エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

サマリー

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。

要約

脳内の特定のシナプスの生理学的特性と、それらがどのように可塑性変化を受けるかを研究することは、現代の神経科学における重要な課題です。従来の in vitro 電気生理学的手法は、電気刺激を使用してシナプス伝達を誘発します。この方法の主な欠点は、その非特異的な性質です。刺激電極の領域内のすべての軸索が活性化され、効果を特定の求心性結合に帰することを困難にする。この問題は、電気刺激を光遺伝学ベースの刺激に置き換えることで克服できます。オプトジェネティクスと in vitro パッチクランプ記録を組み合わせる方法について説明します。これは、解剖学的に定義された正確なシナプス接続の基礎シナプス伝達とシナプス可塑性の両方を研究するための強力なツールであり、脳内のほぼすべての経路に適用できます。ここでは、げっ歯類脳の目的のシナプス前領域(内側前頭前野)への外科的注射のためのチャネルロドプシンタンパク質をコードするウイルスベクターの調製と取り扱い、および下流の標的領域(外側嗅内皮質)の急性スライスの作成について説明します。パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、短期および長期のシナプス可塑性を研究するための詳細な手順も提示されます。光遺伝学とCre依存性細胞標識を組み合わせることで経路特異性や細胞特異性を実現する実験例について議論する。最後に、目的のシナプス前領域の組織学的確認は、シナプス後細胞のビオシチン標識と共に記載され、正確な位置および細胞型のさらなる同定を可能にする。

概要

シナプスの生理機能や可塑性変化を理解することは^、健康な脳1で脳ネットワークがどのように機能し、脳障害でどのように機能不全になるかを理解するための基本です。急性 ex vivo 脳スライスの使用は、全細胞パッチクランプ記録を使用して、高い信号対雑音比で単一ニューロンからのシナプスの電気的活動の記録を可能にする。膜電位の制御と簡単な薬理学的操作により、受容体サブタイプの単離が可能になります。これらの記録は、層流および亜領域位置²、細胞形態³、分子マーカー^の存在4、その求心性突起⁵、または最近活動的であった場合でも^、シナプス後ニューロンを識別するための絶妙な特異性で行うことができます6。

しかし、シナプス前入力の特異性を達成することは、やや困難です。従来の方法では、刺激電極を使用して、特定の椎弓板を走る軸索を励起していました。この例は海馬で、放射状層の局所刺激がCA3からCA1サブフィールド⁷に投射するシナプスを活性化します。この場合、シナプス前特異性は、CA3入力がCA1錐体細胞⁸に突出する放射状層内に位置する唯一の興奮性入力を表すため、達成される。しかし、CA3-CA1軸索の従来の電気的シナプス前活性化で達成可能なこの高度な入力特異性は、このシナプスが受けてきた熱心な研究に反映されている例外です。他の脳領域では、複数の求心性経路からの軸索が同じ椎弓板、たとえば新皮質⁹の層1に共存しているため、従来の刺激電極では入力特異的なシナプス前刺激が不可能になります。異なるシナプス入力が異なる生理学的特性を有する可能性があるため、これは問題である。したがって、それらの共刺激はシナプス生理学の誤った特徴付けにつながる可能性があります。

チャネルロドプシン-2(ChR2)などの感光性膜タンパク質(オプシン)の遺伝的コードであるオプトジェネティクスの出現により、脳領域間の孤立したシナプス投影を研究する可能性が大幅に拡大しました^10,11。ここでは、長距離シナプス生理学と可塑性を研究するための一般化可能で低コストのソリューションについて説明します。光遺伝学的構築物は、ウイルスベクターを使用して非常に特異的な方法で送達され、目的のシナプス前領域の非常に正確な制御を可能にします。遠心性突起は、ターゲット領域でこれらの繊維の活性化を可能にする光活性化チャネルを表現します。したがって、従来の非特異的な電気刺激では独立して活性化できない長距離の解剖学的に拡散した経路を研究することができます。

