Method Article

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

DOI:

10.3791/63116

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November 8th, 2021

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1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。

Abstract

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ミトコンドリアは、多くの神経変性疾患の病態生理学において重要である。ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位(MMP)、活性酸素種のミトコンドリア産生(ROS)、およびミトコンドリアDNA(mtDNA)コピー数の変化は、多くの場合、これらのプロセスの特徴です。このレポートでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)やiPS細胞由来の神経細胞やグリア細胞など、さまざまな細胞タイプで複数のミトコンドリアパラメータを測定するための新しいフローサイトメトリーベースのアプローチについて詳しく説明します。このフローベースの戦略では、生細胞を使用してミトコンドリア体積、MMP、およびROSレベルを測定し、固定細胞を使用してミトコンドリア呼吸鎖(MRC)の成分とミトコンドリア転写因子A(TFAM)などのmtDNA関連タンパク質を推定します。

MitoTracker Green(MTG)、テトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE)、MitoSox Redなどの蛍光レポーターと共染色することにより、ミトコンドリア体積、MMP、およびミトコンドリアROSの変化を定量化し、ミトコンドリア含有量に関連付けることができます。MRC複合体サブユニットおよび外ミトコンドリア膜20のトランスロカーゼ(TOMM20)に対する抗体による二重染色は、MRCサブユニット発現の評価を可能にする。TFAMの量はmtDNAコピー数に比例するため、TOMM20あたりのTFAMの測定は、ミトコンドリア体積あたりのmtDNAの間接的な測定値を提供します。プロトコル全体は2〜3時間以内に実行できます。重要なことに、これらのプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、ミトコンドリア体積あたりの総レベルと特定のレベルの両方でミトコンドリアパラメータの測定を可能にします。

Introduction

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ミトコンドリアは、ほとんどすべての真核細胞に存在する必須の細胞小器官です。ミトコンドリアは、酸化的リン酸化を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成することによってエネルギー供給に関与し、生合成と代謝の代謝仲介者として機能します。ミトコンドリアは、ROSの生成、細胞死、細胞内Ca2+調節など、他の多くの重要な細胞プロセスに深く関与しています。ミトコンドリア機能障害は、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、ハンチントン病(HD)、フリードライヒ運動失調症(FRDA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)など、さまざまな神経変性疾患と関連しています1。ミトコンドリア機能障害の増加とmtDNA異常も、人間の老化に寄与すると考えられています2,3。

神経変性疾患では様々なタイプのミトコンドリア機能障害が起こり、ミトコンドリア容積の変化、MMP脱分極、ROSの産生、mtDNAコピー数の変化が一般的です4,5,6,7。したがって、これらおよび他のミトコンドリア機能を測定する能力は、疾患メカニズムを研究し、潜在的な治療薬をテストするときに非常に重要です。さらに、ヒトの神経変性疾患を忠実に再現する動物モデルがないことを考慮すると、脳細胞でヒトの疾患を再現する適切なin vitroモデルシステムを確立することは、これらの疾患のより深い理解と新しい治療法の開発に向けた重要なステップです2,3,8,9。

ヒトiPS細胞は、神経細胞および非神経細胞(すなわちグリア細胞)を含む様々な脳細胞を生成するために使用でき、神経変性疾患に関連するミトコンドリア損傷は両方の細胞型で見出されている3、10、11、12、13。iPS細胞を神経系統およびグリア系譜に分化させるための適切な方法が利用可能です14,15,16。これらの細胞は、in vitro疾患モデリングと薬物スクリーニングのための独自のヒト/患者プラットフォームを提供します。さらに、これらは患者に由来するため、iPS細胞由来の神経細胞とグリア細胞は、ヒトで起こっていることをより正確に反映する疾患モデルを提供します。

現在まで、iPS細胞、特に生きたニューロンやグリア細胞における複数のミトコンドリア機能パラメータを測定するための便利で信頼性の高い方法はほとんどありません。フローサイトメトリーの使用は、単一細胞におけるミトコンドリア機能を含む生物学的パラメータを測定するための強力なツールを科学者に提供します。このプロトコルは、iPS細胞からの神経幹細胞(NSC)、ニューロン、グリア星状細胞など、さまざまな種類の脳細胞の生成の詳細と、iPS細胞やiPS細胞由来の神経細胞やグリア細胞など、さまざまな種類のミトコンドリアパラメータを測定するための新しいフローサイトメトリーベースのアプローチを提供します。このプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してミトコンドリア容積、MMP、ミトコンドリアROSレベル、MRC複合体、およびTFAMを測定するための共染色戦略も提供します。ミトコンドリアの体積または質量の測定を組み込むことにより、これらのプロトコルはまた、ミトコンドリア単位当たりの総レベルおよび特定のレベルの両方の測定を可能にする。

