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方法論記事

レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

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DOI:

10.3791/63073

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2021年10月20日

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1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

この記事について

サマリー

本稿では、共焦点ライブ顕微鏡を用いた一次海馬および皮質ニューロンにおける急性摂動に対する基底レドックス状態と酸化還元反応の違いを判断するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、他の細胞タイプや顕微鏡に最小限の変更で適用できます。

要約

ミトコンドリアレドックスホメオスタシスは、神経の生存率と機能のために重要です.ミトコンドリアには複数のレドックス系が含まれていますが、豊富なチオールジスルフィドレドックスバッファーグルタチオンは抗酸化防御の中心的なプレーヤーと考えられています。したがって、ミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位を測定すると、ミトコンドリア酸化還元状態および酸化ストレスに関する有用な情報が得られます。グルタレドキシン1-roGFP2(Grx1-roGFP2)は、510nmで1つの放出ピークを有する400nmおよび490nmの2つの酸化還元状態感受性励起ピークを有するグルタチオン酸化還元電位の遺伝的にコードされた緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの比比指標である。本稿では、一次海馬および皮質ニューロンにおけるミトコンドリア標的Grx1-roGFP2の共焦点ライブ顕微鏡を行う方法について説明する。これは、定常性ミトコンドリア・グルタチオン・レドキ酸価(例えば、疾患状態または長期治療を比較する)を評価する方法と、急性治療時の酸化還元性の変化を測定する方法(興奮性薬物 N-メチル-D-アスパルテート(NMDA)を例として使用する)を説明する。さらに、この記事では、Grx1-roGFP2とミトコンドリア膜電位指標であるテトラメチルrhodamine、エチルエステル(TMRE)の共イメージングを紹介し、Grx1-roGPF2がマルチパラメトリック分析のための追加の指標でどのように多重化できるかを示します。このプロトコルは、(i)共焦点レーザー走査顕微鏡の設定を最適化する方法の詳細な説明を提供し、(ii)刺激のための薬物を適用し、その後、ジアミドとジチオトライトールによるセンサーキャリブレーション、および(iii)ImageJ / FIJIを用いてデータを分析する。

概要

いくつかの重要なミトコンドリア酵素およびシグナル伝達分子は、チオール酸化還元調節1の対象となります。さらに、ミトコンドリアは活性酸素種の主要な細胞源であり、酸化的損傷に対して選択的に脆弱である2。したがって、ミトコンドリア酸化還元電位は、バイオエネルギー、細胞シグナル伝達、ミトコンドリア機能、および最終的に細胞生存率3,4に直接影響を及ぼす。ミトコンドリアマトリックスには、酸化還元恒常性を維持し、抗酸化防御剤を搭載するチオールジスルフィドレドックスバッファーグルタチオン(GSH)の量(1-15 mM)が多く含まれています。GSHは、標的タンパク質に共有結合(S-グルタチオン化)を使用して酸化還元の状態と活性を制御し、酸化タンパク質を減少させる解毒酵素の範囲で使用されます。したがって、ミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位は、ミトコンドリア機能および病態生理学を研究する際の非常に有益なパラメータである。

roGFP2は、人工ジチオールジスルフィドペア7,8を形成する2つの表面露出システインを添加することによって酸化還元感受性にされたGFPの変異体である。それは〜510 nmで1つの放出ピークを有し、〜400 nmおよび490 nmで2つの励起ピークを有する。重要なことに、2つの励起ピークの相対振幅はroGFP2の酸化還元状態に依存し(図1)、このタンパク質をレシオメトリックセンサーにします。Grx1-roGFP2センサーでは、ヒトグルタレドキシン-1(Grx1)がroGFP29,10のN末語に融合されています。RoGFP2へのGrx1酵素の共有結合は、センサーの2つの大きな改善を提供する:それはGSH / GSSGグルタチオンレドックス対(図1)に特異的なセンサー応答を作り、少なくとも100,0009の倍によってGSSGとroGFP2の間の平衡化を加速する。従って、Grx1-roGFP2は細胞グルタチオン酸化還元電位の特異的かつ動的なイメージングを可能にする。