我々は、経路の例として、興奮性陽イオンチャネルオプシンをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)による内側前頭前野(mPFC)の形質導入について説明する。次に、外側嗅内皮質(LEC)からの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびグルタミン酸作動性mPFC-LEC突起の光誘発活性化について説明します(図1)。また、シナプス前関心領域の位置を確認するための注射部位の組織学的評価とシナプス後細胞の形態の同定についても説明します。

プロトコル

すべての動物の手順は、英国動物科学手順法(1986)および関連するガイドライン、および地域の機関ガイドラインに従って実施されました。

1.脳定位固定装置ウイルス注射

注:現在のプロトコルでは、解剖学的ですが、シナプス後細胞型の特異性は必要ありません。

1. 適切な動物を選択してください。このプロトコルでは、雄の野生型リスターフード付きラットが使用されました(300〜350 g、約3か月齢)。
2. 適切なウイルス構築物を選択してください。考慮すべきいくつかの要因があります(「ディスカッション」を参照)。現在のプロトコルでは、ウイルスを使用して光遺伝学的チャネルChETA_TC 12を発現し、興奮性ニューロン(AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry;力価:3.3 x 10 ¹³ウイルスゲノム/ mL)を形質導入します。
3. 前述のように、脳アトラスを使用して注射の座標と量を確立します³⁵。
4. ウイルス製剤の定位固定装置注射
   注:動物の使用と世話に関するすべての関連する国および機関のガイドラインに従う必要があります。ウイルスベクターは、前述のように定位固定性に注入されます。¹³ 以下の変更を行います。
   1. 動物の麻酔および調製中は、ウイルス調製物を氷上に保管してください。
   2. 4%イソフルランを含む麻酔導入室で麻酔を誘発する。通常の呼吸数(1 Hz)が遅く、ペダル反射と角膜反射がないことで示される麻酔レベルを監視します(つま先をつまんで目の隅に軽く触れてテストしますが、反応は検出されません)。
   3. 侵襲的処置の少なくとも30分前にメロキシカムなどの術前鎮痛薬を投与する。
   4. 動物が完全に麻酔をかけられたら、バリカンを使用して頭皮から毛皮を取り除きます。イソフルランの流れを脳定位固定装置フレームのノーズコーンに切り替え、ラットをフレームに取り付けます。処置中の乾燥を防ぐために、潤滑アイジェルを目に塗ります。
   5. 手術は無菌状態で行う必要があります。手順全体を通して滅菌手袋と器具を使用してください。4%w / vクロルヘキシジン溶液で頭皮を消毒する前に、リドカイン軟膏(5%w / w)を塗布してから、滅菌ドレープで体を覆います。メスを使用して、頭皮の長さ約15 mmの縦切開を行い、ブレグマを露出させます。
   6. ハミルトンシリンジを、定位固定装置フレームに取り付けられた可動アームに取り付けられたマイクロインジェクションシリンジポンプにロードします。