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Protocol

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注意: このプロトコルで使用されるすべての培地と溶液のレシピについては、 材料の 表と 補足表S1 を参照してください。

1. ヒトiPS細胞のNCS、ドーパミン作動性(DA)ニューロン、アストロサイトへの分化

  1. マトリックスコーティングされたプレートを準備します。
    1. 5 mLのマトリックスのバイアルを氷上で一晩解凍します。1 mLのマトリックスを99 mLのコールドアドバンストダルベッコのモディファイドイーグルミディアム/ハムのF-12(アドバンストDMEM / F12)(1%の最終濃度)で希釈します。.1mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。
    2. マトリックス溶液を4°Cで解凍し(保冷)、6ウェルをコーティングします(6ウェルプレートに1ウェルあたり1 mL)。
    3. マトリックスコーティングされたプレートを加湿した5%CO2/95%エアインキュベーターに入れ、37°Cで1時間待ちます。プレートをインキュベーターから取り出し、室温(RT)に平衡化させます。
      注意: コーティングから3日以内にプレートを使用することをお勧めします。ただし、コーティングされたプレートは4°Cで最大2週間保存できます。 使用する前に、それを取り出してRTまで温めることを忘れないでください。長期間保存する場合は、マトリックスの乾燥を避けるために、コーティングされたプレートに1 mLのiPS細胞培養液を追加します。
  2. iPS細胞の解凍
    1. マトリックスコーティングされたプレートをRTまたはインキュベーター内で37°Cで20〜30分間予熱します。必要量のiPS細胞培養液をRTで予熱します。
    2. 予熱したiPS細胞培養液6 mLとY-27632 ROCK阻害剤12 μLを混合し、終濃度10 μMを得る。
    3. 凍結したiPS細胞バイアルを37°Cの水浴で、氷の小片が残るまで部分的に解凍します。
    4. 12 μLのROCK阻害剤を含む1 mLの予熱したiPS細胞培養液を細胞にゆっくりと滴下します。iPS細胞を含むバイアルの液体内容物を、5 mLピペットを使用して6ウェルプレコートプレートの1ウェルに滴下します。
    5. プレートを垂直方向に動かしてウェル内容物を混合し、プレートをインキュベーターに戻します。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(1x)(Ca2+/Mg 2+フリー)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で洗浄してから24時間後にiPS細胞培養液を交換します。
      注:その後の摂食にROCK阻害剤を追加しないでください。iPS細胞培地は毎日交換してください。
  3. iPS細胞の継代培養
    1. マトリックスコーティングされたプレートをRTまたはインキュベーター内で37°Cで20〜30分間予熱します。必要量のiPS細胞培養液をRTで予熱します。
    2. 細胞を含むプレートから培養液を吸引します。iPS細胞をDPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+フリー)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)ですすいでください。
    3. EDTA(0.5 mM)(6ウェルプレートに1 mL/ウェル)を追加します。コロニーの端がウェルから浮き始めるまで、プレートを37°Cでインキュベートします(通常3〜5分)。EDTAを吸引します。
    4. 予熱したiPS細胞培養液(6ウェルプレートに1ウェルあたり4 mL)を加え、10 mL滅菌ピペットを使用してiPS細胞コロニーを1回強制的に剥離します。ピペットで上下に動かすと、細胞の塊が単一細胞に分裂する可能性があるため、ピペットしないでください。
    5. 各ウェルの内容物をマトリックスコーティングされた6ウェルプレート(6ウェルプレートのウェルあたり2 mL)の2つの個別のウェルに移し、37°Cでインキュベートします。 ピペッティング中に懸濁液に気泡を発生させないでください。
      注意: インキュベーターに保管する前に、プレートを静かに振ってください。分割比は、1:2 (1 つのウェルを 2 つの新しいウェルに) から 1:4 (1 つのウェルを 4 つの新しいウェルに) にすることができます。
    6. コロニーが良好なサイズと接続で60%のコンフルエントに達するまで、培地を毎日交換してください。
  4. 神経誘導と神経前駆細胞生成
    1. 500 mLの化学的に定義された培地(CDM)、500 mLの神経誘導培地(NIM)、および500 mLの神経幹細胞無血清(NSC SF)培地を準備します。
    2. 細胞をDPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+フリー)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で洗い流し、NIM(6ウェルプレートでウェルあたり3 mL)を追加します。0 日目として設定します。
    3. NIM(6ウェルプレートに1ウェルあたり3 mL)を1日目、3日目、4日目に交換し、顕微鏡下で毎日観察します。
    4. 5日目に、神経ロゼットを下記のように浮遊培養に剥離する。
      1. DPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+フリー)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で1回穏やかに洗浄します。コラゲナーゼIV(6ウェルプレートに1ウェルあたり1 mL)を加え、インキュベーターに1分間保持します。コラゲナーゼIVを吸引し、DPBS(1x)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で1回穏やかに洗浄します。
      2. ウェルあたり2 mLのNSC SF培地を6ウェルプレートに加えます。200 μLのピペットチップを使用してグリッドを描画することにより、ウェルの底部を削り取って細胞を剥離します。
      3. 細胞懸濁液を6ウェルプレートから10 cmの非接着性ディッシュに回収します。NSC SF培地で容量を12mLに補います。
