Method Article

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアは、多くの神経変性疾患の病態生理学において重要である。ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位(MMP)、活性酸素種のミトコンドリア産生(ROS)、およびミトコンドリアDNA(mtDNA)コピー数の変化は、多くの場合、これらのプロセスの特徴です。このレポートでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)やiPS細胞由来の神経細胞やグリア細胞など、さまざまな細胞タイプで複数のミトコンドリアパラメータを測定するための新しいフローサイトメトリーベースのアプローチについて詳しく説明します。このフローベースの戦略では、生細胞を使用してミトコンドリア体積、MMP、およびROSレベルを測定し、固定細胞を使用してミトコンドリア呼吸鎖(MRC)の成分とミトコンドリア転写因子A(TFAM)などのmtDNA関連タンパク質を推定します。

MitoTracker Green(MTG)、テトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE)、MitoSox Redなどの蛍光レポーターと共染色することにより、ミトコンドリア体積、MMP、およびミトコンドリアROSの変化を定量化し、ミトコンドリア含有量に関連付けることができます。MRC複合体サブユニットおよび外ミトコンドリア膜20のトランスロカーゼ(TOMM20)に対する抗体による二重染色は、MRCサブユニット発現の評価を可能にする。TFAMの量はmtDNAコピー数に比例するため、TOMM20あたりのTFAMの測定は、ミトコンドリア体積あたりのmtDNAの間接的な測定値を提供します。プロトコル全体は2〜3時間以内に実行できます。重要なことに、これらのプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、ミトコンドリア体積あたりの総レベルと特定のレベルの両方でミトコンドリアパラメータの測定を可能にします。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアは、ほとんどすべての真核細胞に存在する必須の細胞小器官です。ミトコンドリアは、酸化的リン酸化を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成することによってエネルギー供給に関与し、生合成と代謝の代謝仲介者として機能します。ミトコンドリアは、ROSの生成、細胞死、細胞内Ca2+調節など、他の多くの重要な細胞プロセスに深く関与しています。ミトコンドリア機能障害は、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、ハンチントン病(HD)、フリードライヒ運動失調症(FRDA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)など、さまざまな神経変性疾患と関連しています1。ミトコンドリア機能障害の増加とmtDNA異常も、人間の老化に寄与すると考えられています2,3。

神経変性疾患では様々なタイプのミトコンドリア機能障害が起こり、ミトコンドリア容積の変化、MMP脱分極、ROSの産生、mtDNAコピー数の変化が一般的です4,5,6,7。したがって、これらおよび他の....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意: このプロトコルで使用されるすべての培地と溶液のレシピについては、 材料の 表と 補足表S1 を参照してください。

