このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

3.9K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/63130

⸱

2022年4月1日

 , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

この記事について

サマリー

ここでは、ビーズ支持脂質二重層を用いた合成抗原提示細胞の段階的再構成のためのプロトコルと、活性化T細胞からのシナプス出力を調べるためのそれらの使用を提示する。

要約

抗原提示細胞(APC)は、物理的接触に関与するT細胞に、1)抗原、2)共刺激/コアプレス、および3)可溶性サイトカインの3つの活性化シグナルを提示する。T細胞は活性化に応答して2種類のエフェクター粒子を放出する:シナプス小胞(tSV)および超分子攻撃粒子は、それぞれ細胞間メッセンジャーを伝達し、細胞毒性を媒介する。これらの実体は、T細胞との物理的接触に関与するAPCによって迅速に内在化され、それらの特性評価を困難にする。この論文では、ビーズ支持脂質二重層(BSLB)を抗原提示細胞(APC)模倣体として製造および使用して、これらのシナプス貫通粒子を捕捉および分析するためのプロトコルを提示する。また、細胞表面上のタンパク質密度の絶対測定のためのプロトコル、そのような生理学的レベルを有するBSLBの再構成、およびT細胞によるシナプス粒子放出を追跡するためのフローサイトメトリー手順も記載されている。このプロトコールは、ヘルパーT細胞、細胞傷害性Tリンパ球、制御性T細胞、およびキメラ抗原受容体発現T細胞(CART)を含むT細胞のエフェクター出力に対する個々のタンパク質、複合リガンド混合物、病原体病原性決定基、および薬物の効果を研究するために適合させることができる。

概要

免疫学的シナプス(IS)は、物理的接触に従事する細胞の界面に形成される極めて重要な分子構造であり、ジュクストラクリン情報の調節された交換を促進する。さまざまなISが文献に記載されており、これらの分子ハブが細胞ネットワークの保存された特徴であることを示唆する証拠が増えています。B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、T細胞などのさまざまな免疫細胞は、短命の接点1の集合を介して情報を交換します。マルチオーミック研究は、病原性細胞ネットワークを駆動し、未知の機能を有する表面タンパク質を発現する白血球および間質細胞の新規サブセットの理解を進めている。合成APCとして、BSLBは、T細胞による活性化シグナル、すなわち抗原および共刺激/コアプレッションの統合における個々のタンパク質の機能的役割の直接的な調査を可能にし、その結果、シグナル4と呼ばれるエフェクター粒子の放出を可能にする。

このホワイトペーパーでは、BSLBを使用してモデルAPCの表面組成を模倣する際に考慮すべきプロトコルと重要な技術的ポイントについて説明します。APC上の免疫受容体および他の表面タンパク質の定量的測定のためのプロトコルは、これらの測定された量を含む合成APCの再構成のためのプロトコルと共に提示される。次に、T細胞とBSLBの共培養に必要なステップを、フローサイトメトリーを用いたシナプス間貫通粒子移動の定量的測定のためのプロトコールとともに提示する。最も驚くべきことに、BSLBは、シナプスエクトソーム(SE)と呼ばれるtSVの原形質膜由来集団の研究を容易にする。T細胞抗原受容体富化(TCR+)SEは、TCRトリガー2に応答して放出され、BSLBs3によって効率的に捕捉され、抗原およびモデル化された膜組成のアゴニスト特性を評価するための優れた読み出しを表す。CD63+エキソソームおよび超分子攻撃粒子(SMAP)も、刺激されたT細胞によって放出され、BSLBによって捕捉される。それらは、T細胞による活性化および結果として生じる外分泌性および溶解性顆粒分泌の追加の読み出しとして使用することができる。T細胞の相互作用極への外来小胞の動員はまた、活性化に応答してIL−2、IFN−γ、およびIL−10などのサイトカインの指向性放出を促進する4、5、6、7、8。T細胞放出サイトカインはBSLBでも検出できるが、免疫学的シナプスにおけるサイトカイン放出の定量的解析を検証するためのより献身的な研究が現在開発中である。

特定の膜組成がT細胞のシナプス出力にどのように影響するかを調べるには、標的膜成分の生理学的密度を定義する必要があります。細胞表面タンパク質のフローサイトメトリーベースの定量は、このプロトコルの重要なステップであり、1)抗体あたりの蛍光色素数(F/P)が既知である抗体の使用、および2)測定された平均蛍光強度(MFI)から蛍光色素分子を補間するための標準的な基準を提供するベンチマークビーズが必要です。

これらのベンチマーク標準は、5つのビーズ集団で構成され、それぞれが任意の蛍光検出のダイナミックレンジにまたがる同等の可溶性蛍光色素(MESF)の数を増やしています。これらの標準集団は離散的な蛍光ピークを生成し、単純な線形回帰によって任意の蛍光単位のMESFへの変換を容易にする。得られたMESFは、抗体F/P値とともに使用され、細胞当たりの結合分子の平均数(または後のステップではBSLB)を計算する。推定された細胞表面積を平均検出分子数に適用することで、生理学的密度を分子/μm2として計算することができます。この定量化プロトコルはまた、T細胞上のタンパク質密度の測定およびホモタイプT細胞シナプス(すなわち、T−Tシナプス9)の形成を媒介する膜組成物の生化学的再構成にも適合させることができる。必要に応じて、抗体結合の価数は、1分子当たり既知の数の蛍光色素で標識された組換え標的を使用することによってさらに推定することができる。次いで、結合蛍光タンパク質の数と定量抗体とを同時に比較することによって(2つの異なる定量蛍光色素およびMESF標準を使用)、同じBSLB集団に対する抗体結合価数を計算することができる。

APC膜の再構成には、シリカビーズ上に支持された脂質二重層(SLB)を組み立てる必要があります1。異なるリン脂質種を含むリポソームストックを利用して、汎用性の高い脂質二重層マトリックスを形成することができ、異なる結合化学を有する組換えタンパク質のアンカーリングを可能にする(リポソームの調製は 10に詳述されている)。「細胞上」の関連するリガンドの生理学的密度(または密度)が定義されると、同じフローサイトメトリープロトコルが、BSLBsを標的生理学的密度で被覆するのに必要な組換えタンパク質の濃度を推定するように適合される。2つの異なるアンカーシステムは、組み合わせて使用することも、別々に使用することもできます。

第1に、最終的な12.5モル%のNi2+含有リン脂質を含有するSLBは、1平方ミクロンあたり約10,000個のHisタグ結合部位を提供するのに十分であり10 、生理学的密度がこの最大負荷容量を超えないほとんどの市販タンパク質でBSLBを装飾するのによく機能する。第2のローディングシステムは、ビオチン含有リン脂質(モル%)を利用して、ストレプトアビジン架橋を介してビオチン化抗CD3e Fab(またはHLA/MHCモノマー)をロードする。これら2つのBSLB装飾方法を組み合わせることで、BSLBを合成APCとして柔軟に調整できます。非常に複雑なAPC表面組成の場合、リン脂質およびタンパク質のmol%を増加させて、手元の質問が必要とするだけ多くのタンパク質を負荷することができる。タンパク質の作用濃度とビオチン化リン脂質のmol%が定義されると、BSLBを組み立てて、マルチパラメトリックフローサイトメトリーでT細胞のシナプス出力を調べることができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 定量フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質密度の測定

