方法論記事

ビリオ膵管へのタウロコール酸ナトリウムの逆行性注入を用いたマウス重症急性膵炎モデルの確立

DOI：

10.3791/63129

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2022年4月1日

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1Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 2MOE Engineering Center of Hematological Disease, Soochow University, 3Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, 4National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 5MOH Key Lab of Thrombosis and Hemostasis, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重篤な急性膵炎のマウスモデルが本明細書に記載されている。ここで提示された手順は非常に迅速で、単純で、アクセスしやすく、それによって潜在的に急性膵炎における分子メカニズムおよび異なる治療介入を便利な方法で研究することを可能にする。

要約

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急性膵炎(AP)、特に重度の急性膵炎(SAP)の有病率は、若い年齢層で毎年増加しています。しかしながら、現在の臨床現場では有効な治療法が不足している。トランスジェニック株およびノックアウト株の入手が容易で、そのサイズが小さく、 in vivo 評価に必要な薬物の投与量を最小限に抑えることができるため、マウスにおける十分に確立された実験モデルがAP研究に好まれます。さらに、タウロコール酸ナトリウム(TC)を介して誘導されたSAPは、現在、最も広く使用されており、最も特徴付けられるモデルの1つである。このモデルは、APのプロセス中の新規治療法および可能な分子事象について調査されている。ここでは、タウロコール酸ナトリウムと簡単な自家製マイクロシリンジを用いたAPマウスモデルの作製を紹介します。さらに、その後の組織学および血清学的検査のための方法論も提供する。

概要

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急性膵炎(AP)は、その異常に活性化された酵素によるその後の管膨満および膵臓自己消化を伴う主要な膵管の閉塞を特徴とする膵臓の急性炎症である。その臨床症状には、局所的または全身性の炎症、腹痛、および血清アミラーゼの上昇が含まれる1,2。重症度分類3によると、APは軽度、中等度、重篤な形態で存在する可能性があり、その中でも、重度の急性膵炎(SAP)は、30%を超える高い死亡率のために最も懸念される状態である4。米国では、AP通信が入院の最も一般的な理由の1つであり、20万人以上の患者に影響を与えています5。さらに、AP、特にSAPは年々増加しており、若い年齢層に影響を与えています6。しかし、現在の臨床現場では効果的な治療法の選択肢が不足しています6,7。そのため、APに関与する分子機構を探究する必要があり、治療改善が容易になる。

APに関与するメカニズムを研究し、さまざまな治療モダリティの有効性を評価するためには、十分に確立された実験動物モデルが必要です。トランスジェニック株およびノックアウト株の容易なアクセス性と、in vivo評価に必要な薬物の用量を最小限に抑える小さなサイズにより、マウスはAP研究に好まれています。したがって、APのいくつかのモデルがマウスで開発されている8,9。

Niederauらは、カエルレイン10の静脈内投与によって誘導された軽度の膵炎ラットモデルから研究し、注射経路と同じ薬剤を用いて誘導された腺房細胞壊死を提示するSAPマウスモデルを開発しました11。このモデルには、非侵襲性、迅速な誘導、広い再現性、および適用性を含むいくつかの利点がありますが、主な欠点は、ほとんどの場合、軽度の形態のAPのみが開発され、それによってその臨床的関連性が制限されることです。アルコールはAPの主要な病因の1つと考えられています。しかし、Foitzikらは、外分泌過剰刺激などの他の要因と組み合わされた場合にのみ膵臓損傷を引き起こすと報告した12。さらに、アルコール誘発APモデルは、異なる投与経路および薬物用量を介して開発されたことが報告されているが13、14、15、それらの主な欠点は、それらを再現することの難しさである。L-アルギニンの腹腔内投与はまた、マウスにおいてAPを誘導することができる16;しかし、その低い臨床的関連性は、その適用を妨げる。胆汁酸塩であるタウロコール酸塩は、膵管注入を介してヒトAPに似た状態を誘導するために、1965年にCreutzfeldらによって最初に提案された17。病態生理学におけるその臨床的関連性については論争が存在しますが18,19、タウロコール酸誘発膵炎は依然としてSAPにとって不可欠なモデルです。