   7. 5 μLのウイルスアリコートを0.2 mLチューブに入れ、すべての容量がチューブの底に入るまで数秒間回転させます。2μLのウイルス製剤をチューブの蓋にピペットで入れます。
   8. 最初に手術用顕微鏡で針先を見てシリンジにウイルス製剤を満たし、次にウイルスのボーラスを針の先端に手動で置き、ポンプコントロールを使用してシリンジプランジャーを引き出します。
   9. ポンプ注入量を300nL、流量を100nL/minに設定します。ポンプを作動させ、針先のウイルスの飛沫を観察して適切な流れを確認します。綿棒でウイルスを吸収し、70%エタノールで針をやさしくきれいにします。
   10. 脳定位固定装置フレームのアジャスターネジを使用して、針先をブレグマ(冠状縫合糸と矢状縫合糸が出会う頭蓋骨上のポイント)に移動し、フレームの3つのバーニアスケールで観察された定位固定装置測定値をメモします。ラットmPFCのブレグマに対する座標は、前後+ 3.1 mm、中外側±0.7 mm、背腹側 - 4.5 mmです。ブレグマ座標からこれらの距離を(示されているように)加算/減算し、針を前後および中外側座標に移動し、針を頭蓋骨表面に静かに下げます。
       注:上記のmPFC座標は、300〜350gのオスのリスターフード付きラットに適しています。ラット系統の変化、大きさは、これらの座標への変更を必要とする可能性がある( 考察を参照されたい)。
   11. 針を頭蓋骨の表面から持ち上げ、細い先端の永久マーカーペンでこのポイントに印を付けます。この時点で、脳定位固定装置アームに取り付けられたマイクロドリルを使用してバリ穴を開けます。
   12. 事前に決定された背腹座標で脳に針を挿入し、事前に決定された容量(mPFCの場合:300 nL)を注入します。ボーラスの拡散を可能にするために、針を その場で 10分間放置します。針を取り外したら、ポンプを動かして針が詰まっていないことを確認します。
       注意: 針をゆっくりと(~3 mm / min)挿入および取り外して、脳組織への損傷と針管へのウイルスの逆流を最小限に抑えます。
   13. 加温した塩化ナトリウム(0.9%w / v)とグルコース(5%w / v)溶液2.5 mLを皮下投与して、水分補給を維持します。.
   14. 手順 1.4.12 を繰り返します。第二半球のために。
   15. 頭皮切開を縫合し、手順が完了したら、2.5 mLの塩化ナトリウムとブドウ糖溶液、および疼痛管理のための適切な制度的に推奨される鎮痛薬、例えばブプレノルフィンまたはメロキシカムを投与します。.意識不明の間、動物を放置しないでください。完全に意識を取り戻すまで、ラットを加熱された回復ボックスに入れます。完全に回復したら、他の動物と一緒に家のケージに戻ってください。
   16. ウイルストランスフェクトされたげっ歯類の術後ケアおよび収容手順に関する施設ガイドラインに従ってください。.実験を開始する前に、オプシン導入遺伝子が適切に発現するまで少なくとも2週間待ちます。
       注:形質導入に必要な時間は、シナプス前領域とシナプス後領域間の接続の距離と強度に依存します。mPFCからLECの場合、4〜6週間かかります。