  1. 0.22 μmろ過ヒトフローサイトメトリーバッファー(hFCB)を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にEDTA(最終2 mM濃度まで)およびヒトAB血清(最終10%まで)を添加して調製します( 表1参照)。0.22 μmの細孔フィルターユニットを使用して溶液をろ過し、血清不純物を除去し、4°Cで保存する。
  2. 細胞を回収し、室温(RT)で5分間300× g で遠心分離することによってそれらを沈殿させる。
  3. PBSで細胞を2回洗浄する。各洗浄ステップで、PBS中の細胞を元の容量(遠心分離前)に再懸濁し、RTで5分間300× g でスピンダウンする。
  4. トリパンブルー染色された細胞懸濁液を血球計数器でカウント11。あるいは、電流排除を使用してセルをカウントします。後者の場合は、CASY-TTの製造元の指示に従ってください( 材料表を参照)。
    メモ: CASY-TT セルカウンタを使用すると、生細胞の割合、セルサイズ、およびセル体積を決定できます。
  5. 細胞を107細胞/mLの染色濃度に再懸濁するために必要な、固定可能な生存率色素eFluor 780または類似の1:1,000希釈(材料表を参照)を含むPBSの体積を計算する。
  6. 生存率色素PBS溶液を用いて細胞を再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。
  7. 氷冷hFCBを1体積加えることにより生存率色素を除去する。300 × g で 4 °C で 5 分間スピンダウンします。
    注:これからは、コールドチェーンが壊れないようにしてください。
  8. Fc受容体遮断溶液の1:50希釈液を含むhFCBで細胞を洗浄する( 材料表を参照)。容量を107 細胞/mLの最終濃度にし、さらに15分間インキュベートして効率的なFcgRブロッキングを実現します。
  9. U底またはV底96ウェルプレートのウェルあたり100μLの細胞懸濁液(すなわち、106 細胞)を分配する。細胞を氷の上に置き、光から保護します(アルミホイルで覆う)。
  10. 各蛍光色素結合抗体、および最も重要なのは、表面タンパク質密度を決定するために使用される抗体に最適な抗体濃度を定義することによって、hFCB中の抗体マスターミックスを調製します。例えば、扁桃腺細胞集団におけるICAM-1発現の定量のために、 図1に示すように、抗CD4、抗CD19、および抗CXCR5の1:200希釈液を含む混合物を、抗ICAM-1抗体の飽和濃度とともに、抗体当たり既知のAF647蛍光色素(すなわち、独立した抗体滴定実験によって定義された10μg/mL)と共に調製する。
  11. 追加の対照として、関連する抗体アイソタイプ対照を含む抗体マスターミックスを調製し(バックグラウンド減算のために 同じ蛍光色素と結合させた対応するものと同じ有効濃度で )、すなわち、関連するAF647アイソタイプ対照の10μg/mLを使用する。
    注: 上記の例では、このようなアイソタイプコントロールを使用して、細胞上の真のICAM-1シグナルからバックグラウンド蛍光を差し引いています。
  12. 組織内に低周波で存在する細胞サブセット上のタンパク質密度を定量する場合、目的のマーカーを除くすべての染色抗体を含む蛍光マイナス1(FMO)対照を調製する( 12のさらなる詳細を参照のこと)。
  13. 細胞を含む96穴プレートを300 × g で4°Cで5分間スピンダウンし、上清を捨て、定量抗体マスターミックスまたはアイソタイプ抗体マスターミックスのいずれかの50 μLに細胞を再懸濁した。
  14. プレートシェーカーを用いて細胞を4°Cおよび400rpmで少なくとも30分間インキュベートする。プレートを光から保護します(アルミホイルでカバー)。
  15. hFCBを用いて細胞を3回洗浄し、300× g で4°Cで5分間遠心分離機で洗浄した。
  16. 200 μLのPBSを用いて細胞ペレットを再懸濁する(すなわち、最終濃度5×106 細胞/mLまで)。
  17. 買収の場合:
    1. 標準のBD FACSローダーを使用している場合は、サンプルを5 mLのポリスチレン製丸底チューブに移します( 材料表を参照)。
    2. ハイスループットサンプラー(HTS、プレートリーダーとも呼ばれます)を使用している場合は、すぐにステップ1.19に進みます。
  18. MESF標準のデータ取得を進める前に、定量チャネルの蛍光強度直線性の最大限界と最小限界を確認してください。
  19. 補正する前に、MESF規格のデータを取得して、最も暗い母集団と最も明るい母集団の両方が測定の線形範囲に入るようにします。
  20. 補正サンプルを取得します。定量化チャンネルの光電子増倍管(PMT)電圧値を変更せずに、検出のダイナミックレンジを維持します。補償マトリックスを計算する前に、他のチャンネルのPMT電圧を少し調整してください。
  21. 報酬を計算して適用します。
  22. 定量化チャネルごとに合計 2 個から 104 個の MESF ビーズを最小 2 個×保存します。
  23. 単一細胞の集団を、その側方および前方光散乱領域(図1A(i)に示すように、それぞれSSC-AおよびFSC-A)に基づいて選択し、続いて、時間連続体内の事象の選択(図1A(ii))およびFSCおよびSSCの両方において、それらの高さと比較して飛行時間(W)が低い(すなわち、 FSC-W/FSC-H、続いて、図1A(iii)および(IV)にそれぞれ示すようにSSC-W/SSC-Hゲーティングが続く。FSC-AとFSC-Hの分布が比例したイベントを含む最終的な単一イベントゲートを定義します(図1A(v))。
  24. 対照サンプル(アイソタイプ標識およびFMO対照)を取得します。
  25. サンプルを取得し、最低 10,000 個の標的細胞が取得されるまで記録します。
    注:平均分子密度のロバストな決定には、独立した実験にわたっていくつかのドナーの分析が必要です。これは、頻度が低下して見つかった細胞サブセット、または希少な生物学的材料(例えば、ヒト組織生検)に由来する細胞サブセットを分析する場合に重要です。
  26. 5分間稼働中のサイトメーターをFACS洗浄液で洗浄し、続いて5分間超純水を洗浄してから装置をシャットダウンします。HTSを使用している場合は、[ HTSとクリーンプレート]プログラムのタブの下にあるオプションに従います。
    注:サンプル間の持ち越しを減らすには、 シット( サンプラー)フラッシュまたは ハイスループットサンプラー 洗浄オプションを有効にして、チューブまたはウェル間のサイトメーターを自動的に洗浄します。取得を開始する前に、超純水を高流量で10分間流し、サイトメーターサンプルラインから未洗浄の生物学的汚染物質を除去します。
  27. フローサイトメトリー標準 (FCS) ファイルをエクスポートします。