Grx1-roGFP2イメージングは、広視野蛍光顕微鏡、回転ディスク共焦点顕微鏡、レーザー走査型共焦点顕微鏡など、幅広い顕微鏡で行うことができます。一次ニューロンにおけるセンサの発現は、リポフェクション11、DNA/リン酸カルシウム共沈12、ウイルス媒介遺伝子導入、または細胞源としてのトランスジェニック動物の使用を含む様々な方法によって達成することができる(図2)。この記事では、AAV1およびAAV2キャプシドタンパク質1:1比を含む擬似型組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)を使用した。このベクターを使用すると、最大センサ発現は、通常、感染後4〜5日に達し、少なくとも2週間安定した状態を保ちます。マウスやラットの一次海馬および皮質ニューロンでGrx1-roGFP2を使用しました。

本稿では、一次ラット海馬および皮質ニューロンにおけるミトコンドリア標的Grx1-roGFP2のrAAV媒介発現を用いて、基底ミトコンドリアグルタチオンレドックスの状態とその急性摂動を評価する。(i)レーザースキャン共焦点顕微鏡の設定を最適化する方法、(ii)ライブイメージング実験を実行し、(iii)FIJIを使用してデータを分析する方法についての詳細な手順を備えた共焦点ライブイメージング用のプロトコルが提供されています。

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プロトコル

すべての動物実験は、欧州議会の理事会指令2010/63/EUを含む国家および制度的ガイドラインに準拠し、完全な内務省の倫理的承認を得ました(ハイデルベルク大学動物福祉事務所とレジエルングスプラエシジウム・カールスルーエ校、ライセンスT14/21およびT13/21)。一次海馬および皮質ニューロンは、標準的な手順に従って新生児マウスまたはラットの子犬から調製され、前述の13日に12〜14日間維持された。

1. ソリューションの準備

  1. イメージングバッファ用ストックソリューション
    1. 表1に従って各ストック液を準備し、4°Cに保ちます。 長期保存(>3ヶ月)の場合は、アリコートを-20°Cに保ちます。
コンポーネントMW濃度(M)金額 (g)ボリューム (mL)
ナクル58.44514.6150
KCl74.5531.125
MgCl2·6H2O203.31.925
CaCl2·2H2O147.0111.4710
グリシン75.070.10.37550
蔗糖342.31.525.6750
ピルビン酸ナトリウム110.040.10.5550
ヘペス238.3111.950
グルコース180.152.545100

表1:イメージングバッファ用のストックソリューション

  1. 医薬品および染料のストックソリューション
    1. 水にジアミド(DA;最大405:488比の較正に使用される)を溶解し、0.5Mストック溶液(例えば、1gの水11.615 mL)を得る。アリコートと-20°Cで保管してください。
    2. ジチオスレイトール(DTT;最小405:488比の較正に使用)を水に溶解し、1Mストック溶液(例えば、水の5グラム)を得る。アリコートと-20°Cで最大3ヶ月間保管してください。
    3. N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA;興奮毒性およびミトコンドリア酸化を誘発するために使用される)を水に溶解し、10 mMストック溶液(例えば、水の16.991 mLで25mg)を得る。アリコートは-20°Cで保管してください。 長期保存(>6ヶ月)の場合は、アリコートを-80°Cに保ちます。
    4. テトラメチルロダミンエチルエステル過塩素酸塩(TMRE、ミトコンドリア膜電位の低分子指標)
      1. TMRE粉末をメタノールに溶解し、20mMストック(例えば、2.427mLのメタノール中25mg)を得る。
      2. 20 mM ストックを 1:1,000 メタノールで希釈して 20 μM のストックを得る。
      3. アリコート 20 mM および 20 μM のストックソリューション、パラフィルムでシール、-20 °C で光から保護された保管。
        注:両方のストックソリューションは、数年間安定しています。実験には1,000xストックソリューション(20μM)を使用します。
  2. イメージングバッファ
    1. 測定シリンダーに 表2 から80mLの無菌水を全て添加して、100mLのイメージングバッファーを用意します。滅菌水で最大100mLまでボリュームを持って来ます。溶液が均一に見えるまで慎重に測定シリンダーを振って混ぜます。
      メモ:バッファーの浸透性を確認するには、オスマメーターを使用することをお勧めします。細胞の成長培地にできるだけ近いはずです。ここで、これは315 mOsmol/L.イメージングバッファーと増殖培地の浸透率に合わせて必要に応じてスクロース濃度を増減する。
    2. pH を 7.4 に調整します。アリコートを作り、4°Cで2週間保ちます。長期保存の場合は、アリコートを-20°Cに保ちます。 イメージングバッファは使用前に室温に達します。
コンポーネントストックソリューション (M)最終濃度 (mM)ボリューム (mL)
ナクル51142.3
KCl35.290.176
MgCl2 1.910.053
CaCl2 120.2
グリシン0.10.0050.005
蔗糖1.5523.5
ピルビン酸ナトリウム0.10.50.5
ヘペス1101
グルコース2.550.2