      4. 凝集を防ぐために、インキュベーター内のオービタルシェーカーで非付着性皿を65〜85rpmで振とうします。
  5. DAニューロン分化
    1. 7日目に、100 ng/mLの線維芽細胞増殖因子-8b(FGF-8b)を添加した12 mLのCDMを加え、インキュベーター内のオービタルシェーカーに皿を置きます。
    2. 8〜13日目に、2日ごとに培地を交換し、顕微鏡下で毎日観察します。
    3. 14日目に、100 ng / mLのFGF-8bと1 μMのプルモルファミン(PM)を添加した12 mLのCDMを追加します。インキュベーターのオービタルシェーカーに皿を置きます。
    4. 15〜20日目に、2日ごとに培地を交換し、顕微鏡下で細胞を毎日観察します。
    5. 1000 μLのチップを使用して球体を機械的に通過させ、大きな球体を分解します。
      注:比率は1:2(1つの皿を2つの新しい皿に)にすることができます。
  6. 差別化の終了
    1. 以下に説明するように、6ウェルプレートまたはカバーガラスにポリ-L-オルニチン(PLO)とラミニンをコーティングします。
      1. 6ウェルプレートにウェルあたり1 mLのPLOをコーティングし、プレートを37°Cで20分間インキュベートします。PLO溶液を吸引します。
      2. プレートをUV下で20分間滅菌します。ウェルをDPBS(1x)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で2回すすぎます。
      3. 5 μg/mL ラミニン溶液 (6 ウェルプレートで 1 mL/ウェル) をウェルに加え、37 °C で 2 時間インキュベートします。ラミニンを吸引し、プレーティング前にDPBS(1x)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)でウェルを短時間洗浄します。
    2. すべての球体(ステップ1.5.5から)を50 mLチューブに集め、DPBS(1x)を補充します。300 × g で5分間回転します。上澄み液を吸引する。
    3. 2 mLの細胞解離試薬( 材料表を参照)とともに、水浴中37°Cで10分間インキュベートした後、200 μLのピペットで穏やかに粉砕します(球のサイズに応じて20〜50倍、気泡の形成を回避)。
    4. 細胞解離試薬を2 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清(FBS)で中和し、細胞を含む50 mLコニカルチューブを300 × g でRTで5分間遠心分離します。 上清を吸引します。
    5. 10 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)および10 ng/mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)を添加した1 mLのCDMを加え、穏やかに上下にピペッティングして細胞ペレットを再懸濁し、単一細胞懸濁液を得ます。
    6. プレートからラミニン溶液を吸引し(ステップ1.6.1.3)、DPBS(1x)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で短時間洗浄し、10 ng/mL BDNFと10 ng/mL GDNFを添加した3 mLのCDMでプレコートプレートまたはカバーガラスに細胞を播種します(ステップ1.6.5から)。4日ごとに細胞を供給します。
      注:分化培養は、3ヶ月まで何週間も維持することができます。神経形態は通常、終了から2週間後に現れ、その時点以降のダウンストリーム分析に使用できます。BDNFおよびGDNFは、より長い維持(最大2ヶ月)のための培養には必要ありません。
  7. NSC世代
    1. マトリックスプレートをコーティングします。
    2. すべての神経球(ステップ1.4から生成)を50 mLチューブに集め、DPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+フリー)を補充します。300 × gで5分間回転します。上清を吸引する。
    3. ペレットを2 mLの細胞解離試薬とともに水浴中37°Cで10分間インキュベートした後、200 μLのピペットで穏やかに粉砕します(球のサイズに応じて20〜50倍、気泡の形成を回避)。
    4. 10%FBSを含む2 mLのDMEMで中和し、細胞を含む50 mLのコニカルチューブを300 × g でRTで5分間遠心分離します。 上清を吸引します。細胞ペレットを穏やかに上下にピペッティングして再懸濁し、単一細胞懸濁液を得ます。
    5. プレコートプレートからマトリックス溶液を吸引し、プレコートプレート内の細胞をNSC SF培地(6ウェルプレートでウェルあたり3 mL)に播種します。2〜3日ごとに細胞に餌を与え、コンフルエントになったら細胞を分割します。
      注:この段階以降、NSCは拡張および凍結できます。
  8. グリア星状細胞分化
    1. NSCからの星状細胞分化
      1. 500 mLのアストロサイト分化培地を調製します。
      2. NSC SF培地を使用して、ポリD-リジン(PDL)コーティングされたプレート/カバーガラスにNSCをシードします。
      3. 翌日、細胞をDPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+フリー)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で洗い流し、アストロサイト分化培地(6ウェルプレートでウェルあたり3 mL)を追加します。0 日目として設定します。
      4. NSCを顕微鏡下で毎日観察し、1日目から27日目まで2日ごとにアストロサイト分化培地(6ウェルプレートのウェルあたり3 mL)を交換します。
    2. アストロサイトの成熟
      1. アストロサイト成熟培地を準備します。
      2. 28日目に、細胞をDPBS(1x)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で洗い流し、アストロサイト成熟培地(6ウェルプレートでウェルあたり3 mL)を追加します。
      3. 29日目以降、顕微鏡下で細胞を毎日観察し、2日ごとにアストロサイト成熟培地(6ウェルプレートでウェルあたり3 mL)を交換します。
      4. 1ヶ月の成熟後、細胞を拡張し、この段階から凍結保存します。
        注:このフェーズでは、セルの数が増えます。細胞を分割する場合、培養にPDLコーティングされたカバーガラスは必要ありません。

