバレッジを求めます。セルのピクセル数をセルの平均面積で割って、画像内のセルの総数を求めます。

3. 主に「coculture_modified.m」ファイルを利用した画像解析・共培養

メモ: 次の手順は、MATLAB を使用して実行しました。

1. 面積ベースの方法を使用して、相対的な高さの変化を示すセルの画像を取得します。各サブイメージの 'imshow()' 関数を利用して、各サブステップのイメージ出力を行います。解析用のイメージ ファイルをコピーしてビンに貼り付け、次のコマンドにファイル名を入力します。 実行 を押してプログラムを起動します。
   'imread('filename.tiff')'
   1. ソース関数¹⁰ を用いて「再構成によって開く」に続いて「再構成によって閉じる」ことによって画像を分析し、背景から前景を拡大する。再構築によって開くには最初のコマンドを使用し、再構築によって閉じるには 2 番目と 3 番目のシーケンスを使用します。
      'imopen ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. RAW264.7およびNIH/3T3細胞を含む共培養の分析を、2つの細胞タイプの高低差を利用して得られた2つの選択的二値化を用いて実施する。
   1. RAW264.7およびNIH/3T3細胞の画像を使用してパラメータ「φ」を実験的に決定し、φは2つの細胞タイプの比例高低差を表す。初期 phi 値を推測し、セル数とカバレッジが手動カウント (RAW264.7 および NIH/3T3 コカルチャーに固有の) と密接に一致するまで繰り返します。
      注:これらの研究で使用されたφの値は3.2であることが判明した。Phiは、 図4Cに示すように、RAW264.7セルのみを含むように画像を選択的にフィルタリングするために使用されます。
   2. RAW264.7 細胞数と総細胞カバレッジを、単一培養画像の場合と同様の方法で決定します。
3. 集水域変換画像を phi パラメータなしで再度解析し、マクロファージと線維芽細胞の両方を検出します。ステップ2で説明した標準的な閾値化および面積ベースの定量方法を使用して得られたRAW264.7細胞ピクセルを選択的に減算することによって、NIH/3T3線維芽細胞データを取得します。
   1. 画像全体を解析したら、RAW264.7ピクセル数からセルピクセルの総数を差し引いて、NIH/3T3ピクセルの総数を求めます。NIH/3T3 および RAW264.7 セルのカバレッジを計算するには、各セル ラインのセル ピクセル数を画像ピクセルの総数で割ります。

結果

非球根RAW264.7マクロファージの分析は、25,000細胞/^cm2の単一培養設定で実施した。代表的な画像を細胞培養物の撮影し、ImageJの8ビットtiffへの変換後にMATLABで処理した。プロセス全体を通してアルゴリズム出力が記録され、代表的な画像について 図2 に文書化された。この画像では、アルゴリズムは226個の細胞をカウントし、この画像カウントは、241個のセルを同定した手動カウント(6.2%エラー)と比較することによって検証された。RAW264.7セルカウントの少なくとも10枚の画像に対するアルゴリズム出力の平均誤差は4.5±1.9%であった。

球根RAW264.7マクロファージの分析は、反復アルゴリズムを用いて行った。ほとんどの画像において、観察された球根効果は、主に、細胞が接着していた基質の焦点面よりわずかに高い焦点面に焦点を合わせた結果であった。したがって、ほとんどの画像は非球根状で取得され、分析は有意に容易であった。球根画像の解析に必要なアルゴリズムは、メニスカス効果やその他の...

ディスカッション

細胞の高さに基づいて細胞を正確かつ効率的に計数する一般的な領域ベースの手順を設計し、共存系でも細胞の染色のない定量を可能にしました。この手順の重要なステップには、細胞を分化させることができる相対強度システムの実装が含まれていた。相対高さ分析の使用は、相対パラメータが特定のセルタイプとパラメータに対して一定であったため、外部パラメータの必要性が不要になり、絶対輝度/コントラストレベルをすべての画像に入力する必要がないという2つの目的を果たしました。さらに、百分位数ベースのシステムを使用すると、異なる細胞型が画像内の一意の高さに存在する限り、同じ画像内の複数の細胞型の解析が可能になりました。

百分位数ベースのシステムは、平均とは対照的に、最大ピクセル値との差として定義されました。これは、画像中に存在する細胞の数および合流度に依存していた平均強度値に基づくアルゴリズムの歪を防止するために行われた。さらに、「最大関連ピクセル」は、最大強度外れ値がデータに有意に影響を与えるのを防ぐために実装された - 最大関連ピクセルは、母集団の少なくとも0.5%を表す必要があるであろう - 実験値。追加の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Axio Observer 7 倒立顕微鏡	ツァイス	1028290770
&β;-メルカプトエタノール	Life Technologies	21985023
細胞スクレーパー	CellTreat	229310
デュブレッコのモディファイド イーグル ミディア	フィッシャー サイエンティフィック	12430047
デュブレッコの PBS	フィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ	ック 14190144
MATLAB ソフトウェア	MathWorks	2021A
NIH/3T3 セル	ATCC	ATCC CRL - 1658
ペニシリン–ストレプトマイシン	ΣAldrich	P4333-20ML
RAW264.7 細胞	ATCC	ATCC TIB - 71
重炭酸ナトリウム	ΣΣ Aldrich	S6014-25G
T75 細胞培養フラスコ	コーニング	CLS3814-24EA