方法論記事

ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

DOI：

10.3791/63081

⸱

2021年9月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Food Nutrition and Human Health, School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, 2School of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Economics and Business, 3Perfect Life & Health Institute

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ポリグルタミン凝集、神経細胞死、および化学回避行動を含む Caenorhabditis elegansにおける試験化合物の神経保護活性を評価するためのプロトコル、ならびに複数の表現型の例示的な統合を提示する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

加齢に伴うミスフォールディングおよび病原性タンパク質の凝集は、いくつかの神経変性疾患の原因である。例えば、ハンチントン病(HD)は、主に、ハンチンチンタンパク質中の拡張グルタミン管をコードするCAGヌクレオチド反復によって駆動される。したがって、ポリグルタミン(polyQ)凝集の阻害、特に凝集関連神経毒性は、HDおよび他のpolyQ関連状態の予防のための有用な戦略である。この論文では、確立されたpolyQトランスジェニック Caenorhabditis elegans モデルを使用して、HDに対する試験化合物の神経保護能力を評価するための一般化された実験プロトコルを紹介します。AM141株は、polyQ::YFP融合タンパク質の筋肉特異的発現により、離散的な蛍光凝集体の加齢表現型が成体段階で体壁内で容易に観察できるため、polyQ凝集アッセイに選択される。対照的に、ASHニューロンにおけるpolyQ拡張路の強い発現を有するHA759モデルは、ニューロン死および化学回避行動を調べるために使用される。標的化合物の神経保護能力を包括的に評価するために、上記の試験結果は、最終的に、直接比較および直接観察の方法で複数の表現型のプロファイリングを伴うレーダーチャートとして提示される。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDにおける進行性神経変性は、CAGトリヌクレオチド反復1、2、3によってコードされるpolyQの異常なストレッチを有する病原性突然変異ハンチンチンを含む。37以上のグルタミン反復を有する変異型ハンチンチンタンパク質は、HD患者および動物モデル4,5の脳に凝集して蓄積する傾向があり、最終的に神経変性をもたらす6。疾患病態5におけるpolyQ凝集体の役割に関する明確さの欠如にもかかわらず、polyQ凝集およびそれに関連する毒性の阻害は、HDおよび他のpolyQ疾患に対する有用な治療戦略である4、7、8。

ニューロンシグナル伝達経路の保存および構築が容易なトランスジェニック疾患モデルのために、Caenorhabditis elegansは、神経学的障害の調査のための主要なモデル生物として広く使用されている9、10、11、12。例えば、凝集を起こしやすいpolyQ拡張を発現するトランスジェニックC.エレガンスモデルは、選択的ニューロン細胞喪失、細胞質凝集体形成、および行動欠陥などのHD様特徴を客観的に模倣することができる13。確立されたpolyQ線虫モデルにおけるこれらの表現型を逆転させる試験サンプルの潜在的な効果の調査は、様々な有望な治療候補、例えば、多糖類7、14、15、オリゴ糖16、天然小分子17、18、およびハーブ抽出物および式19、20の同定をもたらした。

ここで説明するのは、2つの主要なpolyQ C. elegansモデルと、アストラガラス・メンブラナセウス7から単離された多糖であるアストラガランに関する研究によって例示されるような潜在的な用途のための関連プロトコルである。C. elegansにおけるpolyQ凝集アッセイのために、使用されたモデルはトランスジェニック株AM141であり、これはQ40::YFP融合タンパク質の発現により成体期に達したときに体壁筋中に分散した蛍光パンクタを示し、黄色蛍光タンパク質(YFP)に融合した40残基(polyQ40)のpolyQ管21,22.HA759株は、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびHtn-Q150(150残基のヒトハンチンチン由来polyQ管)の両方をASHニューロンでは強く発現するが、他のニューロンでは弱く、進行性神経変性およびASH細胞死をもたらすため、ニューロンの生存および化学回避行動を調べるために使用された7,13。治療候補の神経保護可能性の包括的な要約は、異なるアッセイからの結果を統合することによって提供される。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注: このプロトコルで使用されるソリューションのレシピについては、 表 1 を参照してください。