2. 免疫細胞化学および免疫蛍光染色による細胞特性評価

  1. 培養期間の終了時に、細胞の入ったカバーガラスを12ウェルプレートに移します。
    細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1x)で2回リンスし、RTで4%パラホルムアルデヒド(PFA)(12ウェルプレートでウェルあたり0.5 mL)中で10分間インキュベートします。
    注:固定サンプルは2 mLのPBS(1x)で覆い、免疫染色が必要になるまで4°Cで保存できます。PFAは有毒であり、癌を引き起こす疑いがあります。皮膚や目の露出を防ぎ、化学ヒュームフードの下で作業します。
  2. 細胞をブロックして透過処理し、PBS(1x)、0.3%Triton X-100、および10%正常ヤギ血清を含むブロッキングバッファーでRTで1時間インキュベートします。
  3. 一次抗体をブロッキングバッファー中で4°Cで一晩インキュベート:抗八量体結合転写因子4(Oct4)および抗ステージ特異的胚性抗原-4(SSEA4)でiPS細胞を染色し、抗性決定領域Yボックス-2(Sox2)および抗ネスチンを有するNSC、反対ボックス-6(Pax6)および抗ネスチンを有する神経球、抗グリア線維酸性タンパク質(GFAP)および抗S100カルシウム結合タンパク質β(S100β)を有する星状細胞、および抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)を有するDAニューロンを染色する。 抗β IIIチューブリン(Tuj 1)、抗シナプトフィジン、および抗PSD-95(12ウェルプレートのウェルあたり0.5 mLの一次抗体溶液;詳細については材料 表 を参照)。
  4. サンプルをPBS(1x)で3回、それぞれ10分間、穏やかに揺らしながら洗浄します。
  5. 二次抗体溶液(ブロッキングバッファー中1:800、12ウェルプレートのウェルあたり0.5 mLのAlexa Fluor二次抗体溶液)で、穏やかに揺らしながらRTで1時間インキュベートします。
  6. 細胞を Hoechst 33342 (1:5,000, 12 ウェルプレートでウェルあたり 0.5 mL) の PBS (1x) で RT で 15 分間インキュベートし、核を標識します。
  7. 細胞を封入培地でマウントし、RTで一晩乾燥させて、暗所の蛍光顕微鏡下でイメージングします。顕微鏡の設定とパラメータについては、 補足図S1 を参照してください。