1. ヒトiPS細胞のNCS、ドーパミン作動性(DA)ニューロン、アストロサイトへの分化

  1. マトリックスコーティングされたプレートを準備します。
    1. 5 mLのマトリックスのバイアルを氷上で一晩解凍します。1 mLのマトリックスを99 mLのコールドアドバンストダルベッコのモディファイドイーグルミディアム/ハムのF-12(アドバンストDMEM / F12)(1%の最終濃度)で希釈します。.1mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。
    2. マトリックス溶液を4°Cで解凍し(保冷)、6ウェルをコーティングします(6ウェルプレートに1ウェルあたり1 mL)。
    3. マトリックスコーティングされたプレートを加湿した5%CO2/95%エアインキュベーターに入れ、37°Cで1時間待ちます。プレートをインキュベーターから取り出し、室温(RT)に平衡化させます。
      注意: コーティングから3日以内にプレートを使用することをお勧めします。ただし、コーティングされたプレートは4°Cで最大2週間保存できます。 使用する前に、それを取り出してRTまで温めることを忘れないでください。長期間....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分化法およびフローサイトメトリー戦略の概略説明を 図3に示す。ヒトiPS細胞は神経ロゼットに分化した後、浮遊培養に持ち上げて神経球に分化させます。神経球はさらに分化し、DAニューロンに成熟する。神経球は単一細胞に解離してグリア星状細胞を生成し、NSCとして単層に再播種した後、星状細胞に分化します。このプロトコルは、MMP、ミトコンドリア容積、ミトコンドリアROSレベル、MRC複合体サブユニットの発現レベル、およびTFAM(相対mtDNAコピー数の間接測定)を測定するためのフローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に必要な戦略を提供します。具体的には、蛍光レポーターであるTMREおよびMTGとの共染色を使用して、MMPおよびミトコンドリア体積の変化を検出および定量化しました。MitoSox RedおよびMTGとの共染色により、生細胞におけるミトコンドリアROS産生の測定が可能になります。MRC複合体サブユニットに対する抗体をTOMM20と一緒に染色することで、MRCの評価と、mtDNAコピー数の間接的な評価のためのTFAMおよびTOMM20の染色が可能になります。重要なことに.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、iPS細胞由来のニューロンおよびアストロサイトを生成し、フローサイトメトリーを使用してミトコンドリア機能の複数の側面を評価するためのプロトコルを示します。これらのプロトコルにより、ヒトiPS細胞をニューロンとグリア星状細胞の両方に効率的に変換し、主に生細胞におけるミトコンドリア機能の詳細な特性評価が可能になります。また、このプロトコルは、生細胞における体積、MMP、ミトコンドリアROSレベル、固定細胞におけるMRC複合体およびTFAMを含む、複数のミトコンドリア機能を取得および解析するための共染色フローサイトメトリーベースの戦略も提供します。具体的には、これらのプロトコルは、ミトコンドリア体積あたりの総レベルと特異的レベルの両方の推定を可能にします。この戦略は、DAニューロンおよびアストロサイトの既知のミトコンドリア病(POLG)におけるミトコンドリア機能障害を検出するが、これらの技術はあらゆるタイプの細胞および疾患に適用可能である。さらに、プロトコルは堅牢で再現性があります。いくつかの以前の研究では、このプロトコルを適用して、線維芽細胞、iPSC、NSC、DAニューロン、および星状細胞のミトコンドリアの変化を分析することに成.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ノルウェーのベルゲン大学の分子イメージングセンターとフローサイトメトリーコア施設に感謝します。この研究は、ノルウェー研究評議会(助成金番号:229652)、Rakel og Otto Kr.Bruuns legat、および中国奨学金評議会(プロジェクト番号:201906220275)からの資金提供によって支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Primary Antibody; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗マウスIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11005)を二次抗体として。
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Primary Antibody; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗 Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗ネスチンSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994一次抗体; 1:50, 20 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗マウスIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11005)を二次抗体として。
抗GFAPAbcam ab4674, RRID:AB_304558一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液; Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗ニワトリIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11042)を二次抗体として。
アンチS100β Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Primary Antibody; 1:400, 2.5 μ1000 の L μL染色液;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Primary Antibody; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Primary Antibody; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗マウスIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11005)を二次抗体として。
抗SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11008)を二次抗体として。
抗PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248一次抗体; 1:100, 10 μ1000 の L μL染色液; Alexa Fluorを使用®594ヤギ抗ニワトリIgG(1:800、サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ#A-11042)を二次抗体として。
Alexa Fluor 488Abcamab198308;1:400, 2.5 μ1000 の L μL染色液;マウスモノクローナルIgG2bを使用 アレクサフロー®アイソタイプコントロールとしての488。
Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381; 1:400, 2.5 μ1000 の L μL染色液;マウスモノクローナルIgG2aを使用 アレクサフロー®アイソタイプコントロールとしての488。
抗NDUFB10Abcamab196019一次抗体; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液;Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) を二次抗体として;ウサギモノクローナルIgGをアイソタイプコントロールとして使用します。