1. Caenorhabditis elegans アッセイのための材料の調製

  1. C.エレガンス株の維持
    1. C.エレガンス(AM141およびHA759)およびエシェリヒア・コリ(OP50およびNA22)株を得る(材料表を参照)。
    2. 線虫増殖培地(NGM)プレート上の線虫を、大腸菌OP50を播種し、AM141 21の場合は20°C、HA75923の場合は15°Cに維持する。
  2. 大腸菌OP50細菌培養物の調製
    1. ルリア・ベルターニ(LB)ストリークプレートから 大腸菌 OP50の単一コロニーを選び、50mLの液体LB培養物に接種する。
    2. OP50細菌を37°Cおよび200rpmのシェーカー中で、570nmで〜0.5の光学密度(OD570)になるまでインキュベートする。
    3. OP50細菌培養物を4°Cで保存し、2週間以内に使用してください。
  3. OP50細菌を用いたNGMプレートの作製
    1. 1 Lオートクレーブ可能なボトルに、20 gの寒天、2.5 gのペプトン、3.0 gのNaCl、および975 mLの脱イオン水を加えます。オートクレーブを121°Cで30分間放置する。
    2. 液体NGM寒天ボトルをベンチに置き、〜60°Cに冷却し、次いで、1 mLの1 M CaCl2、1 mLの1 mLの1 M MgSO4、1 mLの5 mg/mLのコレステロール、および25 mLの1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)の滅菌原液を加える。
    3. 滅菌した90 mmのペトリ皿にNGMを20 mL注ぎ、プレートをベンチに残して冷却して固化させます。プレートを逆さまに保ち、室温でベンチで2日間乾燥させます。
    4. OP50細菌培養物を各NGMプレートに200μL分注し、滅菌ガラスコーティングロッドで均等に広げます。蓋を閉め、プレートを37°Cで一晩インキュベートする。
    5. OP50を播種したNGMプレートを室温でカバー付きのプラスチック箱に保管し、2週間以内に使用してください。
  4. 年齢同期 C.エレガンス集団の 調製
    1. 重質成虫線虫を滅菌1.5mL微量遠心管に集め、1000× g で1分間遠心分離する。3回洗浄し、線虫をM9バッファーに再懸濁する。
    2. 等量の漂白剤溶液を加え、3〜5分間穏やかに攪拌する。解剖顕微鏡下で15秒ごとに漂白を監視します。
      注:漂白剤溶液は、等量の10%NaOClおよび1M NaOHを混合することによって、使用前に新たに調製されなければならない(表1)20。
    3. 線虫のほとんどが壊れたら、M9バッファーで希釈して消化を停止します。素早く遠心分離機で上清を除去し、ペレットをM9緩衝液に再懸濁し、洗浄を3回繰り返した。
    4. ペレットをS培地に再懸濁する。線虫の残留物を重力で2〜3分間沈降させ、卵を上清に残す。
    5. 上清を新しい滅菌微量遠心チューブに吸引します。卵を1000 × g で1分間遠心分離して集める。
    6. 上清の〜80%を捨て、卵を20mLのS培地を含む滅菌フラスコに移す。フラスコをシェーカーに入れ、卵を120rpmで食物なしで一晩インキュベートして、同期したL1線虫を得る。