表2:撮像バッファーの組成。 示された容積は、100 mLのイメージングバッファの調製に使用される。

  1. 刺激およびキャリブレーションのためのソリューション
    注:実験の直前に、示された薬剤のストック溶液をイメージングバッファに追加することで、常に新鮮な刺激溶液を準備してください。刺激および較正のための解決は実験の間連続してイメージ投射室に加えられる(セクション3-5を参照)。実験の種類に応じて、異なる溶液がイメージングチャンバー内のそれぞれの最終体積で同じ最終濃度に達するために必要とされる。
    1. 3x NMDA溶液(90 μM、チャンバー内の最終濃度:30 μM)を、63 μLの10 mM NMDAストックをイメージングバッファの6.937 mLに加えて準備します。得られた溶液の500 μLをチャンバに加えます(最終容積:1.5 mL)。
    2. ステップ3と4(1 mM;チャンバー内の最終濃度:0.5 mM)に対して、0.5 M DAストックの14 μLを6.986 mLのイメージングバッファに加えて、2倍のDA溶液を準備します。チャンバーに1 mLを加えます(最終容積:2 mL)。
    3. 0.5 M DA ストックの 28 μL をイメージング バッファの 6.972 mL に加えて、ステップ 5(2 mM;最終濃度)の 4x DA 溶液を準備します。チャンバーに500 μLを加えます(最終容積:2 mL)。
    4. 1 M DTT ストックの 45 μL を 8955 μL のイメージングバッファーに加えて、1x DTT 溶液 (5 mM; チャンバー内の最終濃度: 5 mM) を準備します。この溶液の1 mLを、撮像バッファを吸引した後にチャンバに加えます(最終体積:1 mL)。

2. TMRE を使用したセルのロード

注: このプロトコルでは、TMRE は 20 nM の最終濃度で非クエンチ モード 15 で使用されます。一般に、選択した顕微鏡上で十分な信号強度を提供するTMREの最も低い濃度を使用する必要があります。不均一な蒸発のために、異なる井戸の中の媒体の量は、長期的な一次培養物で異なる場合があります。すべてのウェルで一貫したTMRE濃度を確保するために、TMREを直接ウェルに追加しないでください。代わりに、各ウェルの培地を同量のTMRE含有培地に交換してください。以下のプロトコルは、ウェルあたり培地の〜1 mLを含む24ウェルプレートの一次ニューロンのために設計されています。

  1. 組織培養層流フードで作業し、各ウェルから500 μLの培地を1本の円錐形チューブに集めます。
  2. 20 μM TMRE ストックの 0.5 μL を円錐形チューブに加えます(例えば、24 ウェルの場合は 12 μL)。
  3. 残りの培地を第1ウェルから慎重に吸引し、500μLのTMRE含有培地に交換します。残りの井戸で、よく続けてください。
    注:細胞を乾燥させないようにし、細胞を邪魔しないように注意してください。
  4. 細胞をインキュベーターに戻し、染料平衡のために少なくとも60分待ちます。
    注:負荷時間は、悪影響を及ぼすことなく数時間に延長することができます。
  5. 画像実験全体を通して一貫したTMRE濃度と平衡を確保するために、イメージングバッファおよびすべての刺激溶液に20 nM TMREの最終濃度を含める必要があります。

3. 走査型共焦点顕微鏡設定の最適化

注: このステップは、ライブイメージング中の画質と細胞生存率の間で最良の妥協点を見つけることを目的としています。このセクションでは、roGFP イメージングの設定の最適化について説明します。マルチパラメトリックイメージングが実行される場合、同様の最適化(漂白や光毒性の兆候のない安定したベースラインのチェックを含む)は、追加の指標に対して実行する必要があります。