3. フローサイトメトリーによる生細胞におけるミトコンドリア容積、MMP、ミトコンドリアROSの測定

  1. 細胞が50%〜60%のコンフルエントに達するまで、細胞を6ウェルプレートの4つのウェルに別々に播種します。これら 4 つのウェルに #1、#2、#3、および #4 というラベルを付けます。
  2. 培養期間の終了時に、以下のように5つの個別の染色溶液(6ウェルプレートでウェルあたり500 μL)を調製します:#1のみの培養培地(コントロール用の細胞のみを含むウェル#1へ);FCCP(100μM)を含む#2-1;培養液中にFCCP(100 μM)+ TMRE(100 nM)+ MTG(150 nM)を含む#2-2;培養液中にTMRE(100 nM)+ MTG(150 nM)を含む#3;#4は、10%FBSを含むPBS(1x)中のマイトソックスレッド(10μM)+ MTG(150nM)を含む。これらの化合物およびフローサイトメトリーのセットアップの詳細については、 図1A、 補足表S2、および 材料表 を参照してください。
    注:培養液を使用して染色液を調製します。使用する前に、RTで培地とPBS(1x)をウォームアップしてください。FCCPは有毒です。皮膚や目の露出を防ぎ、化学ヒュームフードの下で作業します。
  3. #2ウェルから培地を吸引し、#2-1溶液を追加します(FCCPのみ)。細胞を37°Cで10分間インキュベートします。
  4. #2および#3ウェルから培地を吸引し、#2ウェルに#2-2溶液(FCCP + TMRE + MTG)を、#3ウェルに#3溶液(TMRE + MTG)を追加します。細胞を37°Cで45分間インキュベートします。
  5. #4ウェルから培地を吸引し、#4溶液(マイトソックスレッド+ MTG)を追加します。細胞を37°Cで15分間インキュベートします。
  6. すべてのウェルから培地を吸引します。PBS(1x)(6ウェルプレートでウェルあたり4 mL)で洗浄します。1 mLの細胞解離試薬(6ウェルプレートに1 mL/ウェル)を使用して、37°Cで5分間細胞を剥離します。1 mL の DMEM 中の細胞解離試薬を 10% FBS で中和します (6 ウェルプレートでウェルあたり 2 mL)。
  7. すべてのウェルの内容物を15 mLコニカルチューブに集めます。チューブを300 × g で5分間遠心分離します。ペレットをPBS(1x)で1〜2回洗浄します。
  8. 上清を吸引しますが、チューブ内に約100μLを残します。細胞ペレットを300 μLのPBS(1x)に再懸濁します。細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。RTではチューブを暗所に置いてください。
  9. フローサイトメーター(青色3個と赤色1個のレーザー構成)を使用して細胞を分析します。530/30バンドパスフィルターを使用してフィルター1(FL1)のMTG、バンドパスフィルター585/40を使用してフィルター2(FL2)のTMRE、および510/580バンドパスフィルターを使用してフィルター3(FL3)のMitoSox Redを検出します。

4. 固定細胞におけるMRC複合体サブユニットおよびTFAMのフローサイトメトリー測定

  1. 培養期間の終了時に、細胞解離試薬を添加して細胞を剥離します(~106)。その後、ペレット化し、細胞を15mLチューブに回収する。PBS(1x)で2回遠心分離し、300 × gで5分間遠心分離して細胞を洗浄します。
  2. 細胞を1.6%PFA(15 mLチューブに1 mLの1.6%PFA)でRTで10分間固定します。PBS(1x)で2回遠心分離し、300 × gで5分間遠心分離して細胞を洗浄します。
  3. 氷冷した90%メタノール(15 mLチューブに1 mLの90%メタノール)を-20°Cで20分間透過処理します。
  4. 0.3 Mグリシン、5%ヤギ血清、および1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むブロッキングバッファーでサンプルをブロックします-PBS中のフラクションV(1x)(15 mLチューブ内の1 mLブロッキングバッファー)。PBS(1x)で2回遠心分離して細胞を洗浄します(ステップ3.7と同様)。
  5. 複合体Iサブユニットの測定には抗NDUFB10(1:1,000)、複合体IIサブユニットの測定には抗コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラビンタンパク質サブユニットA(SDHA、1:1,000)、複合体IVサブユニットの測定には抗COX IV(1:1,000)、Alexa Fluor 488(1:400)と結合させた抗TFAM抗体を30分間インキュベートします。Alexa Fluor 488(1:400)を結合させた抗TOMM20抗体で、同数の細胞を別々に30分間染色します(15 mLチューブに1 mLの一次抗体溶液を入れます;抗体の詳細については、 材料の表 を参照してください)。
  6. 細胞をPBS(1x)で1回洗浄し、300 × g で5分間遠心分離します。二次抗体(1:400)をNDUFB10、SDHA、およびCOX IVのチューブに加え、これらの溶液で細胞を30分間インキュベートします。
  7. 細胞をPBS(1x)で300 × g で5分間遠心分離して1回洗浄します。上清を吸引し、チューブ内に約100μLを残します。細胞ペレットを300 μLのPBS(1x)に再懸濁します。氷上で暗所に保持した1.5 mLマイクロ遠心チューブに細胞を移します。
  8. フローサイトメーターで細胞を分析します(3つの青と1つの赤のレーザー構成)。530/30バンドパスフィルタを使用してフィルタ1(FL1)の信号を検出します。顕微鏡の設定とパラメータについては、 補足図S2 を参照してください。