2. PolyQ凝集アッセイ

  1. polyQ凝集アッセイのための線虫の調製
    1. OP50(OD570 0.7-0.8)および5 mg/mLのアストラガランを含む500 μLのS培地(通常は1つの時点にわたって1つの処理につき1ウェル)を含む48ウェルプレートの各ウェルに、AM141の300〜500の同期L1幼虫を移す。
    2. プレートをパラフィルムで密封し、20°Cおよび120rpmで24時間、48時間、72時間、および96時間インキュベートする。
    3. 線虫を滅菌1.5mL微量遠心管に収穫し、M9緩衝液で洗浄し、遠心分離(1000 > g を1分間)して×3回洗浄し、残りのOP50を除去した。AM141線虫をM9バッファーに再懸濁し、画像取得の準備を整えます。
  2. 蛍光画像の取得とデータ解析
    メモ:データは、このハイコンテンツイメージングシステムで自動的に分析されます。自動撮像装置が利用できない場合、画像取得用のアガロースパッドを準備する従来の方法を使用して、一般的な蛍光顕微鏡7、15、17を使用して同様の性能を達成することができる(ステップ3.2および3.3を参照されたい)。
    1. 10-15 線虫を 384 ウェルプレートの各ウェルに移します (最終容量 80 μL/ウェル)。各処理に10個の複製ウェルを設定します。
    2. 各ウェルに10 μLの200 mMアジ化ナトリウムを加えて線虫を麻痺させ、底に沈降させます(5〜10分)。
    3. プレートを高濃度イメージングシステムに置き、蛍光画像を取得します(デバイスとソフトウェアの情報については 、材料表 を参照してください)。
    4. 画像取得ソフトウェアを開き、以下のパラメータを設定します。
      1. [プレート取得の設定]ウィンドウを開き、新しい実験セットと名前を作成します。
      2. [倍率] を 2x、[カメラ ビニング] を 1、[プレート タイプ] を [384 ウェル プレート] として選択します。
      3. 訪問する井戸とサイト(単一サイト)を設定します。
      4. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルター を選択し、画像ベースのフォーカスオプションを有効にします。
      5. 露出を 300 ミリ秒に設定します。
        メモ:上記の設定は、イメージングパラメータを最適化するためにテストおよび調整できます。
      6. 画像取得設定を保存し、[プレートを取得]ボタンをクリックして実行します。
    5. 画像解析ソフトを用いて画像データを解析します。
      1. [プレート データのレビュー] ウィンドウを開き、画像解析用の テストプレート を選択します。
      2. テストウェルをダブルクリックして、その画像を表示します。
      3. 解析方法として 「カウント核 」を選択し、「設定を 構成」 ボタンをクリックして、以下の設定のウィンドウを表示します。
      4. FITC チャンネルからソース画像を定義し、 標準アルゴリズムを選択します。
      5. 画像解析パラメータを次のように設定します:おおよその最小幅= 10μm(= 2ピクセル)。おおよその最大幅 = 50 μm (= 12 ピクセル);ローカル背景の上の強度 = 1,000-2,000 グレーレベル。
      6. 現在の設定をテストして、分析方法を最適化します。
      7. 設定を保存し、すべての井戸で解析を実行します。
        注: 1 つの 384 ウェルプレートの分析が終了するまでに約 20 分かかります。
      8. 各ウェルの Q40::YFP 集計の合計数として Total Nuclei をエクスポートします。
    6. 各ウェルの線虫の数を数えます。
    7. 各グループの線虫あたりのQ40::YFP集計の平均数を計算し、各時点のデータに非線形カーブフィットを適用します。
    8. 以下のeq(1)を用いて阻害指数を計算する:
      阻害指数= figure-protocol-1 (1)
      ここで、N個の対照およびN個のサンプルは、それぞれ対照群および処置群におけるQ40::YFP凝集体の平均数である。