このモデルは実現が簡単で、マウスでも有効であるため、現在では小動物のin vivo研究に最も使用されているAPモデルの1つです。Peridesらは、タウロコール酸ナトリウム(TC)を用いてマウス20においてSAPを誘導し、その病理を理解するための洞察を提供した。遺伝子改変技術と組み合わせることで、このモデルにより、APに関与するいくつかの特定の遺伝子を確認することができました。例えば、Bicozoらは、CD38遺伝子のノックアウトがTC注入膵炎のモデルに対して保護され、そのメカニズムを細胞内Ca2+シグナル伝達の変化に帰することを示した21。Fanczalらは、マウス膵臓腺房および乳管細胞の原形質膜におけるTRPM2発現の生理学的影響を調査し、TRPM2ノックアウトマウスにおけるTC誘導SAPの重症度の低下を実証した22。さらに、このモデルは、インビボで多くの新規薬物を試験するための簡単で効果的な方法も提供する。例えば、この方法は、カフェイン23、デヒドロコール酸24、および様々な抗酸化剤および抗凝固剤25,26の治療効果の検証を可能にした。この証拠は、TC誘導SAPモデルの汎用性を示しています。Wittelらは同様のマウスモデル27を記述したが、実装手順の詳細が欠けていると、所見を再現できなくなる可能性がある。この記事では、単純な自家製マイクロシリンジを使用する方法に焦点を当て、TC誘発SAPを研究することで、APの病因と治療のさらなる研究だけでなく、他の多くの物質に完全に適応可能な実験方法についても可能なガイダンスを提供します。

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プロトコル

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動物を含むすべての実験は、蘇州大学の動物倫理委員会によって承認されました。すべての外科的処置は、完全麻酔下で行った。鎮痛薬は、以前の文献によると、疾患の自然な経過への干渉を避けるために使用されなかった28,29。鎮痛の欠如に対する承認は、蘇州大学の動物倫理委員会によっても与えられました。

1. 準備

  1. C57BL/6野生型マウスを手術の8-12時間前に高速投与する。
  2. 0.9%塩化ナトリウムに希釈した5%(w / v)TC溶液(93mM)を調製する。溶液を0.22 μmフィルターでろ過します。
  3. オートクレーブ手術器具および材料、鉗子、はさみ、ブレードホルダー、ニードルホルダー、止血クリップ、血管クランプ、および滅菌ドレープを含む、圧力滅菌器を使用して、121°Cの温度で30分間。
  4. 自家製マイクロシリンジを準備する。これを行うには、使い捨てインスリンチップと延長プラスチックピペットチップを25μLの平らなチップマイクロリットルシリンジに手動で取り付けます。照射により滅菌する。

2.麻酔と術前準備

  1. 生後6~8週齢の雄性C57BL/6野生型マウス(約21~23g)の体重を量る。50mg / kgの用量で1%ペントバルビタールナトリウム溶液の腹腔内注射で全身麻酔を誘発する。
  2. マウスをテープでアニラディエイテッドフォーム平板の仰臥位に固定します。
  3. 毛様突起プロセスレベルから両側前上腸骨脊椎の接続線まで脱毛クリームで毛皮を除去し、左右の側面を前腋窩線に平行にすることによって、各動物の手術領域を準備する。
  4. 動物と外科医の前面に準備された領域からなる手術領域に特に焦点を合わせた滅菌手術野を準備する。
    1. ベンチトップを消毒します。
    2. 外科用スクラブ溶液の複数のアプリケーションで切開部位をきれいにする。0.5%ヨードフォールで皮膚を2〜3回拭き取り、毎回1〜2分間乾燥させます。
    3. マウスを滅菌ドレープで覆います。