5. フローサイトメトリーの取得と分析

  1. 非染色コントロールチューブを使用して、分析する細胞集団のサイズと複雑さに基づいて、前方散乱領域(FSC-A)および側方散乱領域(SSC-A)散布図を設定します。顕微鏡の設定とパラメータについては、 補足図S2 を参照してください。
    注:個々の細胞タイプに対して染色されていないコントロールを設定します。
  2. ノンステインコントロールチューブを使用してポジティブゲートを選択し、単色コントロールチューブを使用して、マルチカラーフローサイトメトリーでMTG(フルオロフォア-1 [FL-1])とTMRE(FL-2)の間の蛍光スペクトルのオーバーラップを補正します。ネガティブコントロールにアイソタイプコントロールを使用して、MRCおよびTFAMサンプルのバックグラウンド染色を監視します。TMRE染色の脱分極コントロールとしてFCCPチューブを使用してください。
  3. 無関係な破片をゲートアウトして、前方および側方散乱プロットから生細胞とメインゲーティングを選択します(図2A)。順方向散乱高さ(FSC-H)対FSC-A密度プロットを使用してダブレットをゲートアウトし、ダブレットを除外し、側面散乱高さ(SSC-H)対SSC-Aプロットを作成します(図2A)。
  4. データ収集(フローサイトメーター)
    1. 染色されていないサンプルまたはアイソタイプサンプルをネガティブコントロールとして使用し、SSC-Aとさまざまなフィルター(FL1、FL2、FL3、FL4)を見ながら、シングルセルイベントのメインポピュレーションの上にゲートを作成します(図1Bおよび図2B)。
  5. データ解析(CFlowソフトウェア)
    1. ゲートの位置を染色した細胞サンプルにコピーし、陽性染色のために陽性染色された細胞の量を記録します。
    2. 各細胞亜集団について、ヒストグラムプロットを選択し、異なるフィルターチャンネル(FL1、FL2、FL3、FL4)(x軸)の中央値蛍光強度(MFI)を分析します。
      1. 以下の式(1)のように、ヒストグラムで#3 TMRE染色サンプルからのFL2のMFIから#2 FCCP処理細胞のFL2のMFIを差し引くことにより、TMREレベルを計算します。
        TMREレベル = #3 TMRE染色サンプルからのFL2のMFI - #2 FCCP処理細胞のFL2のMFI (1)
      2. TMREまたはMitoSox RedのMFIによってMMPおよびミトコンドリアROSの特定の値を計算し、ミトコンドリア体積指標MTGを除算します。
      3. 複素発現またはTFAMのMFIを使用して、ミトコンドリア体積指標TOMM20を除算することにより、複素サブユニットおよびTFAMの特定の値を計算します。

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Results

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分化法およびフローサイトメトリー戦略の概略説明を 図3に示す。ヒトiPS細胞は神経ロゼットに分化した後、浮遊培養に持ち上げて神経球に分化させます。神経球はさらに分化し、DAニューロンに成熟する。神経球は単一細胞に解離してグリア星状細胞を生成し、NSCとして単層に再播種した後、星状細胞に分化します。このプロトコルは、MMP、ミトコンドリア容積、ミトコンドリアROSレベル、MRC複合体サブユニットの発現レベル、およびTFAM(相対mtDNAコピー数の間接測定)を測定するためのフローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に必要な戦略を提供します。具体的には、蛍光レポーターであるTMREおよびMTGとの共染色を使用して、MMPおよびミトコンドリア体積の変化を検出および定量化しました。MitoSox RedおよびMTGとの共染色により、生細胞におけるミトコンドリアROS産生の測定が可能になります。MRC複合体サブユニットに対する抗体をTOMM20と一緒に染色することで、MRCの評価と、mtDNAコピー数の間接的な評価のためのTFAMおよびTOMM20の染色が可能になります。重要なことに...