3. PolyQ媒介性神経毒性アッセイ

  1. 試験サンプルによる C.エレガンス の治療
    1. polyQ神経毒性アッセイ用の線虫を調製するには、HA759の300〜500同期L1幼虫を、OP50(OD570が0.7〜0.8のOD570)および5mg /mLのアストラガランを含む500μLのS培地(典型的には各処置に対して3つの複製ウェル)を含む48ウェルプレートの各ウェルに移す。
    2. プレートをパラフィルムで密封し、15°Cおよび120rpmで3日間23日間インキュベートする。
    3. 遠心分離により線虫を回収し、M9バッファーで3〜5回洗浄する。線虫をM9バッファーに再懸濁して、ニューロン生存および回避アッセイに使用する。
  2. アガロースパッドの調製
    1. 100mLのM9緩衝液(2%、w / v)に2gのアガロースを加え、アガロース溶液をマイクロ波で加熱して沸騰させる。
    2. 厚さ2mmのガラス板2枚の間に置かれた厚さ1mmの顕微鏡スライドガラスの中央に、0.5mLの溶融アガロースを分配する。別のスライドで垂直に覆います。アガロースが冷えて固まったら、上部のスライドをそっと取り外します。
  3. ASHニューロン生存アッセイ
    1. アガロースパッド上に20mMのアジ化ナトリウムを滴下する。15-20 HA759線虫を滴に移して固定化する。
    2. カバースリップを線虫の上にそっと置きます。スライドをデジタルカメラを取り付けた蛍光顕微鏡の下に保管してください。40倍対物レンズとFITCフィルターを選択して、線虫の頭部領域のGFP陽性ASHニューロンを検出します。
    3. 各群の線虫を無作為に50個以上選択し、頭部領域にGFP標識両側性ASHニューロンを有する線虫の数をカウントする7。以下のeq(2)を用いてASHニューロンの生存率を計算する。
      神経細胞生存率(%)= figure-protocol-2 (2)
      ここで、N生存 率およびN総数は 、それぞれGFP陽性ASHニューロンを有する線虫の数および各群において試験された線虫の総数である。
  4. 浸透圧回避アッセイ
    1. 食品を含まないNGMプレート(9 cm)を、中央の8 Mグリセロール(〜30 μL)ラインで通常の(N)ゾーンとトラップ(T)ゾーンに分割します。グリセロールラインから約1cm離れたところに200mMのアジ化ナトリウム(〜20μL)ラインを広げて、グリセロールバリアを通過してゾーンTに交差する線虫を麻痺させる。
    2. 〜200匹の線虫を、各群の3つの複製プレートのゾーンNにそれぞれ移す。線虫を引き付けるために、ゾーンT(プレート端から1cm)に1%ブタンジオン(〜2μL)の滴を加える。直ちにシャーレの蓋を覆い、23°Cで90分間インキュベートした。
    3. 顕微鏡下でNゾーンおよびTゾーン上の線虫の数をスコアリングする。回避指数は、eq (3)20 を使用して計算します。
      回避指数 = figure-protocol-3 (3)
      ここで、NおよびTは、それぞれNおよびTゾーンにおける線虫の数である。データは、3回の反復±標準偏差(SD)の平均として提示され、>3の独立した実験を表す。
    4. ペア化されていない両側 t検定を実行して、レンゲ群と対照群のデータを比較します。

4. レーダーチャートの作成

  1. グラフ作成ソフトウェアを開き、さまざまなアッセイのデータを新しいシートにインポートします。放射軸のタイトルとしてA(X)列、対照群からのデータとしてA(Y)列、治療群からのデータとしてB(Y)列を入力します。
  2. 必要なデータを選択し、[ プロット]|クリックします。特殊化: ツール バーメニューのレーダーボタンでレーダーチャートを生成します。
  3. 放射状軸をダブルクリックし、必要に応じて各軸の スケール、ティック、および ティックラベル を調整します。
  4. メニューの [ファイル ]をクリックし、[ グラフのエクスポート] を選択して画像を *.tiffとして保存します。
    注: 資料表の ソフトウェア Web サイトでは、レーダー チャートの作成に関する詳細なヘルプ ドキュメントとビデオ チュートリアルを提供しています。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このトランスジェニックpolyQ株AM141は、その体壁筋細胞においてQ40::YFP融合タンパク質を強く発現している7,21。図1Aに示すように、この株の離散的な凝集体表現型は、この記事で説明する自動イメージングおよび分析プロトコルによって同定することができる。AM141線虫におけるQ40::YFP凝集体の量は、L1段階から48時間後に有意に増加した。しかしながら、この増加傾向は、レンゲ治療によって抑制され(図1B)、polyQ凝集に対するレンゲの保護可能性を実証した。通常、試験サンプルの凝集防止効果を評価するために、Q40::YFP凝集体をカウントする時点として72時間または96時間のいずれかを便利に使用できます。このプロトコールでは、AM141線虫の蛍光凝集体を自動イメージングシステムによって捕捉したが、蛍光顕微鏡もこの目的に使用することができる7。

C.エレガンス株HA759は、その感覚ASHニューロンにおいてGFPマーカーおよびHtn−Q150の両方を発現し、これらのニューロンの進行性喪失および機能不全をもたらす11,13。線虫を2%アガロースパッドに装着してASHニューロン生存率を決定し(図2A)、顕微鏡で可視化してASHニューロンを検出した。線虫の頭部領域における両側ASHニューロンにおけるGFP蛍光の喪失は、ASHニューロン死を示す(図2B)。HA759線虫におけるASHニューロンの生存率は、15°Cで3日間インキュベートした後の対照群において<40%であり、7,20であり、polyQ媒介性神経毒性を示す。したがって、このASHニューロン生存アッセイは、C.エレガンスニューロンに対する試験化合物の効果、例えば、ポリアグリカンではなくレンゲの神経保護効果を視覚的に評価するために使用することができる(図2C)。