抗SDHAAbcamab137040一次抗体; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液; Alexa Fluorを使用®488ヤギ抗ウサギIgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) を二次抗体として;ウサギモノクローナルIgGをアイソタイプコントロールとして使用します。
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Primary Antibody; 1:1000, 1 μ1000 の L μL染色液;使用する アレクサフロー ®488ヤギ抗マウスIgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) を二次抗体として;アイソタイプコントロールとしてマウスモノクローナルIgGを使用します。
アクチビンAPeproTech120-14Eアストロサイト分化培地
成分 ABM 基礎培地ロンザCC-3187アストロサイト培養用基礎培地
AGM SingleQuots サプリメントパックロンザCC-4123アストロサイト培養用サプリメント
抗生物質-抗真菌サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062CDM 成分
アドバンスドDMEM/F-12サーモフィッシャーサイエンティフィ12634010希薄なゲルトレックス
ウシ血清アルブミンヨーロッパバイオプロダクツEQBAH62-1000免疫染色アッセイおよびCDM成分における抗体の非特異的結合を防ぐブロッキング剤
BDNFPeproTech450-02DAニューロン 培地成分
B-27 サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック 17504044アストロサイト分化培地成分
BD Accuri C6 Plus Flow CytometerBD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrateサーモフィッシャーサイエンティフィック11905031CDM成分
コラゲナーゼIVサーモフィッシャーサイエンティフィック17104019ヒトiPS細胞を穏やかに解離させる試薬
CCD顕微鏡カメラ ライカ DFC3000 GライカMicrosystems, ドイツ
コーニング 未処理培養ディッシュSigma-AldrichCLS430589懸濁培養
DPBSサーモフィッシャーサイエンティフィック14190250さまざまな細胞培養洗浄に使用
DMEM/F-12、GlutaMAX サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック10565018アストロサイト分化基礎培地
EDTAサーモフィッシャーヒトiPS細胞を穏やかに解離するための15575020
エッセンシャル8 基礎培地サーモフィッシャーサイエンティフィックA1516901iPS細胞培養用基礎培地
エッセンシャル8サプリメント(50倍)サーモフィッシャーサイエンティフィックiPS細胞培養用A1517101サプリメント
EGF組換えヒトタンパク質サーモフィッシャーサイエンティフィックPHG0314NSC培養用サプリメント
FGF基本(AA 10–155) 組換えヒトタンパク質サーモフィッシャーサイエンティフィックNSC培養用PHG0024サプリメント
ウシ胎児血清Sigma-Aldrich12103C中性成分
FGF-basicPeproTech100-18Bアストロサイト分化 中性成分
FCCPAbcamab120081ミトコンドリア膜電位とTMRE
染色を排除流体吸引システム BVC制御Vacuubrand, Germany
ホルムアルデヒド (PFA) 16%サーモフィッシャーサイエンティフィック28908細胞固定
ゲルトレックスサーモフィッシャーサイエンティフィック A1413302ヒトiPS細胞の接着とメンテナンスに使用
GlutaMAX SupplementサーモフィッシャーサイエンティNSC培養用35050061
GDNFPeprotech450-10DA ニューロン 培地 成分
グリシンSigma-AldrichG8898ブロッキングバッファーに使用
ハムのF-12 栄養ミックスサーモフィッシャーサイエンティフィック31765027CDM用基礎培地
ヘレグリンβ-1ヒトSigma-AldrichSRP3055アストロサイト分化培地 原料
ヘキスト 33342サーモフィッシャーScientificH1399共焦点画像のための核の染色
Heracell 150i CO2 インキュベーターFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher ScientificScientific 21980032Basal medium for CDM
InsulinRoche1376497CDM ingredient
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
インスリン様成長因子-I ヒトSigma-AldrichI3769アストロサイト分化培地 成分
ノックアウトDMEM/F-12培地サーモフィッシャーサイエンティフィック12660012NSC培養用基礎培地
LamininSigma-AldrichL2020in vitroで神経細胞の接着と増殖を促進
ライカTCS SP8 STED共焦点顕微鏡ライカマイクロシステムズドイツ
モノチオグリセロールSigma-AldrichM6145CDM成分
MitoTracker Green FMサーモフィッシャーサイエンティフィックM7514ミトコンドリアボリュームインジケーターに使用
MitoSox レッドサーモフィッシャーサイエンティフィックM36008ミトコンドリアROSインジケーターに使用
N-アセチル-L-システインSigma-AldrichA7250ニューラル誘導培地成分
N-2 サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック17502048アストロサイト分化培地成分
ノーマルヤギ血清サーモフィッシャーサイエンティフィックPCN5000ブロッキングバッファーに使用
オービタルシェーカー - SSM1スチュアート機器、英国
ポリ-L-オルニチン溶液シグマ-アルドリッチP4957in vitro で神経細胞の接着と増殖を促進
Poly-D-lysine 臭化水素酸塩Sigma-AldrichP7405in vitro 神経細胞の接着と増殖を促進
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204DAニューロンの分化を促進
ProLong Gold 退色防止封入剤Thermo Fisher ScientificP36930共焦点画像の
カバースリップの取り付けPBS 1xサーモフィッシャーサイエンティフィック18912014さまざまな洗浄に使用
組換えヒト/マウス FGF-8b タンパク質R&Dシステムズ 423-F8-025/CFDAニューロン分化促進
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPニューラルインダクション 培地成分
StemPro ニューラルサプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィックA10508-01NSCs培養サプリメント
TrypLE Express 酵素サーモフィッシャーサイエンティフィック12604013細胞解離試薬
トランスフェリンロシュ652202CDM 成分
TRITON X-100VWR International9002-93-1免疫染色アッセイにおける細胞透過化に使用
TMREAbcamab113852ミトコンドリア膜電位染色に使用
ウォーターバス Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Primary Antibodyと結合した抗TFAM抗体 一次抗体と結合した抗 TOMM20剤 ック 科学試薬フィック サプリメント

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al.

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