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Discussion

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ここでは、iPS細胞由来のニューロンおよびアストロサイトを生成し、フローサイトメトリーを使用してミトコンドリア機能の複数の側面を評価するためのプロトコルを示します。これらのプロトコルにより、ヒトiPS細胞をニューロンとグリア星状細胞の両方に効率的に変換し、主に生細胞におけるミトコンドリア機能の詳細な特性評価が可能になります。また、このプロトコルは、生細胞における体積、MMP、ミトコンドリアROSレベル、固定細胞におけるMRC複合体およびTFAMを含む、複数のミトコンドリア機能を取得および解析するための共染色フローサイトメトリーベースの戦略も提供します。具体的には、これらのプロトコルは、ミトコンドリア体積あたりの総レベルと特異的レベルの両方の推定を可能にします。この戦略は、DAニューロンおよびアストロサイトの既知のミトコンドリア病(POLG)におけるミトコンドリア機能障害を検出するが、これらの技術はあらゆるタイプの細胞および疾患に適用可能である。さらに、プロトコルは堅牢で再現性があります。いくつかの以前の研究では、このプロトコルを適用して、線維芽細胞、iPSC、NSC、DAニューロン、および星状細胞のミトコンドリアの変化を分析することに成...

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Disclosures

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著者は開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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ノルウェーのベルゲン大学の分子イメージングセンターとフローサイトメトリーコア施設に感謝します。この研究は、ノルウェー研究評議会(助成金番号:229652)、Rakel og Otto Kr.Bruuns legat、および中国奨学金評議会(プロジェクト番号:201906220275)からの資金提供によって支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Primary Antibody; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗マウスIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11005)を二次抗体として。
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Primary Antibody; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗 Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗ネスチンSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994一次抗体; 1:50, 20 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗マウスIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11005)を二次抗体として。
抗GFAPAbcam ab4674, RRID:AB_304558一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液; Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗ニワトリIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11042)を二次抗体として。
アンチS100β Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Primary Antibody; 1:400, 2.5 μ1000 の L μL染色液;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Primary Antibody; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Primary Antibody; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗マウスIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11005)を二次抗体として。
抗SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液; Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗ニワトリIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11042)を二次抗体として。
Alexa Fluor 488Abcamab198308;1:400, 2.5 μ1000 の L μL染色液;マウスモノクローナルIgG2bを使用 アレクサフロー®アイソタイプコントロールとしての488。
Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381; 1:400, 2.5 μ1000 の L μL染色液;マウスモノクローナルIgG2aを使用 アレクサフロー®アイソタイプコントロールとしての488。
抗NDUFB10Abcamab196019一次抗体; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) を二次抗体として;ウサギモノクローナルIgGをアイソタイプコントロールとして使用します。
抗SDHAAbcamab137040一次抗体; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液; Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) を二次抗体として;ウサギモノクローナルIgGをアイソタイプコントロールとして使用します。
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Primary Antibody; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液;使用する アレクサフロー ®488ヤギ抗マウスIgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) を二次抗体として;アイソタイプコントロールとしてマウスモノクローナルIgGを使用します。
アクチビンAPeproTech120-14Eアストロサイト分化培地