行動機能障害はpolyQ疾患の主要な臨床症状であるため、多数のHA759線虫を用いた化学感覚回避アッセイ(図3A)は、polyQ凝集によって媒介されるASHニューロンの機能喪失に対する試験サンプルの影響を調べるための簡略化された試験として設計されています。 図3Bに示すように、未処置対照群におけるHA759線虫の回避指数は〜0.5であり、以前に報告されたものと同様である14。興味深いことに、アストラガランを15°Cで3日間処理した線虫では、回避指数が>0.6に増加し(図3B)、行動障害に対する多糖類の神経保護効果が実証された。

試験化合物の全体的な神経保護能力を評価するために、上記の個々のアッセイからのデータを統合して、複数の表現型のレーダーチャートとして提示することができ、直接比較および直接表示に適したpolyQ表現型の統一的な特徴となる。 図4に示すように、レンゲ処理区における三角形の面積が対照群のそれよりも大きいことは、多糖類の抗polyQ効果を示す。

figure-results-1
図1:ポリQ40凝集に対するレンゲの効果(A)レンゲの有無にかかわらず20°Cで96時間処理した後のAM141線虫の代表画像。 蛍光画像(左パネル)は、高含有イメージングおよび分析システムを使用して384ウェルプレートから取得され、Q40::YFP凝集体(右パネル)はシステムによって自動的に同定された。インセットは、polyQ凝集体を示す線虫画像の拡大図である。スケールバー = 500 μm. (B) Q40::YFP 凝集体の定量化。AM141線虫中のQ40::YFP凝集体の数は、20°Cでレンゲの有無にかかわらず治療後4日間、24時間ごとに高含量イメージングシステムを使用してモニターした。 各群の約100〜150匹の線虫を、各時点での凝集体についてスコア化した。結果は、線虫あたりの凝集体の平均数に基づく適合曲線として示されます。略語: polyQ = ポリグルタミン;YFP = 黄色蛍光タンパク質;FITC=フルオレセインイソチオシアネート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:Htn-Q150媒介性ASHニューロン死に対するレンゲの効果。(b)400倍の倍率を用いたASHニューロン生存および死亡を有するHA759線虫の代表的な顕微鏡写真。スケールバー = 20 μm。HA759線虫を、L1から15°Cで3日間、レンゲの有無にかかわらず処理した後に蛍光顕微鏡を用いて撮影した。(C)polyQ媒介性ASHニューロン死に対するレンゲの保護効果。ポリアココス由来の多糖であるポリアグリカンをコントロールとして用いた。データは、3回の反復のSD±手段として提示され、3つ以上の独立した実験を表す。統計解析は、対照群のデータをレンゲおよびポリアグリカン群のデータと比較するために、ペア化されていない両側t検定を用いて実施した。*p < 0.05;ns = 有意なし。略称:GFP=緑色蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:Htn-Q150媒介性行動機能障害に対するレンゲの効果。(b)回避アッセイの代表的な結果。回避指数は、プレート上の線虫の総数に対するNゾーン内の線虫の割合として定義した。結果は、3つの反復のSD±手段として提示され、3つの独立した実験を表す。回避指数の統計的分析は、ペア化されていない両側t検定を用いて行った。**p < 0.01.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:アストラガランの全体的な神経保護能力。 3つの異なるアッセイからのデータがOriginProソフトウェアにインポートされ、作成されたレーダーチャートが提示され、polyQによって媒介される複数の表現型に対するレンゲの一般的な効果をプロファイルするために提示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1.この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

polyQ凝集およびタンパク質毒性は、ハンチントン病13などのpolyQ障害の重要な特徴であるため、AM141株のpolyQ凝集アッセイ、HA759株のASHニューロン生存アッセイ、およびHA759株の化学感覚回避アッセイを含む、試験化合物の神経保護能力を包括的に評価するために、複数のモデルおよび方法の使用を推奨する。ここに提示されたプロトコールは、polyQ凝集および関連する神経毒性の両方に対する阻害効果を含む、polyQ毒性に対する試験サンプルの神経保護能力を評価するために使用されてきた7,14,15,16,17,19,20、HDおよび他のpolyQ疾患の創薬におけるそれらの可能性を実証している。