  1. GFP イメージング(488 nm 励起、505 ~ 550 nm の放出)の共焦点顕微鏡と負荷標準設定を開始します。
  2. 検出器を 12ビットまたは16ビットに 設定 します。
    注: 通常、定量的なイメージングには 8 ビットでは十分ではありません。
  3. シーケンシャルスキャンモードを有効にして、2番目のシーケンス/トラック(405 nm励起、505-550 nm放射)を追加します。
  4. どちらのチャネルでも、露出超過ピクセルと露出不足のピクセルを示す 疑似色のルックアップ テーブル を選択します ( GLOW OU など)。
  5. 対象のオブジェクトに適した目的を選択します。
    注:10x-40xは単細胞分析に適しており、63x-100xは単一ミトコンドリア分析に適しています。
  6. 細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。
  7. 接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。
    注意:細胞を見つけて焦点を合わせるには、蛍光光を使用しないでください。低電力でも、これは細胞に悪影響を及ぼします。
  8. 異なるピクセル形式の画像を記録します。これらの画像に基づいて、対象の構造の許容解像度を与える最小ピクセル数を選択します。
    注:通常、512 x 512 ピクセルは 20x および 40x の目的を持つ単一セルイメージングに適しており、1024 x 1024 または 2048 x 2048 x 2048 ピクセルは、通常、63x の目的を持つシングルミトコンドリアイメージングに適しています。
  9. 異なるピンホールサイズの画像を記録します。これらのイメージに基づいて、目的の構造の許容解像度を与える最大のピンホール サイズを選択します。
    注:通常、3-7風通しのユニットがうまく機能します。
  10. 異なるレーザー強度の画像を記録します。
    1. 検出器のゲインとしきい値を適宜調整します。これらの画像に基づいて、許容可能な信号強度と信号対バックグラウンド比を与える最も低いレーザー強度を選択します。
      1. シグナル対バックグラウンド比を決定するには、細胞またはミトコンドリア(ROI1)を含む対象領域(ROI)および細胞またはミトコンドリア(ROI2)のないROIでのシグナル強度を測定します。次に、ROI1 の強度を ROI2 の強度で割る。
        注:1%レーザーパワーで488 nm励起の300-1,500の個々のROIの強度と1-3%のレーザーパワーと強度を持つ405 nmの励振のための>3と200-1,000の個々のROIの信号強度の信号対バックグラウンド比を目指します。
  11. 異なるスキャン速度とフレーム平均の数で画像を記録します。設定の組み合わせごとに4~5枚の画像を記録します。これらの画像シリーズに基づいて、許容可能な画像ノイズと画像から画像への変動性を与える最高速度と最低の平均設定を選択します。
    注:平均化のための600 Hzと1-2フレームのスキャン速度は、ほとんどの場合うまく動作します。
  12. 新しいカバースリップを使用して、最適化された設定でタイムラプスシリーズを記録します。
    注: シリーズの期間と画像間隔は、計画された実験の時間と同じでなければなりません。
  13. タイムラプスシリーズの終わりに、記録チャンバーに2x DA溶液の1 mLを加えます。画像は2分追加。
  14. 蠕動ポンプまたはハンドヘルドピペットを使用してイメージングバッファーを吸引します。1x DTT溶液を1 mL追加します。さらに5分間の画像。
  15. タイムラプス実験を解析します(セクション5を参照)。
    1. 最適化された設定で DA と DTT の処理中に、2 つのチャネルのいずれも過剰または露出が少なくなることを確認します。
    2. タイムラプス記録中に、2つのチャンネルのどれもかなりの漂白を示さないようにしてください。最初と最後の画像間の強度の<2%の損失を目指します。
    3. イメージング中に405:488の比率が大幅に変化しないことを確認します。
  16. 許容可能な結果を一貫して提供する設定が定義されるまで、いくつかのカバーリップを使用して、反復的な方法で手順全体を繰り返します。