成分 ABM 基礎培地ロンザCC-3187アストロサイト培養用基礎培地
AGM SingleQuots サプリメントパックロンザCC-4123アストロサイト培養用サプリメント
抗生物質-抗真菌サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062CDM 成分
アドバンスドDMEM/F-12サーモフィッシャーサイエンティフィ12634010希薄なゲルトレックス
ウシ血清アルブミンヨーロッパバイオプロダクツEQBAH62-1000免疫染色アッセイおよびCDM成分における抗体の非特異的結合を防ぐブロッキング剤
BDNFPeproTech450-02DAニューロン 培地成分
B-27 サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック 17504044アストロサイト分化培地成分
BD Accuri C6 Plus Flow CytometerBD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrateサーモフィッシャーサイエンティフィック11905031CDM成分
コラゲナーゼIVサーモフィッシャーサイエンティフィック17104019ヒトiPS細胞を穏やかに解離させる試薬
CCD顕微鏡カメラ ライカ DFC3000 GライカMicrosystems, ドイツ
コーニング 未処理培養ディッシュSigma-AldrichCLS430589懸濁培養
DPBSサーモフィッシャーサイエンティフィック14190250さまざまな細胞培養洗浄に使用
DMEM/F-12、GlutaMAX サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック10565018アストロサイト分化基礎培地
EDTAサーモフィッシャーヒトiPS細胞を穏やかに解離するための15575020
エッセンシャル8 基礎培地サーモフィッシャーサイエンティフィックA1516901iPS細胞培養用基礎培地
エッセンシャル8サプリメント(50倍)サーモフィッシャーサイエンティフィックiPS細胞培養用A1517101サプリメント
EGF組換えヒトタンパク質サーモフィッシャーサイエンティフィックPHG0314NSC培養用サプリメント
FGF基本(AA 10–155) 組換えヒトタンパク質サーモフィッシャーサイエンティフィックNSC培養用PHG0024サプリメント
ウシ胎児血清Sigma-Aldrich12103C中性成分
FGF-basicPeproTech100-18Bアストロサイト分化 中性成分
FCCPAbcamab120081ミトコンドリア膜電位とTMRE
染色を排除流体吸引システム BVC制御Vacuubrand, Germany
ホルムアルデヒド (PFA) 16%サーモフィッシャーサイエンティフィック28908細胞固定
ゲルトレックスサーモフィッシャーサイエンティフィック A1413302ヒトiPS細胞の接着とメンテナンスに使用
GlutaMAX SupplementサーモフィッシャーサイエンティNSC培養用35050061
GDNFPeprotech450-10DA ニューロン 培地 成分
グリシンSigma-AldrichG8898ブロッキングバッファーに使用
ハムのF-12 栄養ミックスサーモフィッシャーサイエンティフィック31765027CDM用基礎培地
ヘレグリンβ-1ヒトSigma-AldrichSRP3055アストロサイト分化培地 原料
ヘキスト 33342サーモフィッシャーScientificH1399共焦点画像のための核の染色
Heracell 150i CO2 インキュベーターFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher ScientificScientific 21980032Basal medium for CDM
InsulinRoche1376497CDM ingredient
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
インスリン様成長因子-I ヒトSigma-AldrichI3769アストロサイト分化培地 成分
ノックアウトDMEM/F-12培地サーモフィッシャーサイエンティフィック12660012NSC培養用基礎培地
LamininSigma-AldrichL2020in vitroで神経細胞の接着と増殖を促進
ライカTCS SP8 STED共焦点顕微鏡ライカマイクロシステムズドイツ
モノチオグリセロールSigma-AldrichM6145CDM成分
MitoTracker Green FMサーモフィッシャーサイエンティフィックM7514ミトコンドリアボリュームインジケーターに使用
MitoSox レッドサーモフィッシャーサイエンティフィックM36008ミトコンドリアROSインジケーターに使用
N-アセチル-L-システインSigma-AldrichA7250ニューラル誘導培地成分
N-2 サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック17502048アストロサイト分化培地成分
ノーマルヤギ血清サーモフィッシャーサイエンティフィックPCN5000ブロッキングバッファーに使用
オービタルシェーカー - SSM1スチュアート機器、英国
ポリ-L-オルニチン溶液シグマ-アルドリッチP4957in vitro で神経細胞の接着と増殖を促進
Poly-D-lysine 臭化水素酸塩Sigma-AldrichP7405in vitro 神経細胞の接着と増殖を促進
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204DAニューロンの分化を促進
ProLong Gold 退色防止封入剤Thermo Fisher ScientificP36930共焦点画像の
カバースリップの取り付けPBS 1xサーモフィッシャーサイエンティフィック18912014さまざまな洗浄に使用
組換えヒト/マウス FGF-8b タンパク質R&Dシステムズ 423-F8-025/CFDAニューロン分化促進
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPニューラルインダクション 培地成分
StemPro ニューラルサプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィックA10508-01NSCs培養サプリメント
TrypLE Express 酵素サーモフィッシャーサイエンティフィック12604013細胞解離試薬
トランスフェリンロシュ652202CDM 成分
TRITON X-100VWR International9002-93-1免疫染色アッセイにおける細胞透過化に使用
TMREAbcamab113852ミトコンドリア膜電位染色に使用
ウォーターバス Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Primary Antibodyと結合した抗TFAM抗体 一次抗体と結合した抗 TOMM20剤 ック 科学試薬フィック サプリメント

References

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