ポリQ凝集アッセイにおけるpolyQ凝集体の検出および計数のために、自動化されたイメージングおよび分析システムが導入されています。この方法には、高スループットで時間効率が良いという利点があり、面倒な計数プロセスにおける主観的なエラーが大幅に減少します。384ウェルプレート全体の場合、画像の取得と解析を完了するのに<1時間しかかかりません。しかしながら、従来の顕微鏡撮像法は、自動撮像装置7を用いずに本研究室においても同様の性能を示している。

各時点の典型的なQ40::YFP凝集アッセイでは、1処置あたり合計100〜150個の線虫が推奨され、それぞれ10〜15個の線虫を含む複製ウェルで実施することができる。しかし、L1幼虫は、いくつかの治療またはより高い濃度に対してより敏感であり得ることに留意すべきである。したがって、高用量の試験化合物は、その成長を阻害し、成長が遅いため偽陽性の結果をもたらし、したがって、polyQ凝集が遅れる可能性がある。通常、この懸念に対処し、試験化合物23の適切な濃度範囲を確保するために、食品クリアランスアッセイを行うことができる。

polyQ神経毒性アッセイで使用されるHA759トランスジェニック線虫は、OSM-10::GFPおよびHtn-Q150を共発現し、両側性ASH感覚ニューロンを明確に同定することを可能にする。したがって、ASHニューロン生存率は、GFP発現の有無によって評価される。通常、対照線虫中のASHニューロンの〜40〜75%が23,24死んでいる。興味深いことに、pqe-1(ポリグルタミンエンハンサー-1)のHA759株における遺伝子変異の背景(pqe-1;Htn-Q150)はpolyQ媒介毒性を加速し、15°Cでも3日以内にほとんどのASHニューロンを死に至らしめるため、この株はニューロン生存アッセイのために15°Cで増殖する(以前に報告された23,24)。

HA759線虫におけるASHニューロンの機能的喪失は、細胞死およびタンパク質凝集体の検出前に起こり得る13;したがって、浸透圧回避挙動アッセイは、polyQ媒介毒性の評価に不可欠です。低温での活性の低いHA759線虫の行動実験に対する潜在的な影響を最小限に抑えるために、回避アッセイプレートを、この株を用いたニューロン生存アッセイのように15°Cではなく加湿した23°Cのインキュベーターでインキュベートする。さらに、Htn-Q150/OSM-10::GFPトランスジェニック線虫は鼻触りに非常に敏感であることが報告されています。したがって、ASHニューロン機能の代替検出は、ノーズタッチアッセイ13である。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文で使用されているプロトコルの開発と改善に協力してくれた黄研究室の元メンバー、特にHanrui Zhang、Lingyun Xiao、Yanxia Xiangに感謝します。この研究は、111プロジェクト(助成金番号B17018)と河北省自然科学財団(助成金番号H2020207002)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C. elegans strains
AM141
rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]<		em>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/AM141
HA759
rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]		Caenorhabditis Genetics Center(CGC)https://cgc.umn.edu/strain/HA759
大腸菌株
NA22Caenorhabditis (Genetics Center(CGC)https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50Caenorhabditis Genetics Center(CGC)
https://cgc.umn.edu/strain/OP50試薬
AgarShanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.EQ1001-500G
https://www.ekear.com AgaroseBiowest111860
ButanedioneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80042427https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59
5d0
コレステロールSigma-AldrichC8667https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
グリセロールアラジン(株)G116203https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
PeptoneGuangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. (ペプトン広東環凱微生物科学技術有限公司)050170B
https://www.huankai.com/show/21074.html アジ化ナトリウムSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80115560https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551e96ff5f07cd
水酸化ナトリウムSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10019718https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817
d3d8c68ec25e6
亜塩素酸ナトリウム溶液広州化学試薬工場7681-52-9http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Bhttps://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
酵母エキスオキソイド株式会社LP0021B
https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021BEquipment
384ウェル細胞培養プレートネストバイオテクノロジー株式会社761001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
48ウェル細胞培養プレートネストバイオテクノロジー(株)748001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
90mmシャーレSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F611003https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
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