2.急性脳スライスの調製

注:ここでは、成体のマウスおよびラットから高品質の皮質、海馬、および視床スライスを達成するのに十分な脳スライスを調製するための簡単な方法について説明します。

1. 解剖用の溶液を準備します。
   1. 250 mL ビーカーに、25 °Cで抵抗率 18.2 MΩ cm の超純水 (UPW) で製造された ~200 mL の氷冷スクロース切断溶液 (189 mM スクロース、26 mM NaHCO 3、10 mM D-グルコース、5 mM MgSO₄、₃ mM KCl、1.25 mM NaH 2 PO₄、および 0.2 mM CaCl₂) またはビブラトーム組織チャンバーを満たすのに十分な容量で充填します。 カルボゲン(95%O 2、5%CO₂)で泡立て、氷上に保ちます。
   2. スライス収集チャンバーに人工脳脊髄液(aCSF;124 mM NaCl、26 mM NaHCO 3、10 mM D-グルコース、₃ mM KCl、2 mM CaCl 2、1.25 mM NaH₂PO 4、および1 mM MgSO₄ UPW製)を室温で満たし、カルボゲンで泡立てます。スライス収集チャンバ¹⁴は、ナイロンメッシュのシート上に接着されたマイクロ遠心チューブラックからカスタムメイドされ、aCSFに沈められたビーカーに入れられる(図2A)。
   3. 50 mL チューブにリン酸バッファー (PB; 75.4 mM Na 2 HPO 4.7H₂O および 24.6 mM NaH₂PO 4) 中の₄% パラホルムアルデヒド (PFA) を満たします。H₂O)。
      注意: PFAは有毒です。ドラフトで使用します。
2. 脳の解剖。
   1. 呼吸が遅く規則的になるまで、5%イソフルランを使用して誘導チャンバーでラットを麻酔します(~1 Hz)。ペダル反射と角膜反射がないことについて十分なレベルの麻酔試験を確保するため。
   2. ギロチンを使用して動物を斬首します。
   3. 前述のように脳全体を速やかに解剖し¹⁵、ショ糖切断液に移す。断頭から90秒以内にステップを完了して、良好なスライス品質と全細胞記録の成功を実現します。
   4. 金属製のティースプーンを使用して、脳を拾い上げ、余分な切断液を捨て、ベンチトップのろ紙の上に置きます。
   5. メスまたはかみそりの刃を使用して、小脳をすばやく取り除き、冠状平面の大脳をその長さのほぼ半分まで切断します。後半分はLEC組織ブロックです。次のステップのためにスライスする領域に加えて、必ず余分な組織を含めてください。この組織ブロックと脳の残りの部分の両方をショ糖切断溶液に戻します。
   6. シアノアクリレート接着剤を一滴ビブラト組織ステージに置きます。前のステップで作成したティッシュブロックよりわずかに大きい面積の薄層に広げます。
   7. 小さじ1杯を使用してLEC組織ブロックをピックアップし、余分な溶液を廃棄し、前冠状切片が付着するように接着剤パッチに移します。
   8. ステージをビブラトーム組織チャンバーに設置し、組織を沈めるのに十分な量のスクロース切断溶液を素早く注ぎます。この溶液をカルボゲンで泡立てます。LEC組織ブロックを腹面でブレードに向けます。周囲の部屋の照明はオプシンをアクティブにするには不十分ですが、ビブラトームに存在する可能性のある追加の光源の使用は避けてください。
   9. 高いブレード振動速度(100 Hz)と遅いブレード前進速度(0.06 mm/s)を使用して、腹側から背側までの厚さ350 μmのスライスを切断します。典型的には、半球当たり7つのLECスライスを得ることができる。
   10. スライスをスライス収集チャンバーに移します。スライス採取が完了したら、回収チャンバーを34°Cの水浴に1時間移してから室温に戻します。カルボゲンで連続的に泡立てます。スライスは、少なくとも6時間記録するのに十分健康です。
   11. 注射部位の事後検査のために、脳の残りの部分をPFAに48時間入れます(セクション4を参照)。

