ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。
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この記事について
サマリー
要約
脳内の特定のシナプスの生理学的特性と、それらがどのように可塑性変化を受けるかを研究することは、現代の神経科学における重要な課題です。従来の in vitro 電気生理学的手法は、電気刺激を使用してシナプス伝達を誘発します。この方法の主な欠点は、その非特異的な性質です。刺激電極の領域内のすべての軸索が活性化され、効果を特定の求心性結合に帰することを困難にする。この問題は、電気刺激を光遺伝学ベースの刺激に置き換えることで克服できます。オプトジェネティクスと in vitro パッチクランプ記録を組み合わせる方法について説明します。これは、解剖学的に定義された正確なシナプス接続の基礎シナプス伝達とシナプス可塑性の両方を研究するための強力なツールであり、脳内のほぼすべての経路に適用できます。ここでは、げっ歯類脳の目的のシナプス前領域(内側前頭前野)への外科的注射のためのチャネルロドプシンタンパク質をコードするウイルスベクターの調製と取り扱い、および下流の標的領域(外側嗅内皮質)の急性スライスの作成について説明します。パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、短期および長期のシナプス可塑性を研究するための詳細な手順も提示されます。光遺伝学とCre依存性細胞標識を組み合わせることで経路特異性や細胞特異性を実現する実験例について議論する。最後に、目的のシナプス前領域の組織学的確認は、シナプス後細胞のビオシチン標識と共に記載され、正確な位置および細胞型のさらなる同定を可能にする。
概要
シナプスの生理機能や可塑性変化を理解することは、健康な脳1で脳ネットワークがどのように機能し、脳障害でどのように機能不全になるかを理解するための基本です。急性 ex vivo 脳スライスの使用は、全細胞パッチクランプ記録を使用して、高い信号対雑音比で単一ニューロンからのシナプスの電気的活動の記録を可能にする。膜電位の制御と簡単な薬理学的操作により、受容体サブタイプの単離が可能になります。これらの記録は、層流および亜領域位置2、細胞形態3、分子マーカーの存在4、その求心性突起5、または最近活動的であった場合でも、シナプス後ニューロンを識別するための絶妙な特異性で行うことができます6。
しかし、シナプス前入力の特異性を達成することは、やや困難です。従来の方法では、刺激電極を使用して、特定の椎弓板を走る軸索を励起していました。この例は海馬で、放射状層の局所刺激がCA3からCA1サブフィールド7に投射するシナプスを活性化します。この場合、シナプス前特異性は、CA3入力がCA1錐体細胞8に突....
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プロトコル
すべての動物の手順は、英国動物科学手順法(1986)および関連するガイドライン、および地域の機関ガイドラインに従って実施されました。
1.脳定位固定装置ウイルス注射
注:現在のプロトコルでは、解剖学的ですが、シナプス後細胞型の特異性は必要ありません。
- 適切な動物を選択してください。このプロトコルでは、雄の野生型リスターフード付きラットが使用されました(300〜350 g、約3か月齢)。
- 適切なウイルス構築物を選択してください。考慮すべきいくつかの要因があります(「ディスカッション」を参照)。現在のプロトコルでは、ウイルスを使用して光遺伝学的チャネルChETATC 12を発現し、興奮性ニューロン(AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry;力価:3.3 x 10 13ウイルスゲノム/ mL)を形質導入します。
- 前述のように、脳アトラスを使用して注射の座標と量を確立します35。
- ウイルス製剤の定位固定装置注射
注:動物の使用と世話に関するすべての関連する国および機関....
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結果
このプロトコルでは、光遺伝学的構築物のウイルス送達を使用して、長距離シナプス生理学と可塑性を研究する方法について説明します。このプロトコルは、脳内のほぼすべての長距離接続の研究に非常に簡単に適応できます。一例として、ラットmPFCへのオプシンをコードするAAVの注入、LECからの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびLECにおけるmPFC末端の光誘発活性化について説明します(図1)。
健康な錐体細胞が位置し、パッチを当てた(例えば、図3A)。本mPFCからLECの例では、シナプス後細胞は標識されていなかった。シナプス後細胞の同定が必要な場合は、蛍光マーカーを発現する細胞を広視野光学系を用いて局在化させる必要があります(例:図3B)。細胞の健康状態は、実験の前に赤外線光学系によって評価する必要があります。LECのmPFC軸索を活性化するために、顕微鏡対物レン.......