2. MESFの過剰補正平均(または中央値)蛍光強度(MFI)回帰分析

  1. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、実験FCSファイルをロードします。 図1A (i)に示すように、ビーズの側方および前方光散乱領域(SSC-A対FSC-A)に基づいてビーズの集団を選択します。
  2. ステップ 1.24 に示すように、時間の経過に伴う単一イベントの分布をチェックすることによって、データ品質を制御します。
    メモ: バブルは、時間の経過とともにイベントの分布にギャップを作り出します。これは通常、HTS を使用した取得の開始時に表示されます。集録時間内にギャップのあるイベントは、光学収差による測定誤差を増大させるため、選択しないでください。
  3. 単一のイベントに焦点を当てます。
    1. 細胞
      1. 最初にSSC-AおよびFSC-A分布に基づいて単一細胞を同定し(図1A (i))、続いてシーケンシャルゲートFSC-W/FSC-H(シングルス-1、 図1A パネル(iii))およびSSC-W/SSC-H(シングルス-2; 図1A パネル(iv))。比例FSC-AとFSC-Hを持つ事象を選択して、追加のシングルス-3ゲートを定義します(図1A、パネル(v))。最後に、生細胞を固定可能な生存率色素に対して陰性のものとして同定する。
    2. MESFビーズ
      1. ステップ 2.3.1.1 と同じ singlets-1 から singlets-3 の判別に従います (図 1B、パネル (i) から (v))。蛍光強度レベルに基づいて、MESF集団(ブランク、1、2、3、および4)のそれぞれを同定する( 図1B、パネル(vi)を参照)。
  4. ブランクおよび1~4のMESF画分のMFIを抽出する。
  5. 各フラクションからブランクビーズ母集団のMFIを差し引くことによって、MESFフラクション1〜4の補正MFI(cMFI)値を生成します。
  6. cMFI とベンダーから提供された MESF 値 (独立変数、ゼロに等しい小数部ブランク) の関係に最も適した線を計算します。
  7. cMFIに対するMESFの線形回帰の傾き(下式のb )を抽出する(図1B パネル(viii)は、y = a + bx;a = 0の回帰を示す)。
  8. 目的の集団から蛍光強度の中央値(二峰性蛍光分布の場合)または平均(正規または対数正規蛍光分布の場合)を抽出する( 図1AパネルのTFHおよびB細胞 (vii))。
  9. ステップ2.5~2.7と同様に、アイソタイプ標識対照細胞からMFI値を抽出する。
  10. アイソタイプコントロールのF/Pが定量抗体と同じ場合は、アイソタイプ標識細胞からMFIを差し引いて染色細胞のMFIを補正します。
  11. アイソタイプのF/Pが定量抗体のF/Pと異なる場合は、アイソタイプ標識細胞のMFIをステップ2.7で計算した傾きで除算して、アイソタイプからMESFを抽出します。結合した定量抗体を推定する前に、定量MESFからアイソタイプMESFを差し引く。
  12. MESFを定量抗体のF/Pで割って、細胞あたりの結合分子数を推定する(Molec.図1C)のフロー図に示すようなセル。
  13. 結合分子の数を推定細胞表面積(CSA(μm2))で除算し、タンパク質の密度をmolc./μm2として抽出します(図1C)。詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください。

3. BSLBsをコーティングするタンパク質の較正に使用する機能性リン脂質種

  1. 0.4 mM DOPC (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)を、支持された脂質二重層を形成する脂質マトリックスの主要成分として使用する。このDOPC溶液中の他のすべての脂質種を希釈する。
  2. ATTO 390、488、または565(材料表を参照)を含む色素に結合させた0.4mM DOPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)を0.2~1モル%使用して、固有の蛍光を有するBSLBを生成する。
    注:BSLBの固有蛍光は、シナプス伝達実験における単一BSLBおよび単一細胞の同定を容易にする。
  3. 12.5 mol% の 0.4 mM DGS-NTA(Ni ) (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[(N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル) イミノ二酢酸) スクシニル]) を使用して、Hisタグ付きタンパク質をアンカーします。DGS-NTA(Ni)のmol%を一定に保ち、最高濃度として100nMから始まるHisタグ付きタンパク質の2倍の滴定を実行します。タンパク質を含まない1つの条件を絶対定量のための陰性対照として残す。
    注:ICAM-1などのアクセサリシグナルおよび接着分子は、DGS-NTA(Ni)に対するタンパク質の親和性を高めるために、12-Hisタグを使用して設計されています。
  4. ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン架橋を介してビオチン化タンパク質を固定するために 、ビオチ ニルキャップPE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル))を使用します。10 mol% ~ 0 mol% をカバーする 0.4 mM ビオチニルキャップ PE の 5 倍連続滴定を使用します (ネガティブ コントロールとして)。ストレプトアビジンおよびビオチン化タンパク質の濃度を、較正実験およびシナプス伝達実験のための合成APCの再構成の両方で一定(200nM)に保つ。
    注:脂質マトリックス中のビオチニルキャップPEの最終モル%に対するビオチン化タンパク質の経験的密度の回帰分析(Hisタグ付きタンパク質を固定するためにDGS-NTA(Ni)も含む)は、抗原の標的密度を再構成するために使用されるmol%を定義する。

4. 1%血清アルブミンを含む補充HEPES緩衝生理食塩水の調製

注:BSLBの洗浄およびタンパク質ローディングステップでは、1%ヒト血清アルブミン(HBS/HSA)または1%ウシ血清アルブミン(HBS/BSA)を含む補充HEPES緩衝生理食塩水が必要です(表1)。10倍のHBSストック溶液と作業バッファーをできるだけ新鮮に準備します。冷蔵保存し、1ヶ月以内に使用してください。BSAはHSAに代わる安価な代替品ですが、Niキレート脂質13 の効率的な閉塞を提供し、ハイスループット実験に推奨されます。

  1. 200 mM HEPES、7 mM Na2HPO4、1400 mM NaCl、50 mM KCl、60 mM グルコース、10 mM CaCl2、および 20 mM MgCl2 を含む補充 HBS の 10 倍のストック緩衝液を調製します。
    注:MgCl2を 溶解することは発熱性が高く、火傷の危険があります。この塩をゆっくりと大量の溶媒に加えます。これらの塩は時間の経過とともに沈殿する傾向があり、作業バッファーへの正確な添加が困難になるため、濃縮溶液(すなわち、1 M)の調製は避けてください。
  2. 0.22 μm フィルターユニットを使用して 10x 溶液をろ過し、4 °C で滅菌したままにします。
  3. 500 mL の HBS/has の場合は、補充した 10x HBS 溶液を 50 mL とり、必要に応じて pH を 7.4 に調整し、超純水で容量を 483.4 mL にします。
  4. 483.4 mLのHBS(pH 7.4)に16.6 mLの30%HSA溶液を加える。
  5. 500 mL の HBS/BSA の場合、5 g の BSA を HBS に溶解し、37 °C で 30 分間インキュベートします。次に、目に見えるタンパク質結晶または凝集塊がなくなるまで定期的にボトルを反転させてRTで穏やかに混合します。
  6. ステップ4.5で得られた溶液を0.22μmのフィルターユニット( 材料表を参照)を使用してろ過し、4°Cで保存します。

