Method Article

オープンソースのラボロボットによるショットガンプロテオミクスサンプル処理

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

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オープンソースのロボット液体処理システムを操作して、半自動タンパク質サンプル調製を行い、洗剤の除去、タンパク質消化、ペプチド脱塩のステップをカバーするための詳細なプロトコルと3つのPythonスクリプトが提供されています。

Abstract

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質量分析ベースの散弾銃プロテオミクス実験では、酵素タンパク質消化やクリーンアップなど、複数のサンプル調製ステップが必要であり、ベンチ労働の時間を要し、バッチ間の変動の原因を提示することができます。ピペットロボットによるラボの自動化により、手作業を削減し、スループットを最大化し、研究の再現性を向上させることができます。それでも、標準的なオートメーションステーションの急激な開始価格は、多くの学術研究所にとって手頃な価格ではありません。この記事では、半自動タンパク質還元、アルキル化、消化、およびクリーンアップ手順を設定するための指示を含む、手頃な価格のオープンソースオートメーションシステム(Opentrons OT-2)を使用したプロテオミクスサンプル調製ワークフローについて説明します。OT-2システムをアプリケーションプログラミングインタフェースでプログラミングするためのオープンソースのPythonスクリプトを伴います。

Introduction

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質量分析ベースの散弾銃プロテオミクスは、生物学的サンプル中の多くのタンパク質の存在量を同時に測定する強力なツールです。バイオインフォマティクス解析を用いたプロテオミクス実験は、バイオマーカーを同定し、病理学的メカニズムを支える関連する生物学的複合体および経路を発見するために日常的に使用されています。高い分析物特異性と潜在的な定量精度により、ショットガンプロテオミクスは、抗体に頼ることなく臨床サンプル分析のための研究施設や診断ラボで採用される優れた可能性を秘めています1,2。

ショットガンプロテオミクス分析用のタンパク質サンプルを調製するには、通常、生体サンプルから抽出したタンパク質(細胞や組織)は、サンプルタンパク質濃度の測定、タンパク質還元、アルキル化、ペプチドへの酵素消化など、長いプロトコルを使用して処理する必要があります。さらに、洗剤を含む一般的な溶解バッファーで抽出されたタンパク質は、多くの場合、分析の前にバッファー交換または洗剤除去の追加のステップを必要とするため、洗剤はトリプシン消化を妨げ、下流の液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)分析の性能を著しく低下させる可能性があります3.ペプチドは、典型的には、さらに脱塩、乾燥、および酵素消化に続くLC-MS/MS適合溶媒で再構成される。....

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Protocol

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開発された Python スクリプトは GitHub に入金されました: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。スクリプトのコピーは 、補足ファイル 1 に記載されています。最新バージョンについては、GitHub リポジトリを参照してください。

1. 実験準備

  1. プロトコルを開始する前に、必要なハードウェアを確認してください。
    注:次のハードウェアコンポーネントが必要です:OT-2ピペット、ピペットチップ、4-in-1チューブラックセット、アルミニウムブロックセット、磁気モジュール、温度モジュール、96-ウェル2 mL深層ウェルプレート( 材料表を参照)。

2. 単一タンパク質ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた質量分析(MS)サンプル調製

  1. テキスト エディタで NoSP3_digestion.py スクリプトを開き、[ここでのみカスタマイズ] セクションで必要に応じて実験固有の変数を指定します。
    注: 実験固有の変数には、サンプル数と反復数が含まれます。サンプル濃度;試薬の量は、ジチオトライトール - DTT....

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Results

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OT-2ロボットと互換性があり、単一のタンパク質標準ウシ血清アルブミン(技術的複製n = 5消化)と洗剤含有ヒト心臓ライセートサンプル(n = 5消化)を用いた質量分析プロテオミクスのサンプル調製を行う3つのPythonスクリプトが提供されています。各消化産物は、2つのペプチドのクリーンアップ反応に分割されます。BSAおよび心臓サンプルの各ランにおける同定されたペプチドスペクトルマッチ(PSM)、ペプチド、およびタンパク質の数を 図4 および 図5に示す。BSAサンプルでは、728個のPSMと65個のペプチドの中央値をそれぞれ5.2%および3.2%の変動係数(CV)で同定した。複合心臓サンプルでは、7.6%、5.9%、3.6%の変動係数を持つ10回で、9,526 PSM、7,558個のペプチド、1,336個のタンパク質の中央値が同定されました。合計1,935個のタンパク質が心臓サンプルの10回から同定され、その中で1,677個のタンパク質が2回以上同定された。ペプチド定量における変動性を決定するために、抽出されたイオン.......