3. 電気生理学と光遺伝学的刺激

1. 標的細胞の同定。
   1. スライスを34°Cの水中記録チャンバーに入れ、蠕動ポンプで2 mL/minの速度でaCSFを灌流します。スライスアンカーを使用してスライスを固定します。
   2. 斜め赤外線照明を使用した広視野顕微鏡の低倍率(4倍)対物レンズの下で、LECレイヤー5に移動します。パイアル表面から必要な層までの距離を測定します。
      注意: 斜め赤外線照明は、記録チャンバーカバースリップの約3 mm下に近赤外線LEDをカバースリップの平面に対して~55°の角度で配置することによって実現されました(図2B)。微分干渉コントラストは、スライス電気生理学のための代替的で一般的に使用されるイメージング技術です。
   3. 高倍率の水浸対物レンズ(40倍)に変更し、錐体ニューロンを特定します。コンピュータモニタ上のセルの位置をテープでマークします。
      注:錐体ニューロンはほぼ三角形の形態をしており、スライスのパイアル表面に向かって突出した顕著な頂端樹状突起があります(図3A)。細胞の健康状態は、凝縮した目に見える核がないことと、滑らかに見えるはずの原形質膜の検査によって評価できます。広視野蛍光顕微鏡を使用した場合、オプシン-フルオロフォア融合タンパク質による軸索の明確な蛍光標識が見られる可能性は低いです。軸索投影を可視化するには、オプシンの蛍光色素に対する一次抗体を用いて免疫組織化学事後処理を行い、同波長または類似の波長の蛍光色素に結合した二次抗体を用いて増幅します。
2. 全細胞パッチクランプの形成。
   1. ピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスマイクロピペットを作製し、ろ過した細胞内記録溶液(120 mM k-グルコン酸塩、40 mM HEPES、10 mM KCl、2 mM NaCl、2 mM MgATP、1 mM MgCl、0.3 mM NaGTP、0.2 mM EGTA、およびUPW製0.25%バイオシチン、pH 7.25、285-300 mOsm)を充填します。充填されたマイクロピペットをパッチクランプアンプヘッドステージの電極ホルダーに配置し、電極ワイヤーが細胞内溶液と接触していることを確認します。
   2. チューブで電極ホルダーのサイドポートに接続されたマウスピース(プランジャーを取り外した1 mLシリンジなど)に強く吹き込んで口から陽圧をかけ、インライン三方弁を閉じて圧力を維持します。メニスカスが形成されるように顕微鏡の対物レンズを持ち上げ、顕微鏡で見ることができるまで電極をメニスカスに挿入します。
   3. WinLTP¹⁶(または他のアクイジション・ソフトウェア/オシロスコープ)でシール・テスト・ウィンドウを開き、アンプを電圧クランプ・モードにして5mVの矩形パルスを印加し、ピペット抵抗が3〜6MΩかどうかを判定します。
   4. ピペットチップで識別されたセルに近づき、触れます。これにより、細胞膜にくぼみが生じ(図3A、右パネル)、ピペット抵抗がわずかに増加します(0.1MΩ)。
   5. マウスピースに適度な吸引を加えることにより、陽圧を解放し、負圧を適用します。これにより、ピペット抵抗が大幅に増加するはずです(>1000MΩ)。圧力を中立のままにすることができます。細胞膜が破裂してセル全体の静電容量トランジェントが発生するまで、徐々に増加するランプで負圧を適用します。
3. 光遺伝学的に誘発されたシナプスイベントを記録します。
   1. 電流クランプ構成を入力します。