5. BSLBのタンパク質密度校正

  1. 直径5.00±0.05μmの非官能化シリカビーズを服用する前に、原液をよく混ぜ合わせ、フラスコの底に沈降したビーズの大きな塊を再懸濁してください。
    注:シリカビーズはすぐに沈降する傾向があり、カウントエラーにつながる可能性があります。P1000マイクロピペットの最大容量の半分を上下にピペッティングして、激しく混合します。
  2. 1,000 μLのPBSで1 μLのビーズ溶液を希釈し、血球計数器チャンバーを使用してビーズをカウントし、mLあたりの濃度を計算します。
    注:シリカビーズを視覚化するためにトリパンブルー染色は必要ありません。
  3. 滴定のポイントあたり5〜105 の最終BSLBに必要なシリカビーズの体積×計算します。
  4. 必要量のシリカビーズを滅菌1.5mL微量遠心チューブに移す。
  5. シリカビーズを1mLの滅菌PBSで3回洗浄し、RT(固定rpm)でベンチトップ型微量遠心分離機上でビーズを15秒間遠心分離する。
    注:洗浄液を除去するときは、ビーズペレットを乱さないでください。小さなバッファーカラムは、リポソームマスターミックスを構成するリポソームの広がりに影響を与えません。
  6. 洗浄したシリカビーズ上にBSLBを組み立てるために、3倍量のリポソームマスターミックスを調製する(例えば、シリカビーズの初期総容量が20μLの場合、最小60μLのリポソームマスターミックスを調製する)。
  7. ビオチニルキャップPEモル%滴定用
    1. ビオチニルキャップPEの5倍希釈物を含む脂質マスターミックスを調製する。
      1. 0.4 mM ビオチニルキャップ PE モル% を 100% DOPC マトリックスで希釈します。
      2. 各ビオチニルキャップPEモル%滴定ポイントを1:1(vol:vol)比で0.4mM 25% DGS-NTA(Ni)の溶液と混合して、すべての滴定で最終的な12.5モル%のNi含有脂質が存在するようにします。
        注:Ni含有脂質の12.5モル%(vol:vol%)は、Hisタグ付きタンパク質も並行較正で試験することができるBSLBの混合脂質組成を表す。例えば、すべてのリポソームストックが同じモル濃度で調製されるので、最終リポソームミックスの200 μL中の目標mol%混合物に到達するには、25 mol%のNi含有DGS-NTAの100 μLと100 μLの100 mol% DOPCを単に混合する。
    2. 5 × 105 洗浄したシリカビーズを 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移し、チューブごとに 1 つのビオチニルキャップ PE mol% 滴定ポイントが組み立てられるようにします。
    3. 洗浄したシリカビーズにビオチニルキャップPEモル%滴定マスターミックスを加え、全容量の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合する。過剰に脂質二重層を破壊する気泡を形成しないでください。
    4. 現在形成されているBSLBを含むチューブにアルゴン(または窒素)ガスを追加して空気を置換し、混合中の酸化から脂質を保護します。
    5. 保存前にアルゴンを0.4 mM脂質ストックに加え、滅菌技術を用いて操作する。
      メモ:小さなチューブをアルゴン/窒素ガスボンベに接続します。チューブにガスを追加する前に、圧力が2psi以下に設定されるようにガスボンベレギュレータを調整してください。滅菌ピペットチップを出口チューブに接続して、リポソームストック内のガス流を5秒間指示し、蓋をすばやく閉じます。脂質ストックの場合は、チューブの蓋をパラフィンフィルムで密封してから4°Cで保管してください。
    6. BSLBを垂直、可変角度の実験用ミキサー( 材料表を参照)に移動し、10rpmの軌道混合を使用してRTで30分間混合する。
      注:このステップは、支持された脂質二重層の形成中のビーズの沈降を防止する。
    7. ベンチトップ型ミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してビーズをスピンダウンし、1mLのHBS/HSA(BSA)で3回洗浄して余分なリポソームを除去します。
    8. 100 μM の NiSO4 を含む 1 mL の 5 mL の 5% カゼインまたは 5% BSA を加えて NTA 部位を飽和させ、200 nM ストレプトアビジンを加えて BSLB 上のすべてのビオチンアンカー部位を均一にコーティングすることにより、形成された BSLB をブロックします。全容量の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合し、垂直ミキサーでRTおよび10rpmで20分以内にインキュベートします。
    9. ベンチトップ型ミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してBSLBをスピンダウンし、1 mLのHBS/HSA(BSA)バッファーで3回洗浄します。
      メモ: BSLB を覆う少量の洗浄バッファーで洗浄ビーズを垂直に保管してください。空気は脂質二重層を破壊するため、BSLB の脱水を避けてください。
  8. 12.5モル%のDGS(Ni)NTA含有BSLBsに対するHisタグ付きタンパク質の滴定用
    1. 最終的な12.5モル%のDGS-NTA(Ni)を含む3倍量のリポソームマスターミックスを調製する。
    2. リポソームマスターミックスを使用して、洗浄したシリカビーズを再懸濁し、全容量の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合します。気泡の形成を避けます, 過剰に脂質二重層を損傷します.
    3. 現在形成されているBSLBを含むチューブにアルゴン(または窒素)ガスを追加して空気を置換し、混合中の酸化から脂質を保護します。
    4. 保存前にアルゴンを0.4 mM脂質ストックに加え、滅菌技術を用いて操作する。
    5. BSLBを垂直ミキサーに移動し、10rpmでの軌道混合を使用してRTで30分間混合する。
    6. ベンチトップ型ミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してビーズをスピンダウンし、1mLのHBS/HSA(BSA)で3回洗浄して余分なリポソームを除去します。
    7. 100 μM の NiSO4 を含む 5% カゼイン (または 5% BSA) を 1 mL 加えて、形成された BSLB をブロックし、BSLB 上の NTA サイトを飽和させます。穏やかに混合し、垂直ミキサーで RT および 10 rpm で 20 分以内に インキュベートします。
    8. HBS/HSA(BSA)を使用して3回洗浄し、余分なブロッキング溶液を除去します。
    9. 新しいU底96ウェルプレートで、タンパク質の2倍連続希釈液を調製する。
      1. HBS/HSA(BSA)バッファーの全容量200 μLで目的タンパク質の開始濃度100 nMを調製し、この溶液を最初のカラムに100 μL、残りの100 μLを100 μLのHBS/HSA(BSA)バッファーを含むカラム#2の上に分配します。
      2. カラム #2 からカラム #3 に 100 μL を連続して移し、必要に応じて繰り返してすべての滴定ポイントをカバーします。タンパク質を含まない系列の最後の列は、定量化の空白の参照として使用されるため、そのままにしておきます。
    10. 調製したBSLBを、100 μLのHBS/HSA(BSA)バッファーに5×105 BSLBが含まれるように容量に再懸濁します。
    11. 100 μLのBSLB懸濁液を第2のU底96ウェルプレートのウェルに移し、各ウェルが5×105 BSLBを受け取るようにする。
    12. BSLBを含む2番目のプレートを300 × g およびRTで2分間スピンダウンし、上清を廃棄する。
    13. 沈殿したBSLBを含むプレートに100 μL容量のタンパク質滴定プレートを移します。穏やかに混合し、ピペッティング中に過剰な気泡発生を避け、プレートシェーカーを使用してRTおよび1,000 rpmで30分間インキュベートします。アルミホイルで光から保護してください。
    14. RT で 2 分間、300 × g の沈降ステップを使用して、プレートを HBS/HSA(BSA) バッファーで 3 回洗浄します。
    15. 校正に使用した組換えタンパク質が蛍光色素に直接コンジュゲートされ、F/P値がわかっている場合は、ステップ5.8.20に進みます。
    16. 校正に使用した組換えタンパク質が標識されていないか、蛍光色素にコンジュゲートされている場合、またはMESFビーズ標準が利用できない場合は、既知のF/P値を持つAlexa Fluor 488または647結合抗体を使用して、タンパク質コーティングBSLBを染色します。
    17. 定量抗体の飽和濃度で染色する。
      注:標的発現レベルに応じて、これらの範囲は5〜10μg/mLです。
    18. プレートシェーカーを使用してRTおよび1,000rpmで30分間染色する。アルミホイルを使用して光から保護します。
    19. HBS/HSA(BSA)バッファーで2回、PBSで1回、RTで2分間300× g の沈降ステップを使用して洗浄します。
      注: PBS、pH 7.4 を使用して、取得前に洗浄した BSLB を再懸濁してください。タンパク質を含むバッファーは、ハイスループットサンプラーとのサンプルの自動混合中に気泡が形成されるため、使用しないでください。
    20. 図1B(vii)に示すように、MESF規格を取得し、最も明るいピークが定量検出器(チャネル)の線形検出範囲に残っていることを確認します。
    21. サンプルを手動で取得するか、HTS を使用して取得します。後者を使用する場合は、BSLB を 100 μL の PBS に再懸濁し、2.5 ~ 3.0 μL/s の流速、100 μL の混合容量 (再懸濁容量が小さい場合は全容量の 50%)、混合速度 150 μL/s、および 5 つの混合を使用して 80 μL を取得し、BSLB が単分散であることを確認します。
    22. FCS ファイルをエクスポートします。
    23. 分析では、ダブレットまたはトリプレットが決定に誤差をもたらすため、単一のイベント(図2A)に焦点を当てます。プロトコル・ステップ 1.2.3 で示されているように、単一イベントのネストされた識別を使用します。
    24. 各MESF画分(1〜4)のMFIを測定し、ブランクビーズのMFIを差し引いて補正MFI(cMFI)を抽出する。
    25. 線形回帰分析を実行して、手順 5.33 で使用する MESF 標準に対して計算された cMFI に対する MESF の傾き (b) を抽出します。
    26. 各滴定点のMFIを抽出し、タンパク質を含まないビーズのMFIを差し引いてcMFIを得た。
    27. ステップ5.31で計算した傾きでcMFIを除算し、滴定点ごとにBSLBに結合したMESFを抽出します。
    28. BSLBに結合したMESFを定量抗体のF/P値で割り、BSLBあたりに結合した平均分子数を抽出します。
    29. BSLBの直径(5.00 ± 0.05 μm)を使用してビーズ表面積(SA = 4pr2)を抽出し、滴定点あたりのタンパク質の最終密度(モルク/μm2)を計算しました(タンパク質濃度)。
    30. タンパク質密度に対するタンパク質濃度の新しい回帰分析を実行して、最適ラインの傾き(b)を計算します。
      注:DGS-NTA(Ni)の濃度が12.5モル%の場合、T細胞の非特異的活性化を誘導したり、SLBの側方移動度に影響を与えたりすることなく、約10,000モル/μm210の最大アンカー能力が得られます。