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ディスカッション
ここで紹介するプロトコルは、光遺伝学的構築物をコードするAAVを送達する定位固定手術と急性脳スライスにおける電気生理学の組み合わせを使用して、高度に特異的な長距離シナプス投影を探索する方法を説明しています(図1)。これらの技術を組み合わせることで、従来の非特異的な電気刺激ではアクセスできなかった長距離および解剖学的に拡散した経路において、脳回路の生理学と可塑性を高精度で特徴付けるツールが提供されます。細胞特異的分子マーカーとの組み合わせは、ある脳領域から別の領域23における異なる規定された細胞集団への投影の特徴付けを可能にする。
この手法の高精度性を最大限に活かすためには、経路特異性の検証が不可欠です。これはいくつかのステップで行われます。記録中に、調査中のシナプスがモノシナプスであることを確認します(ステップ3.3.5)。これに続いて、注射部位を組織学的に調べて、ウイルスが目的のシナプス前領域に限定されていることを確認し、バイオシチン染色されたシナプス後細胞の位置と形態を評.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この作業は、Wellcome grant 206401/Z/17/Zによってサポートされています。Zafar Bashir 氏の専門家による指導と、技術支援と原稿へのコメントを提供してくれた Clair Booth 博士に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.2 mLチューブ | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 & micro;Lピペット | ギルソン | FD10001 | |
| 24ウェルプレート | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3ウェイルアーバルブ | コールパーマー | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)基質 | ベクターラボラトリーズ | SK-4105 | |
| 40倍対物レンズ | オリンパス | LUMPLFLN40XW | |
| 4-アミノピリジン | Hello Bio | HB1073 | |
| 4倍対物レンズ | オリンパス | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | ウイルス力価: 3.3x1013 GC/ml |
| アクロマティックレンズ | エドモンド・オプティクス | 49363 | 視覚スペクトルと近赤外 |
| 卓上型微量遠心機 | ベンチマーク・サイエンティフィック | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| ホウケイ酸ガラス キャピラリー | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | ファイン サイエンス ツール | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| カメラ - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| クロルヘキシジン外科用スクラブ | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC スーパー 2 速 取り外し可能なブレード クリッパー |
| コリメーション コンデンサー レンズ | ThorLabs | ACL2520-A | |
| カバースリップ | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| クライオスタット | ライカ | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| シアノアクリレート接着剤 | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| データ収集デバイス | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-グルコース | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ダイクロイックミラー 500 nm ロングパス | Edmund Optics | 69899 | |
| ダイクロイックミラー 600 nm ロングパス | エドモンド・オプティクス | 69901 | |
| ダイクロイックミラーキューブ | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | ミルポア | 324626 | |
| サイドポート付き電極ホルダー | HEKA | 895150 | |
| 蛍光フィルター | Chroma | 59022m | |
| 励起フィルター | Chroma | ET570/20x | |
| アイジェル | Dechra | Lubrithal | |
| ファインペイントブラシ | 科学研究所用品 | BRU2052 | |
| ギロチン | ワールド精密機器 | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 過酸化水素溶液 | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| イソフルラン | ヘンリー・シャイン | 988-3245 | |
| イソペンタン | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-グルコン酸 | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| キネマティック蛍光フィルターキューブ | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LEDドライバー | ThorLabs | LEDD1B | |
| リドカイン軟膏 | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| マイクロドリル | ハーバード装置 | 75-1887 | |
| マイクロ電極プーラー | サッター機器 | P-87 | |
| マイクロインジェクションシリンジ | ハミルトン | 7634-01/00 | |
| マイクロインジェクションシリンジニードル | ハミルトン | 7803-05 | カスタム仕様:ゲージ33、長さ15mm、ポイントスタイル4 - 12° |
| マイクロインジェクションシリンジポンプ | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| 取り付け 青色LED | ThorLabs | M470L5 | |
| 取り付け 緑色LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550スライスの屈折IRイメージングに使用され、微分干渉コントラスト(DIC)光学系は、別の一般的に使用される方法です | |
| OCT媒体 | VWRインターナショナル | RAYLLAMB / OCT | 最適切断温度媒体 |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| パッチクランプ増幅器 | 分子デバイス | 700A | |
| 蠕動ポンプ | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| 脳定位固定装置フレーム | Kopf | Model 902 | |
| マイクロドリル用脳定位固定装置ホルダー | ハーバード大学装置 | 75-1874 | |
| スクロース | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| 手術用顕微鏡 | カールツァイス | OPMI 1 FR プロ | |
| 縫合 | エチコン | W577H | |
| 細胞内記録用シリンジフィルター溶液 | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| クエン酸テトロドトキシン | Hello Bio | HB1035 | |
| トランスファーピペット | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 正立蛍光顕微鏡 | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD DAPI付き退色防止封入剤 | ベクターラボラトリーズ | H-1200-10 | |
| ベクタステイン ABC-HRPキット | ベクターラボラトリーズ | PK-4000 | |
| ブラート | カムデンインスツルメンツ | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ バージョン2.32 | データ収集ソフトウェア | |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| ショ糖切断液 | |||
| PFA | |||
| 細胞内? |
参考文献
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nico....
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