3. 外科的処置

注: 図1 は、マイクロインジェクションによる胆道膵管へのTCの逆行性注入の前後のマウス膵臓の解剖学的および形態を描写する。

  1. 長さ約2〜3cmの中央腹部切開を行う。
  2. 胃に沿って十二指腸を左から右に見つけます。手術用鉗子と消毒剤を浸した綿棒を使用して十二指腸を静かに左側に引き出し、膵臓、胆道膵管、および十二指腸乳頭を露出させます。腸壁や関連血管を傷つけないように注意してください。
  3. 8-0 を使用します。乳頭の周りの十二指腸と膵臓の間の接続を通過するように縫合糸し、それらをマウス体の左側に引っ張って十二指腸を固定する。
  4. 皮膚と肝臓の下端をそっと脇に引き寄せます。一般的な肝管をクランプし、門脈や膵臓をクランプしないようにしてください。近位ビリオ膵管をクランプする。
  5. マイクロインジェクターを遠位胆道膵管に逆行的に突き刺す。十二指腸乳頭付近の針先をクランプで固定する。10 μL の 5% TC を膵管に 5 μL/minの割合で注入します。
  6. 安定した圧力を達成するために胆道膵管を5分間閉じたままにする。次に、マイクロインジェクターを引き出し、クランプを取り外します。
  7. 十二指腸を元の解剖学的位置に戻し、出血を確認する。
  8. 6-0の縫合糸で傷口を閉じ、0.5%ヨードフォアで消毒する。

4. 回復と術後管理

  1. 動物を37°Cのサーマルパッド上の麻酔から回収する。すべての動物が目を覚ますまで、手術を受けた動物を術後側室に送らないでください。
  2. 0.8 mLの0.9%生理食塩水を皮下およびゆっくりと投与して体液補給を行う。
  3. 動物の一般的な状態や感染症や病気の兆候について、術後に動物を監視します。

5. 血清学的検査と組織学的評価

  1. 手術後24時間で、同じ用量および注射経路を用いてペントバルビタールナトリウムでマウスを麻酔する。
  2. 腹部大動脈からすべての血液(マウスあたり約0.8mL)を収集し、1,500 x g で15分間スピンして血清を単離し、さらなる試験を行う。
  3. 膵臓組織を収集します。.
  4. 胸腔を開き、肺組織を採取する。
  5. アミラーゼ、リパーゼ、肝機能(アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST))、腎機能(尿素およびクレアチン)を含む血清からの生化学機能指数を、製造元の指示に従って市販のキットを使用して測定する。
  6. 肺および膵臓組織を均質化し、製造業者の指示に従って市販のキットを使用してミエロペルオキシダーゼ(MPO)レベルを測定する。
  7. 胸腔を開き、20mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回灌流し、膵臓を採取する。4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間浸漬する。一連のアルコール濃度で脱水し、パラフィンに埋め込む。
  8. ミクロトームを使用して、厚さ5μmの膵臓組織切片を作製する。
  9. 膵臓の組織学的評価のためにH&E染色を行う。
  10. Schmidt et al.30によって提案された基準に従って病理学的スコアを評価する。

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結果

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上記の指示に注意深く従うことによって、我々は約40分の平均手術期間を得た。マウスはわずかに不活性であり、手術後24時間、48時間および72時間でそれぞれ約0.5〜1.75g、0.85〜1.85gおよび0.5〜4.73gの体重を失った(図2)。

手術完了時から術後24時間まで、疾患が発症するにつれて、マウスは不活性になり、遅い応答および行動を示した。

コントロールマウスとSAPマウスの生存率は、手術後72時間でそれぞれ100%(8/8)および72.7%(8/11)であった(図3)。

膵臓切片からのH&E染色(図4)および病理学的スコア(図5)の結果によれば、明らかな浮腫(スコア:3.14±0.51対0.10±0.08)、炎症(スコ...