6. T細胞とBSLB間のシナプス伝達実験の実施

  1. シナプス伝達実験を行う前に
    1. 非蛍光BSLB、蛍光脂質を含むBSLB、未染色細胞(または補償ビーズ; 材料表を参照)、および単色染色細胞(または補償ビーズ)を取得して、機器の蛍光スペクトル相互作用を特定します。スピルオーバーの広がりが大きい検出器に焦点を当てて、多色パネルを再設計し、感度を高め、重要な検出器の測定誤差を低減します( 14を参照)。
    2. 検出抗体を滴定して最適な濃度を見つけ、陰性の検出を損なうことなく陽性事象の検出を可能にします。
      注:F/P値と輝度がバッチごとに異なるため、抗体ロットが変化するたびにこの手順を繰り返します。
    3. オプション:異なる電圧範囲(すなわち、電圧ウォーク)でサンプルを集録することによってPMT電圧を最適化し、最適な信号対ノイズをもたらすPMTを見つけます(すなわち、最も明るい母集団の信号が線形範囲にとどまるようにしながら、負と正の分離)。
  2. BSLBへのTセル出力伝達の測定
    1. 10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100μM非必須アミノ酸、10mM HEPES、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンを含む補充RPMI 1640(本明細書中R10培地)を調製する。R10培地を使用してT細胞を培養および展開する。
    2. 1日目に、末梢血または白血還元系(LRS)チャンバーからT細胞を単離する。ヒトCD4+およびCD8+ T細胞を濃縮するために、免疫密度細胞単離および分離キット(材料表を参照)を使用してください。
    3. 106 cells/mL から 1.5 ~ 2.0 の範囲の最終濃度で細胞×を播種し、1 ウェルあたり合計 5 mL 以下の 6 ウェルプレートを使用します。
    4. ヒトT細胞活性化(抗CD3/抗CD28)磁気ビーズ( 材料表を参照)の1:1の比率を使用してT細胞を活性化し、細胞の増殖および生存をサポートするために組換えヒトIL-2を100IU添加する。
    5. 3日目に、磁気カラムを使用して活性化磁気ビーズを除去します(材料表を参照)。追加の洗浄ステップのために細胞を回収する前に、磁気ビーズがチューブの側面に取り付けられたままであることを確認してください。
    6. 磁気ビーズを5 mLの新鮮なR10培地でもう一度洗い流し、よく混ぜて磁石に戻します。この量を回収し、ステップ6.2.5で回収した細胞と混合する。
    7. 100 U/mLのIL-2を含む新鮮なR10で細胞を1.5-2×106 細胞/mLに再懸濁する。48時間後に培地を補充し、IL-2の最終添加が実験日の48時間前(培養の7〜14日目)であることを確認する。
    8. シナプス転移実験当日、フェノールレッドフリーRPMI 1640培地に10%FBS、100μM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100U/mlペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを補給してシナ プス転写アッセイ培地 ( 表1参照)を調製した。組換えヒトIL-2を含まない。
    9. トリパンブルー染色または電流排除のいずれかを使用して細胞をカウントし、培地中の106 細胞/mL×2.5の最終濃度に再懸濁する。過剰な細胞死(>10%)が観察された場合は、多糖類とジアトリゾ酸ナトリウムの混合物( 材料表を参照)を使用して、死んでいる/死にかけている細胞を除去してください。
      1. 13mLの多糖 - ジアトリゾ酸ナトリウム溶液の上に15mLの細胞培養物の層。
      2. RTで1,250 × g の遠心分離機をRTで20分間、最小限の加速と低加速で行います。培地と多糖 - ジアトリゾ酸ナトリウム溶液との間の界面に細胞層(雲)を集める。
      3. 予め加温したシナプス転写アッセイ培地(ステップ6.2.7で調製)で細胞を少なくとも2回洗浄する。
      4. シナプストランスファーアッセイ培地を用いて細胞を計数し、最終濃度2.5×106/mLまで再懸濁する。この細胞懸濁液100 μLをBSLBsと共培養する(ステップ6.2.15参照)。
    10. 実験に必要なBSLBの数を計算します。試験するすべての異なるタンパク質マスターミックスおよび抗原滴定(ビオチン化HLA/MHCペプチドモノマーまたはモノビオチン化抗CD3ε Fabのいずれか)を検討してください。
    11. プロトコルセクション5から同じ手順に従ってBSLBを組み立てますが、今回は、複雑なAPC膜を再構成するために必要なタンパク質と脂質のすべての滴定を組み合わせてください(図3A)。同じ体積を保つ:初期シリカビーズ体積と較正中に使用されるタンパク質混合物の体積との間の体積関係、ならびにBSLBの装填に使用される時間と温度。例えば、初期較正に0.5 μLのシリカビーズ/ウェルと100 μL/ウェルのタンパク質ミックスを使用した場合、5:1,000 vol:vol比を維持して、T細胞と共培養するBSLBを調製します。
    12. BSLBに目的のタンパク質ミックスをロードしたら、BSLBをHBS/HSA(BSA)で2回洗浄して、過剰な未結合タンパク質を除去します。各洗浄ステップでRTで300× g の沈降速度を2分間使用し、上清を捨てます。
    13. 1ウェルあたり5×105 BSLBを200 μLで再懸濁する。
    14. 1ウェルあたり100 μLを新しいU底96ウェルプレートに移し、1ウェルあたりのBSLBの最終量が2.5 × 105になるように複製を作成します。
    15. BSLBを300 × g で2分間スピンダウンし、RTし、上清を捨てます。
    16. 100μLのT細胞懸濁液を用いてBSLBを再懸濁する;気泡の形成を防ぐために穏やかに混合する。
    17. 共培養物を37°Cで90分間インキュベートする。
      注: あるいは、細胞およびビーズを、フェノールレッドを含まない RPMI の代わりに HBS/HSA(BSA) バッファーに再懸濁して、共存させることもできます。この場合、このガスは重炭酸塩の非存在下で緩衝液を急速に酸性化するので、インキュベーションは非CO2 インキュベーターで行わなければならない。
    18. BSLB-T細胞共培養を冷却するには、まずRTで細胞を最低15分間インキュベートします。光からそれらを守ります。
    19. 細胞を500 × g およびRTで5分間遠心分離する。上清を捨てる。
    20. ブロッキングのために細胞をRT 2% BSA-PBS(Ca2+およびMg2+フリー)に再懸濁する。細胞を氷の上に45分間置く。光から保護します。
    21. 細胞をインキュベートしながら、PBS中の氷冷0.22 μmろ過2% BSAを染色バッファーとして使用して抗体マスターミックスを調製し、これにより追加のブロッキングが提供されます。
      注:ブリリアントバイオレット色素にコンジュゲートした抗体のいくつかのバッチは、BSLBsに非特異的に結合する傾向がある。5% BSA-PBSでブロッキングすると、このノイズを減らすのに役立ちます。 これからは、コールドチェーンが切れないようにしてください。
    22. 共培養物を500 × g で5分間、4°Cでスピンダウンします。 上清を捨てる前に、バックライトを用いて96ウェルプレートの底部を検査して、ペレットが存在することを簡単に確認する。
    23. 多チャンネルピペットを用いて、最適化された抗体濃度を含む染色マスターミックス中の細胞を再懸濁する。
      注:フィルターのないピペットチップを使用して、気泡の発生や染色量の分布のエラーを防ぎます。
    24. アイソタイプ標識された細胞およびBSLBs、蛍光および非蛍光BSLB、ならびに単独で染色された細胞およびBSLBsが含まれる。すべてのコントロールのウェルあたりのイベントの総数を尊重します(すなわち、染色されたイベントあたりの抗体の相対的な増加を避けるために、5×105 BSLB /ウェルを含むBSLBのみ、および5×105 細胞/ウェルを含む細胞コントロールのみ)。
    25. 体積の半分を上下にピペッティングして穏やかに混合し、氷上で30分間インキュベートする。光から保護します。
    26. 細胞およびBSLBを氷冷2%BSA-PBS、pH7.4、および500× g の沈降ステップを用いて4°Cで5分間2回洗浄する。 洗浄した共培養物を100 μLのPBSに再懸濁し、直ちに取得する。
    27. 固定が必要な場合は、PBS中のPFAの0.5%w/vを使用して10分間固定し、1回洗浄し、取得までPBSに保管してください。光から保護します。
    28. 補償する前に、MESF規格を取得して、最も暗い集団と最も明るい集団の両方が測定の線形範囲に入るようにします。
    29. 補正サンプルを取得し、補正を計算し、補正行列 (リンク) を実験に適用します。
    30. 定量化チャネルごとに、合計 2 × 104 の MESF 標準を取得して保存します。
    31. ハイスループットサンプラーを使用した取得の場合は、機器取得を標準に設定し、サンプル取得を80 μL(または総容量の80%)に設定し、サンプル流量を2.0~3.0 μL/s、サンプル混合容量を50 μL(混合中の気泡形成を避けるために総容量の50%)、サンプル混合を150 μL/s、ウェルあたり3~5の混合に設定します。
    32. サンプルあたり最小1~104 個のシングルBSLB×取得します(リファレンスゲーティング戦略については 、図3B のパネル(i)~(vi)を参照してください)。
    33. サイトメーターを洗浄液で5分間洗浄し、続いて超純水を5分間洗浄してから、装置をシャットダウンします。HTS を使用している場合は、[ HTS] タブと [クリーン] オプションの下にあるオプションに従います。
    34. FCS ファイルをエクスポートします。