4. 基底酸化の状態の評価

  1. 顕微鏡を起動し、セクション3から最適化された設定をロードします。
  2. フレーム平均を 3-5 に設定します。
  3. 細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。
  4. 接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。
    注意:細胞を見つけて焦点を合わせるには、蛍光光を使用しないでください。低電力でも、これは細胞に悪影響を及ぼします。
  5. スキャンモードに切り替え、488 nmチャネルをライブビューで使用して、イメージング用のセルに焦点を当てて配置します。
  6. マルチポイント機能を使用して、カバースリップ上の3-5の視野を選択します。
  7. ベースラインイメージを記録します。
  8. チャンバーに2x DA溶液1 mLを加えます。
  9. 1、2、3 分後、 ライブビュー を使用してフォーカスを確認/調整し、画像を記録します。
    注:細胞は通常、2分後に完全に酸化されます。
  10. イメージングチャンバのバッファを1mLの1dTT溶液に交換してください。
  11. 3 分と 5 分後、 ライブ ビュー を使用してフォーカスを確認/調整し、画像を記録します。
    メモ:セルは通常、4〜5分後に完全に減少します。

5. 急性治療の生画像化

注:以下のプロトコルは、NMDA治療に対するミトコンドリア酸化還元応答のイメージングについて説明します。他の治療のために、画像の間隔と実験期間を調整する必要がある場合があります。

  1. 顕微鏡を起動し、セクション3から最適化された設定をロードします。
  2. 時間経過間隔を 30 秒、持続時間を 25 分に設定します。
  3. 細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。
    注:熱的な焦点のドリフトを避けるために、タイムラプスイメージングを開始する前に、顕微鏡ステージに10〜15分間放置してください。
  4. 接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。
    注意:細胞を見つけて焦点を合わせるには、蛍光光を使用しないでください。低電力でも、これは細胞に悪影響を及ぼします。
  5. スキャンモードに切り替え、488 nmチャネルをライブビューで使用して、イメージング用のセルに焦点を当てて配置します。
  6. オプション: 1 回の実行で記録されるセルの数を増やすには、 マルチポイント関数 を使用して、カバースリップごとに 2 ~ 3 個の視野をイメージします。
  7. タイムラプス取得を開始し、5枚の画像を2分のベースライン記録として記録します。
  8. 3x NMDA溶液500 μLをチャンバ(最終濃度30 μM)に加え、追加の20枚の画像を10分のNMDA応答として記録します。
    注: ニューロンは、オスモルの変化に非常に敏感です。そのため、イメージングバッファの蒸発を最小限に抑えるようにしてください。長い治療のために、画像の部屋はふたで覆われるべきである。
  9. チャンバーに4x DA溶液500 μLを加え、さらに6枚の画像(3分最大キャリブレーション)を記録します。
  10. イメージングチャンバーからバッファーを吸引し、1mLの1dTT溶液に交換してください。さらに10枚の画像を記録します(最小校正5分)。
  11. 録音を終了し、画像シリーズを保存します。

