TCID50アッセイを用いたウイルス滴定のための視覚細胞パシー効果ベースの読取を改善するための結晶バイオレットの使用

サマリー

このプロトコルは、光学顕微鏡法および免疫細胞化学染色と比較することにより、結晶バイオレットを用いてウイルス滴定を可視化する正確かつ客観的なアプローチを示す。

要約

ウイルス滴定は、ウイルス学研究の重要なアッセイです。TCID50アッセイおよびプラーク形成単位(PFU)アッセイ による 細胞パシー効果(CPE)の検出は、ウイルスストックの力量を計算する2つの主要な方法であり、多くの場合、可視化のための顕微鏡検査検出または細胞染色に基づいています。TCID50アッセイの場合、客観的可視化は、一般に 、細胞内 ウイルスの免疫細胞化学(ICC)染色に基づいて、顕微鏡による視覚的CPE検出と組み合わせた力素を計算する。しかし、ICC染色はコストがかかり、時間がかかります。本研究では、顕微鏡、ICC染色、結晶紫色染色 を用いた 視覚的CPE観察を比較し、豚由来のインフルエンザAウイルス(IAV)と豚生殖呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の2つのCPE形成ウイルスの強気体を決定した。我々は、結晶バイオレットとICC染色の両方が視覚的なCPE検出よりも正確であり、IAVとPRRSVの両方でほぼ同じレベルの精度を示していることを示す。このため、ここでは、細胞株に滴定されたCPE形成ウイルスに対するTCID50アッセイのウイルス滴定を迅速かつ手頃な価格で測定する方法として、結晶紫色染色を提示する。

概要

TCID50アッセイを介したウイルス滴定は、^{感染症研究1}で一般的に使用される技術である。この方法の背後にある数学のバリエーションは、時間^{1、2、3、4}の上に提案されているが、感染検出の現在適用されている方法^{は、顕微鏡}5を使用してサイトパシー効果(CPE)の存在を通じて視覚的確認に依存している。TCID50アッセイでCPEの可視化をより客観的に確認するために、ウイルスのタンパク質を標的とする免疫細胞化学(ICC)細胞内染色は、異なるウイルスが様々な形態のCPEを産生することができるため、最も一般的に使用^{される方法の}1つである。我々の場合、細胞形態学的変化は、インフルエンザAウイルス(IAV)と豚生殖および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の両方に感染した場合に似ており、感染した細胞は切り上げられ、プレートから切り離される。PRRSVの場合、それはすべての細胞が井戸から剥離してしまう「総破壊」として知られているCPEを引き起こします。一方、IAVは、感染後に少数の細胞が剥離しない「小計破壊」として知られる総破壊と追加のCPEの両方を提示することができる⁷。しかし、この技術は実行に時間がかかり、比較的高価な試薬を使用する必要があります。ICCはCPEにラベルを付けるのではなく、ウイルスに感染した細胞の数に注意することが重要です。これは、インキュベーションの終わりまでに正常に感染した細胞は、感染がまだCPEを引き起こしていない場合でも陽性と見なされることを意味し、したがって、CPEと比較してICC陽性細胞のより高い割合が期待される。そのため、この研究では、細胞膜に付着し、接着細胞を染色するために使用される正の電荷を有する化学物質である、結晶バイオレットに基づくTCID50アッセイにおけるCPEの視覚的検出の相補的な方法を説明する。クリスタルバイオレットは、プラーク形成ユニットを測定するためにウイルス学の研究でしばしば利用され、とりわけ^8。

本研究では、非染色顕微鏡CPE検出の感度を、高感度に起因する目的が高いことが知られているウイルスタンパク質認識に基づく結晶バイオレット染色および免疫細胞化学的染色と比較した。この研究は、結晶紫と免疫細胞化学染色の両方が視覚的な顕微鏡ベースのCPE検出よりも正確であり、TCID50滴定で感染した井戸を客観的に同定するために使用できることを示している。細胞株でテストされた細胞質ウイルスにほぼ同じレベルの精度に達する能力を考えると、結晶バイオレットはTCID50アッセイ上のウイルス滴定を決定するためのより速く、より手頃な方法として提示される。クリスタルバイオレット染色を使用した提案方法は、パラホルムアルデヒド(PFA)インキュベーションに15分、結晶バイオレットインキュベーションに5分、材料調製、緩衝液、乾燥のために最大15分で、実行するのに合計40分の時間がかかります。比較に適用される免疫細胞化学プロトコルは、平均時間4時間30分を要し、前述の^とおりに行った。提案された方法は、完成したウイルス滴定を視覚化することを目的としている。感染および潜伏時間は、ウイルスに応じて異なるレイアウトで行うことができる。ここでは、細胞株に細胞性効果を有する2つのRNAウイルスを試験した。

プロトコル

1. 滴定プロトコル

注意:接着細胞に感染するサイトパシーウイルスを使用してください。このデモでは、豚由来のインフルエンザAウイルス(IAV)(A/カリフォルニア/07/2009/(H1N1))および豚生殖・呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)2型、NC1-7-4株を使用した。

1. バイオセーフティレベル2(BSL-2)の研究室にあるバイオセーフティキャビネットで、これらのウイルスを96ウェルプレートで7日間テツレートします。
   1. これらの滴定を行うために、必要な細胞株を有する96ウェルプレートをシードする。PRRSV の場合は、MA-104 セルラインを使用し、IAV 用 MDCK セルラインを使用します。細胞培養のために、10%FBS、L-グルタミンおよびペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEM培地を使用し、合流する細胞を成長させる。
   2. 感染前に、200μLのPBSを用いて細胞を洗浄する。
   3. 900 μLのメディアと100 μLのウイルスを混合して、10倍希釈シリーズを使用してウイルスストックを希釈します。適切に媒体とウイルスの混合を確保し、希釈エラーを回避するためにチューブを適切にボルテックスしてください。
   4. 蓋のプレートのレイアウトに印を付けます。1xリン酸生理食塩液(PBS)で井戸を洗います。前述の滴定方法^2,3に従って対応するウェルに接種液の50 μLを加^えます。
   5. 5%_CO2 インキュベーターで7日間、37°Cでインキュベートします。