7. BSLBへの粒子のシナプス移動の測定

  1. 実験の FCS ファイルを開きます。 図3B (i)に示すように、細胞およびBSLBの集団を、その側方および前方光散乱領域(SSC-A対FSC-A)に基づいて選択する。
  2. 連続集録ウィンドウ内のイベントを選択します(図3B (ii))。
  3. 細胞とBSLBの両方の単一のイベントに焦点を当てます。シーケンシャルゲートFSC-W/FSC-H(シングルス-1、 図3B パネル(iii))およびSSC-W/SSC-H(シングルス-2)の低Wに基づいて単一セルを最初に同定する。 図3B パネル(iv))。比例FSC-AとFSC-Hを持つ事象を選択して、追加のシングルス-3ゲートを定義します(図3B、パネル(v))。
  4. 各実験試料についてブランクおよび1~4のMESFおよび単一細胞およびMESFからMESF画分のMFIを抽出する。
  5. 各フラクションからブランクビーズ母集団のMFIを差し引くことによって、MESFフラクション1〜4の補正MFI(cMFI)値を生成します。
  6. 単一の BSLB およびセルの cMFI を生成します ( 図 3C パネル (i) を参照)。
  7. アイソタイプ対照抗体で染色したBSLBからのシグナルを使用して、関連するT細胞マーカーに対する抗体で染色したBSLBのMFIを補正する。cMFIを使用して、 図3C パネル(ii)に示す式を使用して正規化されたシナプス伝達パーセント(NST%)を計算します。
  8. TCR トリガに応答して特異的に転送されるパーティクルに関心がある場合は、アゴニスト性 BSLB の MFI からヌル BSLB からの信号を減算します。この cMFI を使用して、図 3C パネル (ii) に示す式を使用して TCR 駆動 NST% を計算します。
  9. T細胞-BSLB界面を横切って粒子貨物として移送される分子の総数を決定することに興味がある場合は、T細胞-BSLB共培養について同じ装置設定および取得セッションを使用してMESFベンチマークビーズを取得します。
  10. MESF ビーズ集団を分析し、プロトコルステップ 5.8.15 ~ 5.8.17 に示されているように、その cMFI を抽出します。cMFI に対する MESF の回帰分析に最も適した線の傾きを計算します。
  11. 計算された傾きを使用して、BSLB に沈着した MESF の数を抽出します。アイソタイプ コントロールまたはヌル BSLB のいずれかを使用して計算された cMFI をブランクとして使用して、BSLB を刺激するために特異的に転送された MESF の数を抽出します。
  12. BSLBあたりの計算された(平均)MESFを定量抗体のF/P値で割ることによって、BSLBに転写されたマーカーの分子数を計算する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

細胞表面上の絶対タンパク質定量のためのFCM
リガンドの生理学的密度を示すBSLBの再構成には、モデル化された細胞サブセット上の総タンパク質密度の推定が必要である。BSLBsを再構成するには、BSLBと細胞との間の接着および機能的相互作用を支持するタンパク質、例えばCD40、CD58、およびB7受容体(CD80およびCD86)などのBSLBと細胞との間の接着および機能的相互作用を支持するタンパク質と共に、目的のシグナル伝達軸において役割を果たすと予想される任意の関連リガンドが含まれる。ICOSL3、PD-L1、およびPD-L215などの共刺激分子を含む追加のタンパク質を、手元の質問に応じて追加することができる。他の分子については、定量的フローサイトメトリーで細胞を直接分析することによって決定された分子密度を使用してBSLBを再構成する。直接結合抗体の場合、BioLegend は各抗体ロット番号の F/P 値を提供します。抗体を社内で標識し、F/P比を分光光度法によって決定することもでき、所望の蛍光色素に...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