      注:ほとんどの場合、長距離シナプス伝達はグルタミン酸作動性であるため、塩化物反転電位に近い膜電位で記録すると、AMPA受容体(AMPAR)を介した伝達を最もよく分離し、誘発されるフィードフォワード阻害(FFI)の測定を最小限に抑えます。塩化物反転は、細胞内記録溶液およびaCSFの組成に依存し、ゴールドマン-ホジキン-カッツ方程式を使用して計算できます。上記のソリューションでは、これは-61.3mVでした。第5層LEC錐体ニューロンの平均静止膜電位は-62mVであり、必要に応じて、定電流の注入によってこの電位に維持された。あるいは、セルを所望の電位に電圧クランプすることができる。長距離抑制投影¹⁶ を記録するか、FFIを記録するために、GABA作動性塩化物コンダクタンスを分離するために陽イオン反転電位で電圧クランプする。活動電位閾値を超える膜電位でニューロンを電圧クランプする場合、電位依存性ナトリウムチャネル遮断薬を含むセシウムベースの細胞内溶液を使用して、電圧クランプを改善し、活動電位の開始を防ぎます(130 mM CsMeSO 4、10 mM HEPES、8 mM NaCl、5 mM QX 314塩化物、₄ mM MgATP、0.5 mM EGTA、0.3 mM NaGTP、0.25%バイオシチンはUPWで製造され、 pH 7.25, 285-300 mOsm)。
   2. データ・アクイジション・ソフトウェアを使用して、トランジスタ-トランジスタ・ロジック(TTL)信号をLEDドライバに送信し、実装された470nmLEDをアクティブにします。取り付けられたLEDは、フィルターキューブと適切な光学系(図2B)を使用して顕微鏡の光路に向けられ、40倍の対物レンズ を介して スライスに光パルスを適用し、光遺伝学的興奮性シナプス後電位(oEPSP)を誘発します。
      注:光パルスは、樹状突起上/樹状突起上に適用することができ、軸索およびシナプス前ブトンのオプシンの活性化をもたらすか、研究者は、過剰ブートン刺激を避けるために、記録された細胞から軸索に対物レンズを移動させることができます( ディスカッションを参照)。最大oEPSP振幅は、シナプス投射の強さ、ウイルス注射の有効性、および使用されるオプシンに依存します。oEPSPは、光強度および/または持続時間を変化させることによって所望の振幅に滴定することができる¹⁸;光パルスの持続時間を変えると(最大LED出力で0.2〜5ミリ秒の典型的な持続時間、その結果、4.4mW / mmの光密度¹⁹になります)、LEDの電力出力を変更するよりも一貫したoEPSP振幅が得られます。
   3. 異なる刺激間間隔を持つ複数の光パルスの列を送達することにより、シナプス前放出特性(電圧の変化)を調査します(図3E)。光遺伝学的に誘発された伝播を解釈する際には注意が必要です( 議論を参照)。
   4. ^oEPSPs19を繰り返し誘発するか、配位子を適用することにより、長期的な可塑性を調査します。可塑性誘導前の安定性を確保するためにoEPSP振幅を5〜10分間監視し、安定した振幅に達するまで監視します(通常は30〜40分)。
      注:現在のほとんどのオプシンは、LTPを誘導するために通常使用されるように、100Hzで配信される100刺激など、高周波で複数の活動電位を確実に呼び出すことができません。
   5. oEPSPがモノシナプスであることを確認するには、樹状突起アーバー上に対物レンズを配置し、0.5 μMテトロドトキシンおよび100 μMアミノピリジンの存在下で刺激することにより、形質導入経路のオーバーブートン活性化を実行します。応答が活動電位依存性である場合、テトロドトキシンの適用は伝達を廃止し、その後のアミノピリジンの包含は、oEPSPがモノシナプス的に生成される場合、伝達を部分的に回復させる^19,20。
   6. バイオシチンがニューロンを満たすことを可能にするために、全細胞構成に入った後少なくとも15分間待つ。電圧クランプでは、膜の容量と入力抵抗を監視します。
   7. 細胞体細胞から離れるアプローチ角度に沿ってピペットをゆっくりと引き出し、細胞膜の再シールとピペットチップでのアウトサイドアウトパッチの形成を示す静電容量トランジェントと膜電流のゆっくりとした消失を観察します。スライスの向きとスライス内のセルの位置に注意してください。スライスを24ウェルプレートのPFAに入れ、4°Cで一晩インキュベートした後、0.1 M PBに移します。
      注:スライスは最大1週間保存できます。より長い保管が必要な場合は、PBを定期的に交換するか、アジ化ナトリウム(アジ化ナトリウムの0.02%〜0.2%)を含むPBを使用してください。.