2. 顕微鏡による 細胞パシー効果(CPE)評価

1. 7日間のインキュベーションの後、200 μLの1x PBSで全てのウェルを2回洗浄します。
2. CPEを視覚的に検出するために、光学顕微鏡下でプレートのすべてのウェルを評価します。PRRSVとIAVの両方の場合、CPEは細胞死とその後のプレートからの剥離で構成され、単層破壊を引き起こします。しかし、他のウイルスは異なる種類のCPEを提示する可能性があります。

3. 染色プロトコル

注:サイトパシー効果(CPE)は、結晶紫色染色 を介して 評価した。

1. 7日間のインキュベーションの後、200 μLの1x PBSを2回使用してすべてのウェルを洗浄します。
2. 1x PBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)の50 μL/ウェルを加えて細胞を固定し、室温(RT)で15分間インキュベートします。
3. インキュベーション後、200 μLの1x PBSで細胞を2回洗浄します。その後、水で4%希釈したクリスタルバイオレットの50 μL/ウェルを加え、RTで5分間インキュベートします。
   注:クリスタルバイオレット化学は、固定時にプレートに付着したままの細胞を染色し、細胞が分離した井戸のセクションを染色されていない状態のままにします。
4. 最後に、ウェルからクリスタルバイオレットを吸引し、必要に応じてプレートをRTで2〜5分間空気乾燥させたままにするか、200 μLの水でプレートを洗浄して、視覚化前に余分な汚れを取り除きます。
5. 前述の方法を使用して、値を数学的に計算します。ここで、カルバー式とミュンヒ式をそれぞれ^PRRSV及びIAVに適用し、^{2,3を行った}。これらの方程式の詳細は、代表結果セクションに示されています。

4. 免疫細胞化学(ICC)標識

注:両方のウイルスに対する免疫細胞化学の標識は、前述の方法^9,10,11に従って行った。

1. 滴定の7日間のインキュベーションの後、ステップ3.2で説明したようにPFAを用いて細胞を固定する。
2. 1M塩酸塩100mL、サポニン1g、および8.5gのNaClを_H2Oの900mLで構成する溶液でプレートを洗浄します。その後、1x PBSと5%の胎児セラム(FBS)の混合物で2つの追加の洗剤を完了し、20分間室温(RT)でそのトリスサポニンNaCl溶液とインキュベートします。
3. RTで2時間一次抗体ですべてのウェルをインキュベートします。
   注:各ウイルスの一次抗体の容量は100 μLで、1x PBSで2%FBSの1:300希釈を使用して調製しました。
4. ステップ4.2で調製したトリス、サポニン、およびNaCl溶液で細胞を2回洗浄します。
5. RTで1時間二次抗体ですべてのウェルをインキュベートします。
   注:二次抗体の体積は100 μLで、1x PBSで2%FBSの1:250希釈を使用して調製しました。
6. ステップ4.2で説明したように、トリス、サポニン、およびNaCl希釈で細胞を洗浄します。
7. 以前の希釈液を吸引し、RTで30分間のメーカーの指示に従って水に1:50の最終的な希釈で200 μL/ウェルのアミノエチルカルバゾール(AEC)溶液でプレートをインキュベートします。
8. インキュベーション後、AEC溶液を廃棄し、1x PBSの100 μL/wellを加 えて顕微鏡で イメージングします。
9. ステップ 3.5 で説明したように、数学的に、その気数を導き出します。

結果

この式は、式で式を数学的に算出するために使用した式を^、前に説明した^2,3。

簡単に言えば、PRRSVの場合、我々は、カルバー法を適用します。

Titer (TCID50) = 10 ^{T + 1.3} は次の場所に示します。

この式d = 完全な陽性ウイルス応答を伴う最後の希釈の負のログ: 5 つの陽性反復;r = 希釈範囲のログ。N = 希釈による反復の数。n = 次の希釈でのウイ...

ディスカッション

ウイルス滴定はウイルス学研究で日常的に使用されており、PFU検出およびTCID50アッセイは最も一般的に使用される^{1,2,3,4です}。どちらの方法も感染細胞のCPEの検出に依存しており、顕微鏡検査を介して視覚的に評価することができるにもかかわらず、通常、より客観的な結果を得るために、あるいは潜伏時間を短縮するために染色が適用される。TCID50の場合、正確で客観的な測定を提供する視覚的なCPE検出に最も一般的に使用される代替手段の1つはICC染色⁶であり、これは特定^の抗体の利用のために時間がかかり、しばしば高価である^9,10です。しかし、この種のアッセイは、可視化のための結晶紫色染色の適用からも恩恵を受...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル細胞培養プレート	ジェネシー	25-221	透明で平底
のAEC溶液	サーモフィッシャー	1122
クリスタルバイオレット	サーモフィッシャー	C581-25;C581-100
DMEM	Corning	10-017-CV
ウシ胎児血清	BioWest	S1480
パラホルムアルデハイド	サーモフィッシャー	J19943
原発インフルエンザ抗体	Bioss	BS-0344R
一次PRRSV抗体	Bioss	BS-10043R
サポニン	サーモサイエンティフィック
二次抗体	Invitrogen	31460
Tris Hydrochloride	Thermo Scientific	AM9856