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ディスカッション

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TC によって誘導される SAP モデルは、優れた研究ツールです。この研究で示したように、このモデルは、特定のデバイスを使用することなく、一般的なラボで非常に簡単に実現できます。組織学および生化学的分析と組み合わせて使用すると、APを誘導および評価するためのコスト(安価な試薬)および時間節約(24時間時間窓)アプローチを提供する。 TCの濃度を調整することは、軽度および中等度のAPを産生する可能性も提供する。 これは、より正確な注入用量を提供し得る。

我々の経験によれば、モデル確立の外科的過程において、最も重要な要因には、胆道膵管の完全な曝露、マイクロインジェクタの滑らかな穿刺、および比較的一定の速度での胆道膵管および膵管へのTCの注入が含まれていた。手術中は以下の点に注意が必要です。まず、十二指腸壊死を引き起こす可能性のある過度の力の適用を避けるために、十二指腸を穏やかに引き抜く必要があります。ビリオ膵管の開口部は、十二指腸(十二指腸乳頭とも呼ばれる)の内縁に沿って位置し、続いてビリオ膵管を配置することができる。成功した場合、胆道膵...

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謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NCRCHのトランスレーショナルリサーチ助成金[2020WSA01]、蘇州健康委員会からのKJXW科学助成金[KJXW2020002]、蘇州市の科学技術計画(SKY2021038およびSKJY2021050)、江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)からの助成金、江蘇省の一次研究および社会開発計画(BE2018659)からの支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5% ヨードフォア上海リカン 消毒剤3101024mL/マウス
0.9% 塩化ナトリウムSinopharm Group Co., Ltd.100193180.8 mL/マウス
1% ペントバルビタールナトリウムΣP37610.2 -0.25 mL/マウス
25 μLフラットチップマイクロリットルシリンジGaoge、上海A124019
4%パラホルムアルデヒドBeyotime、南通、中国P0099-500ml
5%タウロコール酸ナトリウム(TC)アラジンS100834-5g10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle)Cheng-He20093
75% alcoholSinopharm Group Co., Ltd.100092184 mL/マウス
8-0 滅菌ナイロンマイクロ縫合糸、ねじ針付き (3/8 円)Cheng-He19064
ALT Activity Assay KitEPNK、安徽省、中国ALT0012
Amylase Assay KitEPNK、安徽省、中国AMY0012
12 mm 顎 (3 cm)Cheng-HeHC-X022
アスペン削りくず付き角度付き小型ブルドッグ クランプまたはマウス寝具用細断Beijing Vital River Laboratory Animal TechnologyVR03015
AST Activity Assay KitEPNK, Anhui, ChinaAST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay KitEPNK, Anhui, ChinaBUN0011
C57BL/6 mouseBeijing Vital River Laboratory Animal Technology213
Creatine Assay KitEPNK, Anhui, China
Feature Microtome bladeBeyotime, Nantong, ChinaE0994
止血鉗子 (9.5 cm, Curved)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.JC3901
リパーゼアッセイキット中国南京市建城A054-2-1
ミクロトームライカバイオシステム、ドイツRM2245
ミンドレイ生化学分析装置ミンドレー、深セン、中国BS-420
MPOアッセイキット中国南京市建城市 A044-1-1
正常なマウスチョウ栄養学、南通市、中国LAD 1000
リン酸塩緩衝生理食塩水中国南通市ビヨタイムC0221A
5 mmジョー(1.5 cm)付きストレートマイクロブルドッグクランプJZ、上海医療機器有限公司W40130
直線または湾曲した鉗子(11.0 cm)Cheng-HeHC-X091AまたはHC-X090A
ストレートはさみ(10.0 cm)Cheng-He、寧波、中国HC-J039102
Thermo Scientific遠心分離機Thermo Scientific、USAマルチフュージX1R
CRE0012市

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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