4.組織学

1. スライス注入部位
   1. 固定後、組織が沈むまで(最初はスクロース溶液に浮遊する)、通常は室温で一晩、または4°Cで24〜48時間、PB中の30%スクロース(w / v)で組織を凍結保護します。
   2. 最適な切断温度(OCT)培地を使用して、組織のブロックをクライオスタット試料ディスクに取り付けます。手順4.1.3から4.1.4に従ってティッシュブロックを凍結します。
   3. イソペンタンを適切な容器に入れます。標本ディスクだけを沈め、組織がイソペンタンのレベルより上にあることを確認します。イソペンタンの容器を液体窒素(またはドライアイス)に下げ、組織を凍結させます。
   4. 完全に凍結したら(組織ブロック全体が青白く硬くなる)、組織ブロックをクライオスタットチャンバー内の-20°Cで30分間放置し、ブロックの温度を平衡化させます。
   5. 厚さ40 μmの切片をクライオスタットで-20°Cで切断します。 細かい絵筆を使用して、セクションをブレードから外します。凍結切片を室温、ポリL-リジンコーティング、ガラス顕微鏡スライドに接着し、スライドを切片に触れます。
   6. 各スライドに約150 μLの封入剤を加え、カバーガラスで覆います。カバーガラスを軽く押して気泡を取り除きます。光退色から保護するためにスライドを覆い、室温で少なくとも12時間(または一晩)風乾します。蛍光顕微鏡を用いて、ウイルス注入部位の位置を調べる。
2. バイオシチン染色プロトコル
   注:このプロトコルは厚いセクションに適用できます。スライスを再セクション化する必要はありません。
   1. 脳スライスをリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、および1.8 mM KH₂PO₄)で6回、1回の洗浄で10分間洗浄します。トランスファーピペットを使用して、各ステップの後にウェルを空にします。
   2. スライスをPBS中の3%H 2 O₂(w / v)中で30分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。これにより、酸素の泡が発生します。
   3. 脳スライスをPBSで6回、洗浄ごとに10分間、または酸素の泡が見えなくなるまで洗浄します。脳スライスを、0.1%(v/v)Triton X-100を含むPBS中の1%(v/v)アビジンビオチン化HRP複合体(ABC)溶液中で室温で3時間インキュベートします。
   4. 脳スライスをPBSで6回、洗浄ごとに10分間洗浄します。
   5. ニューロン構造のビオシチン染色が見えるようになるまで、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液で各スライスを数分間インキュベートします(約5〜10分かかります)。
      注意:DABは有毒です。ドラフトで使用します。
      注:DABのインキュベーション時間は予測できない可能性があり、色が発達するにつれて組織を注意深く監視します。
   6. スライスを冷(4°C)PBSに移して反応を停止します。脳スライスをPBSで6回、洗浄ごとに10分間洗浄します。ブラシを使用して、脳スライスをポリL-リジンコーティングされたガラス顕微鏡スライドに取り付けます。
   7. きれいなティッシュで余分なPBSをすべて取り除きます。各スライスを約200 μLの封入剤で覆います。カバーガラスで覆い、カバーガラスを軽く押して気泡を押し出します。室温で少なくとも12時間(または一晩)風乾します。光学顕微鏡を使用して、細胞の位置と形態学的詳細を調べます。
      注:Biocytinは、蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用して視覚化することもできます。しかしながら、画像化は、切除または共焦点顕微鏡²¹の使用を必要とし得る。

結果

このプロトコルでは、光遺伝学的構築物のウイルス送達を使用して、長距離シナプス生理学と可塑性を研究する方法について説明します。このプロトコルは、脳内のほぼすべての長距離接続の研究に非常に簡単に適応できます。一例として、ラットmPFCへのオプシンをコードするAAVの注入、LECからの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびLECにおけるmPFC末端の光誘発活性化について説明します(図1)。

健康な錐体細胞が位置し、パッチを当てた(例えば、図3A)。本mPFCからLECの例では、シナプス後細胞は標識されていなかった。シナプス後細胞の同定が必要な場合は、蛍光マーカーを発現する細胞を広視野光学系を用いて局在化させる必要があります(例:図3B)。細胞の健康状態は、実験の前に赤外線光学系によって評価する必要があります。LECのmPFC軸索を活性化するために、顕微鏡対物レン...

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、光遺伝学的構築物をコードするAAVを送達する定位固定手術と急性脳スライスにおける電気生理学の組み合わせを使用して、高度に特異的な長距離シナプス投影を探索する方法を説明しています(図1)。これらの技術を組み合わせることで、従来の非特異的な電気刺激ではアクセスできなかった長距離および解剖学的に拡散した経路において、脳回路の生理学と可塑性を高精度で特徴付けるツールが提供されます。細胞特異的分子マーカーとの組み合わせは、ある脳領域から別の領域²³における異なる規定された細胞集団への投影の特徴付けを可能にする。