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Discussion

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プロトコル内の重要なステップ
最高のパフォーマンスを得るため、OT-2と互換性のあるOpentrons検証済みのラボウェア、モジュール、および消耗品を使用する必要があります。カスタムラボウェアは、Reference14でのOpentronsの指示に従って作成できます。OT-2デッキ、ピペット、ラボウェアを初めて使用する場合は必ず調整してください。また、ペプチドおよびタンパク質のクリーンアップのためのビーズを準備するために、SP3ビーズのメーカーのガイドラインに従うことは重要です。特に、ビーズとペプチド結合反応の間、結合反応におけるアセトニトリルの体積は≥95%である必要があり、ビーズ濃度は≥0.1 μg/μLである必要があります。ここでのペプチドクリーンアップスクリプトの最適化されたパラメータにより、アセトニトリル体積比は95%、ビーズ濃度は0.37 μg/μL、ペプチド濃度は14~37μg/mLの範囲です。ペプチド質量は、我々の経験から消化反応の100 μLで40〜100 μgと推定されます。SP3タンパク質のクリーンアップでは、5~10 μg~1.......

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Disclosures

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著者には宣言する競合はありません。

Acknowledgements

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この作品は、YHに対するNIH賞F32-HL149191によって部分的にサポートされました。R00-HL144829 から EL;R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 to MPL. 図1、 図2、 図3 は、ウェブベースの科学イラストレーションツールの助けを借りて作成された、BioRender.com。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 マイクロ;LピペットチップOpentrons
4-in-1チューブラックセットOpentrons各セットには、ベーススタンド2個とチューブホルダートップ4個が含まれています(1.5mL、2mL、15mL+50mL、15mL、50mL)。この研究では、2mLと15mL + 50mLのトップスを使用します。
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC カラムThermo Scientific#1645683 μm粒子;100 Å細孔;75 μm x 150 mm
アセトニトリルLC-MSグレードVWR#JT9829
アルミニウムブロックセットOpentronsこのブロックセットには、96ウェル、2.0mLチューブと互換性のある3つのトップと、OT-2温度モジュールで使用するPCRストリップが含まれています。本稿では2.0mLチューブホルダーを使用しています。
重炭酸アンモニウムSigma-Aldrich# A6141
ウシ血清アルブミン標準液、2 mg/mLThermo Scientific#23210
ジメチルスルホキシド(DMSO) LC-MS グレードThermo Scientific#85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray HPLC カラムThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
エタノールプルーフ 195-200Fisher#04-355-720
ギ酸 LC-MS グレードThermo Scientific#85178
ヒト心臓溶解物Novus BiologicalsNB820-59217
ヨードアセトアミドSigma-Aldrich#I1149
磁気チューブラックThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini CentrifugeThermo Scientific#75004061benchtop mini centrifuge for quick spin
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V BottomOpentrons
OT-2 磁気モジュールOpentronsGEN1
OT-2 P300 シングルチャンネルピペットOpentronsGEN1
OT-2 P50 シングルチャンネルピペットOpentronsGEN1
OT-2 ロボットピペッティングロボットOpentronsOT-2
OT-2 温度モジュールOpentronsGEN1
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Scientific#23275
Protein LoBind tubes 2.0 mLEppendorf#022431102
Protein Sequence DatabaseUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20レビュー済み:yes
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, HydrophobicCytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles,HydrophylicCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo Scientific真空蒸発器
Thermo Q Exactive HF 質量分析計Thermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
トリプシン MS グレードThermo Scientific#90057
水 LC-MS グレードVWR#BDH83645.400

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue anal....

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