BSLBは、モデルAPC膜で刺激されたT細胞の粒子出力を研究するための汎用性の高いツールです。この方法の柔軟性により、複雑で還元主義的な膜組成物の再構成が、tSVおよび超分子攻撃粒子およびその成分の分泌に対するリガンドおよびそのシグナルの影響を研究することができる。我々は、この技術を、前活性化TH、CTL、Tregs、およびCART15を含む様々なT細胞でテストした。このプロトコルは、新しく単離された静止期のT細胞のシナプス粒子放出の測定にも機能する。新たに単離されたT細胞を使用することの1つの制限は、これらの静止した集団が、それらの細胞表面組成と相関するシナプス貫通粒子の異なるプロファイルを産生することである(詳細は 15 を参照されたい)。

単純なフローサイトメトリーパネルとして、抗TCRクローンIP26、抗CD81クローン5A6、抗パーフォリン(PRF1)クローンB-D48または抗CD40Lクローン24-31、およびATTO 390またはATTO 565含有脂質(BSLBに固有の蛍...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は宣言する利益相反はありません。

謝辞

建設的な科学的議論をしてくれた研究室メンバーとケネディリウマチ研究所コミュニティ、特にフローサイトメトリー施設マネージャーのジョナサン・ウェバーに感謝しています。この研究は、Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z、ERC Advanced Grant(SYNECT AdG 670930)、Kennedy Trust for Rheumatology Research(KTRR)(3つともMLDに)から資金提供を受けました。PFCDは、欧州委員会(LTFCOFUND2013、GA-2013-609409)およびMarie Sklodowska-Curie Actionsと共同で、EMBO長期フェローシップ(ALTF 1420-2015)およびオックスフォード・ブリストル・マイヤーズスクイブ・フェローシップによって支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