この手法の高精度性を最大限に活かすためには、経路特異性の検証が不可欠です。これはいくつかのステップで行われます。記録中に、調査中のシナプスがモノシナプスであることを確認します(ステップ3.3.5)。これに続いて、注射部位を組織学的に調べて、ウイルスが目的のシナプス前領域に限定されていることを確認し、バイオシチン染色されたシナプス後細胞の位置と形態を評...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 mLチューブ	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 & micro;Lピペット	ギルソン	FD10001
24ウェルプレート	SARSTEDT	83.3922
3ウェイルアーバルブ	コールパーマー	WZ-30600-02
3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)基質	ベクターラボラトリーズ	SK-4105
40倍対物レンズ	オリンパス	LUMPLFLN40XW
4-アミノピリジン	Hello Bio	HB1073
4倍対物レンズ	オリンパス	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	ウイルス力価: 3.3x1013 GC/ml
アクロマティックレンズ	エドモンド・オプティクス	49363	視覚スペクトルと近赤外
卓上型微量遠心機	ベンチマーク・サイエンティフィック	C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
ホウケイ酸ガラス キャピラリー	Warner Instruments	G150F-6
Burr	ファイン サイエンス ツール	19008-07
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
カメラ - Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
クロルヘキシジン外科用スクラブ	Vetasept	XHG008
Clippers	Andis	22445	AGC スーパー 2 速 取り外し可能なブレード クリッパー
コリメーション コンデンサー レンズ	ThorLabs	ACL2520-A
カバースリップ	Fisher Scientific Ltd	10011913
クライオスタット	ライカ	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
シアノアクリレート接着剤	Rapid Electronics Ltd	84-4557
データ収集デバイス	National Instruments	USB-6341 BNC
D-グルコース	Sigma-Aldrich	G8270
ダイクロイックミラー 500 nm ロングパス	Edmund Optics	69899
ダイクロイックミラー 600 nm ロングパス	エドモンド・オプティクス	69901
ダイクロイックミラーキューブ	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	ミルポア	324626
サイドポート付き電極ホルダー	HEKA	895150
蛍光フィルター	Chroma	59022m
励起フィルター	Chroma	ET570/20x
アイジェル	Dechra	Lubrithal
ファインペイントブラシ	科学研究所用品	BRU2052
ギロチン	ワールド精密機器	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
過酸化水素溶液	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
イソフルラン	ヘンリー・シャイン	988-3245
イソペンタン	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-グルコン酸	Sigma-Aldrich	G4500
キネマティック蛍光フィルターキューブ	ThorLabs	DFM1T1
LEDドライバー	ThorLabs	LEDD1B
リドカイン軟膏	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
マイクロドリル	ハーバード装置	75-1887
マイクロ電極プーラー	サッター機器	P-87
マイクロインジェクションシリンジ	ハミルトン	7634-01/00
マイクロインジェクションシリンジニードル	ハミルトン	7803-05	カスタム仕様:ゲージ33、長さ15mm、ポイントスタイル4 - 12°
マイクロインジェクションシリンジポンプ	World Precision Instruments	UMP3T-1
取り付け 青色LED	ThorLabs	M470L5
取り付け 緑色LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM		SFH4550スライスの屈折IRイメージングに使用され、微分干渉コントラスト(DIC)光学系は、別の一般的に使用される方法です
OCT媒体	VWRインターナショナル	RAYLLAMB / OCT	最適切断温度媒体
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	158127
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148
パッチクランプ増幅器	分子デバイス	700A
蠕動ポンプ	World Precision Instruments	Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Scalpel blade	Swann Morton	#24
Slice anchor	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
脳定位固定装置フレーム	Kopf	Model 902
マイクロドリル用脳定位固定装置ホルダー	ハーバード大学装置	75-1874
スクロース	Sigma-Aldrich	S0389
手術用顕微鏡	カールツァイス	OPMI 1 FR プロ
縫合	エチコン	W577H
細胞内記録用シリンジフィルター溶液	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
クエン酸テトロドトキシン	Hello Bio	HB1035
トランスファーピペット	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
正立蛍光顕微鏡	Leica	DM6 B
VECTASHIELD DAPI付き退色防止封入剤	ベクターラボラトリーズ	H-1200-10
ベクタステイン ABC-HRPキット	ベクターラボラトリーズ	PK-4000
ブラート	カムデンインスツルメンツ	7000smz-2
WinLTP		https://www.winltp.com/ バージョン2.32	データ収集ソフトウェア
Solution
aCSF
ショ糖切断液
PFA
細胞内?