6. データ分析

  1. フィジーでのデータインポートと画像前処理
    1. ステップ 4 の画像のグループまたは手順 5 のイメージ ファイルを開くには、バイオフォーマット インポーターを使用します。プラグイン|をクリックします。バイオフォーマット|バイオフォーマット輸入者。ダイアログ ボックスで、[スタックの表示: ハイパースタック] を使用し、[カラー モード] を設定します。
      メモ: 自動スケール は、コンピュータ画面上のデータの表示を最適化します。ピクセルの強度は変更されません。
    2. 手順 4 の個別の画像が開かれた場合は、[ イメージ] |スタック|ツール|連結 して単一イメージ スタックにマージします。
    3. 画像シリーズ中にXY-ドリフトがある場合は、プラグインをクリック |イメージを登録 します。ダイアログ ボックスで、[ リジッド ボディ ]または[ 変換]を選択します。
    4. [イメージ] をクリックして、イメージ形式を 32 ビットに変更 |タイプ|32ビット。
    5. [イメージ]をクリックしてカラーチャンネルを別々のウィンドウに分割 |カラー|チャンネルを分割します。
    6. チャンネル1(405 nm)を選択し、画像|をクリックして、分析用ミトコンドリアを選択する閾値を調整します。|を調整するしきい値。ダイアログ ボックスで、[既定]、[赤]、[暗い背景]、[スタック ヒストグラム] を選択し、選択したピクセルが赤く表示されるのを待ちます。[適用] をクリックします。「背景ピクセルを NaN に設定」を選択し、すべての画像を処理します。
      注: 観測者の偏りが生じる可能性を避けるため、自動しきい値決定を使用する必要があります。FIJI では、しきい値ダイアログボックスのドロップダウンメニューから選択できる自動化メソッド(デフォルト、黄、インターモード、大津など)を提供しています。通常、Default メソッドは、良い結果を提供します。最初の分析で複数の方法を比較して、指定された画像のセットに最適なしきい値法を見つけることをお勧めします。メソッドを選択したら、すべての画像に適用する必要があります。
    7. チャンネル 2(488 nm)のステップ 6.1.6 を繰り返します。
    8. [プロセス] をクリックして 405:488 nm の比率を視覚化する比率イメージを作成| 画像計算機。ダイアログボックスで、 イメージ1:チャンネル1、操作:分割、画像2:チャンネル2、新しいウィンドウの作成、すべての画像を処理を選択します。
    9. 比率画像の 参照テーブル を 疑似色に変更します。たとえば、 Fire に変更するには、[ イメージ] をクリック|参照テーブルの|火。
  2. 画像解析
    1. 比率画像上で、個々の細胞またはミトコンドリアの周りにROIを描きます。各 ROI を描画した後、 ROI マネージャに追加します。 |を分析するツール|ROI マネージャー |追加します。(キーボード ショートカット: 'T')[ すべて表示] を選択します。
      注: ステップ 6.1.6 および 6.1.7 では、背景ピクセルが「数値ではない」(NaN)に設定されているため、測定結果には影響しません。したがって、ROI に背景ピクセルを含めることができます。
    2. ROI マネージャをクリックして個々のセルの 405:488 の比率 を測定| ctrl+A を押して、すべての ROI を選択|その他の|マルチメジャー。ダイアログ ボックスで、[ すべてのスライスを測定する ] と [スライス ごとに 1 行] を選択します。
    3. 測定値をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
    4. 405 nm のイメージを選択します。ステップ 6.2.2 で示したように、すべての ROI の強度を測定します。ROI マネージャに格納されている ROI を使用します。
    5. 測定値をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
    6. 488 nm のイメージを選択します。ステップ 6.2.2 のとおりに、すべての ROI の強度を測定します。ROI マネージャに格納されている ROI を使用します。
    7. 測定値をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
    8. ROI マネージャをクリックして、後で参照するために ROI を保存| ctrl+A を押して、すべての ROI を選択|その他の|保存します。
    9. 推奨: 405 および 488 nm トレースの強度と時間のプロットを生成します。どちらのチャンネルにもマークされた漂白が存在しない(イメージングシリーズの最後の信号強度は最初の画像の98%≥)、センサー応答中に2つのトレースが反対方向に移動することを確認します(例えば、48 nm8トレースが減少するはずですが、酸化中に405 nmのトレースが増加するはずです)。
  3. データの正規化
    1. 比率画像からのROIごとに、DA処理時の最大値(Rmax)とDTT処理中の最小値(Rmin)を決定します。
    2. 正規化比率を次のように計算します。
      figure-protocol-1
      注: 最大比率を 1.0 に、最小比率を 0 に設定します。
  4. ミトコンドリア形態の解析
    1. ステップ 6.2.6 で roGFP 強度と並行してミトコンドリア形態の測定値を取得するには、分析 |[寸法]を設定し、[シェイプ記述子]および[楕円をフィット]をオンにします。
      注: 平均強度に加えて、 結果 ウィンドウの測定値には、長軸の長さ(主軸)、短軸の長さ(Minor)、アスペクト比(AR;長軸を短軸で割った軸)、丸いミトコンドリアはAR〜1、細長いミトコンドリアはARが大きくなり、円形(Circ.)と丸み(ラウンド)の測定が含まれます。

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結果

成長因子離脱後の定常ミトコンドリア酸化還元状態の違いの定量化
ミトコンドリア酸化還元状態における定常状態差の定量化を実証するために、標準培地で増殖した一次ニューロンを、イメージング前に48時間の成長因子なしで培養したニューロンと比較した。成長因子離脱は、72 h16後のアポトーシス神経細胞死をもたらす。細胞を48時間後に画像化し、これがミトコンドリア酸化還元状態の変化によって先行しているかどうかを試験した。ポリL-オルニチンコーティングカバーリップ上に成長した原発ラット皮質ニューロンは、 インビトロ 6(DIV6)の日にrAAV-mito-Grx1-roGFP2に感染し、DIV12で画像化された。ライブイメージングは、40x/1.10の水浸し目的を備えた反転レーザー走査共焦点顕微鏡上で、このプロトコルのセクション4に従って室温で行った。コンフォーカル設定は、ピンホール7風通しユニット、ピクセルサイズ568.7 nm(512 x 512ピクセル)、スキャン速度600Hz、レーザーパワー405 nm 3%、レーザーパワー488 nm 1...

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ディスカッション

ミトコンドリアレドックス状態の定量的および動的測定は、ミトコンドリアおよび細胞生理に関する重要な情報を提供する。活性酸素種「酸化ストレス」または「酸化ストレス」を検出するいくつかのフッ素化化学プローブが利用可能です。しかし、後者の用語は明確に定義されておらず、しばしば特異性9,17,18を欠いている。化学色素と比較して、Grx1-roGFP2は、励起比センサーとしていくつかの利点9、19:(i)、センサー発現レベル、絶対蛍光強度、および細胞またはオルガネラ密度に固有の正規化を提供します。(ii)遺伝的にコードされたプローブとして、小器官またはシナプス前末端または心内樹状脊椎などの特定の細胞内区画を標的とすることができる。(iii) センサーの遺伝的発現は、化学染料の場合は一次ニューロンにとってストレスになり得る染料の負荷の必要性を排除す...

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開示事項

著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

この作品はドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(BA 3679/5-1;3679/5-1;)2289の場合:BA 3679/4-2)。A.K.はエラスムス+フェローシップによってサポートされています。アイリス・ブンスリ=エーレット、リタ・ロズナー、アンドレア・シュリックサップの原発ニューロンの調製に感謝します。私たちは、pLPCX-ミト-Grx1-roGFP2を提供してくれたトビアス・ディック博士に感謝します。 図4 に示す実験は、ハイデルベルク大学ニコンイメージングセンターで行われました。 図2 は BioRender.com で調製した。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<強 >試薬 < / 強 >
塩化カルシウム (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306
ジアミド (DA)Sigma-AldrichD3648
ジチオスレイトール (DTT)Carl Roth GmbH6908.1
グルコース (2.5 M ストック溶液)Sigma-AldrichG8769
グルコースSigma-AldrichG7528
GlycineneoFroxx GmbHLC-4522.2
HEPES (1 M ストック溶液)Sigma-Aldrich15630-080
HEPESSigma-AldrichH4034
塩化マグネシウム (MgCl2·6H2O)Sigma-Aldrich442611-M
N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA)Sigma-AldrichM3262
塩化カリウム (KCl)Sigma-AldrichP3911
塩化ナトリウム (NaCl)neoFroxx GmbHLC-5932.1
ピルビン酸ナトリウム (0.1 M ストック溶液)Sigma-AldrichS8636
ピルビン酸ナトリウムSigma-AldrichP8574
ショ糖Carl Roth GmbH4621.1
テトラメチルローダミン エチルエステル過塩素酸塩 (TMRE)Sigma-Aldrich87917
equipment
imaging chamberLife Imaging Services (バーゼル、スイス)10920Ludin チャンバー タイプ 3 用 &オスラッシュ;12mmカバースリップ
レーザー走査型共焦点顕微鏡、顕微鏡カDMI6000
レーザー走査型共焦点顕微鏡、走査ユニットライカSP8
蠕動ポンプVWRPP1080 181-4001
ディスク共焦点顕微鏡、カメラ浜松C9100-02EMCCD
回転ディスク共焦点顕微鏡、インキュベーションシステムTokaiHitINU-ZILCF-F1
スピニングディスク共焦点顕微鏡、顕微鏡ニコンTi顕微鏡
スピニングディスク共焦点顕微鏡、スキャニングユニット川CSU-X1
software
FIJIhttps://fiji.sc
StackReg プラグイン
TurboReg プラグインhttps://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java
ライ回転、 横https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java

参考文献

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