2
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-[(N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸)サクシニル](ニッケル塩)Avanti Polar Lipids790404C-25mg18:1 DGS-NTA(Ni) in Chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 &L		ギルソンFA10011
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンアバンティ極性脂質850375C-25mg 18:1 (&デルタ;クロロホルム
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE) ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE) ATTO 565 ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)Avanti Polar Lipids870273C-25mg18:1 Biotinyl Cap PE in Chloroform
200 µL イエローチップ 10 x 96 チップ、スタックStarlabS1111-0206
5 mL ポリスチレン丸底チューブFalcon®
5.00 ± 0.05 µm 非機能化シリカビーズBangs Laboratories Inc.
96ウェル細胞培養プレートU底蓋付き、組織培養処理済み、非発熱性。コスター®3799FCM染色およびBSLBおよび細胞の共培養用。
96ウェル細胞培養プレートV底蓋付き、組織培養処理済み、非発熱性。コスター®3894懸濁液中の細胞またはビーズのFCM染色用。
Alexa Fluor 488 NHS Ester (スクシンイミジルエステル)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (スクシンイミジルエステル)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A37573 および A20006
Allegra X-12R 遠心分離機ベックマン・コールターFCM
アルミ箔ブランドから細胞と BSLB を保護します
。
抗ヒトCD185(CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4BioLegend356934図1Eに示すように扁桃細胞の定量的FCM解析に
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19BioLegend302234図1Eに示すように扁桃細胞の定量的FCM解析に
クローンRPA-2.10BioLegend300202Alexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトCD2、クローンTS1/8BioLegend309218Brilliant Violet 421コンジュゲート
抗ヒトCD252(OX40L)、クローン11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647コンジュゲート
抗ヒトCD28、クローンCD28.2eBioscience16-0289-85Alexa Fluor 647 NHS Ester(Succinimidyl Ester)
抗ヒトCD317(BST2、PDCA-1)、クローン26F8ThermoFisher Scientific、invitrogen53-3179-42Alexa Fluor 488コンジュゲートにより、このクローンはクローンRS38Eよりもクリーンであることがわかりました。
抗ヒトCD38、クローンHB-7BioLegend356624Alexa Fluor 700コンジュゲート
抗ヒトCD38、クローンHIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647コンジュゲート
抗ヒトCD39、クローンA1BioLegendAlexa Fluor 647 NHSエステル(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトCD4ブリリアントバイオレット650、クローンOKT4BioLegend317436図1Eに示す扁桃細胞の定量的FCM分析には
、抗ヒトCD4、クローンA161A1BioLegend357414、357421PerCP/Cyanine5.5およびAlexa Fluor 647コンジュゲート、それぞれ
抗ヒトCD4、クローンOKT4BioLegend317414および317422PE/Cy7およびAlexa Fluor 647コンジュゲート、それぞれ
抗ヒトCD40、クローン5C3BioLegend334304Alexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトCD40、クローンG28.5BioLegendAlexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトCD45、クローンHI30BioLegend304056および368516Alexa Fluor 647およびAPC/Cy7コンジュゲート
抗ヒトCD47、クローンCC2C6BioLegend323118Alexa Fluor 647コンジュゲート
で社内標識抗ヒトCD54(ICAM-1)、クローンHCD54BioLegend322702Alexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトCD63(LAMP-3)、クローンH5C6BioLegend353020および353015PerCP/Cyanine5.5およびAlexa Fluor 647コンジュゲート、それぞれ
抗ヒトCD73、クローンAD2BioLegend344002Alexa Fluor 647 NHSエステル(スクシンイミジルエステル)
で社内標識抗ヒトCD80、クローン2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647結合
抗ヒトCD81、クローン5A6BioLegend349512および349502PE/Cy7結合し、それぞれAlexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)で社内で標識。
抗ヒトCD82、クローンASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647コンジュゲート
抗ヒトCD86、クローンIT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647コンジュゲート
抗ヒトCD8a、クローンHIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700コンジュゲート
抗ヒトCD8a、クローンSK1BioLegend344724Alexa Fluor 700コンジュゲート
抗ヒトHLA-A/B/C/E、クローンw6/32BioLegend311414および311402Alexa Fluor 647コンジュゲートおよびAlexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトHLA-DRで社内標識、クローンL243BioLegend307656および307622Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 647コンジュゲート
抗ヒトICAM-1、クローンHCD54BioLegend322702Alexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトICOS、クローンC398.4ABioLegend313516アルメニアハムスターIgG
抗ヒトICOSL、クローンMIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647コンジュゲート
抗ヒトICOSL、クローンMIH12eBioscience16-5889-82Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
抗ヒトLFA-1、クローン TS1/22BioLegendでラベルAlexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
抗ヒト OX40、クローン Ber-ACT35 (ACT35)BioLegend350018Alexa Fluor 647 コンジュゲート
抗ヒト PD-1、クローン EH12.2H7BioLegend135230 および 329902Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
抗ヒト PD-L1、クローン 29E.2A3BioLegend329702Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
抗ヒト PD-L2、クローン 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 コンジュゲート
抗ヒト PD-L2、クローン MIH18BioLegend345502Alexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)
抗ヒトTCRab、クローンIP26BioLegend306712、Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 647コンジュゲートをそれぞれ
antti-human CD156c (ADAM10)、クローン SHM14BioLegend352702
antti-human CD317 (BST2、Tetherin)、クローン RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 コンジュゲート
アルメニアンハムスター IgG Alexa Fluor 647 アイソタイプコントロール、クローン HTK888BioLegend400902Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beadsベクトン・ディキンソン&会社(BD)641319定量的なFCMの前の機器のパフォーマンストラック
FACSディーバクトンディキンソン&会社(BD)23-14523-00取得ソフトウェア
血清アルブミンメルク、シグマ-アルドリッチA3294
CaCl<サブ>2、塩化カルシウムメルク、シグマ-アルドリッチC5670無水、バイオ試薬、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥96.0%
カゼインは、プロテインキナーゼ(脱リン酸化後)の基質に適したウシ乳由来のカゼイン、精製粉末メルク、Sigma-AldrichC5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28ThermoFisher Scientific、Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific、Invitrogen™12321D2 mL未満の容量のDynabeads Human T-Activator CD3/CD28の除去用
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12301DDynabeads&tradeの除去用。15 mL未満の容量のヒトT-アクチベーターCD3/CD28
Fetal Bovine Serum Qualified, One ShotThermoFisher Scientific, GibcoA316080156 oC
Ficoll-Paque PLUSCytiva, GE HealthcareGE17-1440-02リンパ球単離のための多糖類とジアトリゾ酸ナトリウムの滅菌溶液
固定可能な生存率 Dye eFluor 780eBiosciences65-0865-14分析中の死細胞の排除について
FlowJoBecton Dickinson &会社 (BD)Version 10.7.1分析ソフトウェア
Grant Bio MPS-1 Multi Plate ShakerKeison ProductsMPS-1染色中の細胞の混合、またはスタン中またはタンパク質ローディング中のBSLBの混合用(軌道攪拌の代替として)
HEPES緩衝液(1 M)ThermoFisher Scientific, Gibco15630-056
HEPES、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N′-(2-エタンスルホン酸)、4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸。Merck, Sigma-AldrichH4034HBS/HASまたはHBS/BSAバッファーの調製用。BioPerformance認定、≥99.5%(滴定)、細胞培養に適しています
HERACell 150i CO2インキュベーター、150 L、電解研磨されたステンレス鋼ThermoFisher Scientific51026282精製されたCD4+およびCD8+ T細胞の培養および増殖用。
フラミキサー®サンプルミキサーサーモフィッシャーサイエンティフィック社、ライフテクノロジーズ15920DBSLBと脂質マスターミックスの混合、ブロッキング溶液、タンパク質マスターミックス、小規模抗体染色に使用される垂直可変角度ラボミキサーです。
ヒト血清アルブミン、30%水溶液メルク、シグマ-アルドリッチ12667-M
ヒト TruStain FcX Fc 受容体ブロッキング溶液BioLegend422302Fc 受容体ブロッキング溶液 生物学的に関連するサンプルから Fc 受容体を遮断するための
Innovatis CASY セルカウンターおよびアナライザー TTBiovendis Products GmbHセルのカウント、および電流の排除に基づくセルのサイズと体積の決定のため。
KCl、塩化カリウムMerck、Sigma-AldrichP5405粉末、BioReagent、細胞培養に適しています
L-Glutamine 200 mM (100x)ThermoFisher Scientific、Gibco25030-024
MgCl2、塩化 MagessiumMerck、Sigma-AldrichM2393BioReagent、細胞培養に適しています、昆虫細胞培養に適しています
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mLチューブKeison ProductsP-2-24Grant Bio MPS-1 マルチプレート シェイカー
ミニ インキュベーターLabnet International用マイクロチューブ インサート I5110A-230V非存在下でのBSLBと細胞のインキュベーション(共培養)用
ThermoFisher Scientific, Gibco11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody controlMerck, Sigma-AldrichPP54マウスIgGキャプチャービーズスタンダード
に結合した抗体の測定のためのポジティブコントロールとして使用されますマウスIgG1、kアイソタイプ、クローンMOPC-21BioLegend400129、400112、400130、400144、400128および400170Alexa Fluor 488、PE、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC/Cyanine7、およびBrilliant Violet 785 コンジュゲート
マウスIgG1、kアイソタイプ、クローンX40Becton Dickinson &会社(BD)、ホライゾン562438ブリリアントバイオレット421コンジュゲート。
マウスIgG1、&κ;アイソタイプコントロール、クローン P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
マウス IgG2a、k アイソタイプ、クローン MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 コンジュゲート
マウス IgG2b、k アイソタイプ、クローン MPC-11BioLegend400330 および 400355Alexa Fluor 647 および Brilliant Violet 785 コンジュゲートをそれぞれ
標識マルチウェル 6ウェル 真空ガスプラズマで処理した組織培養ファルコン353046精製されたCD4+およびCD8+T細胞の培養と拡大に。
Na2HPO4、リン酸二ナトリウムメルク、Sigma-AldrichS7907
NaCl、塩化ナトリウムメルク、Sigma-AldrichS5886BioReagent、細胞培養に適した、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥99%
NiSO4、硫酸ニッケル(II)、ク、シグマアルドリッチ656895NTAサイトを飽和させるため;ブロッキングプロセス中にペ
ニシリンストレプトマイシン[+]10,000単位ペニシリン;[+] 10,000 & マイクロ;g/mL ストレプトマイシンThermoFisher Scientific、Gibco15140-122
リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4、滅菌済みThermoFisher Scientific、Gibco10010Ca2+ または Mg2+ 添加
ポリエーテルスルホン (PES) フィルターユニットThermo Scientific Nalgene UY-06730-43結合性の低い親水性PESメンブレンは、タンパク質含有量の高い溶液のろ過を容易にします
PURESHIELDアルゴンISO 14175-I1-ArBOC Ltd.11-Y+4°Cで保存された脂質ストックの保護用。
精製ストレプトアビジンバイオレジェンド280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF ビーズBangs Laboratories Inc.488細胞に結合したAlexa Fluor 488分子の補間のためのベンチマークビーズおよび/またはBSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESFビーズBangs Laboratories Inc.647Alexa Fluor 647分子の補間のためのベンチマークビーズ 細胞および/またはBSLB
ラット抗マウスIgG Kappa Light Chain、クローンOX-20ThermoFisher Scientific、invitrogenSA1-25258Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)で社内標識 Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
組換えヒトIL-2Peprotech200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x);[-]L-グルタミンサーモフィッシャーサイエンティフィック、ギブコ31870-025
ロゼットヒト B 細胞濃縮カクテルSTEMCELL Technologies15064精製細胞集団中のタンパク質の密度を測定するためのB細胞の単離
ロゼットヒト CD4+ T 細胞濃縮カクテルSTEMCELL Technologies15022C.1
ロゼットヒト CD4+CD127低 T 細胞濃縮カクテルSTEMCELL技術15361FACSによる制御性T細胞の下流分離のためのCD4+ CD127LowT細胞の濃縮前。
ロゼット、ヒト、CD8+ T細胞濃縮、カクテル、STEMCELL Technologies15063
RPMI、Medium、1640(1x);[-]フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック、Gibco11835-063CO2の非存在下でのBSLBと細胞のインキュベーション(共培養)用。フェノールレッドフリー培地は、フローサイトメトリーおよび顕微鏡ベースの測定における細胞の自家蛍光を低減します。
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)ThermoFisher Scientific, Gibco11360-070
Sprout mini centrifugeFisherScientific, Heathrow Scientific LLC1203011.5 mL Eppendorf tubesでシリカビーズとBSLBを洗浄するために使用される卓上型微量遠心分離機です。
滅菌キャップ付き5 mLポリスチレン丸底チューブFalcon352058
UltraComp eBeads Compensation BeadsThermoFisher Scientific, invitrogen01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCOThermo Fisher Scientific, Invitrogen™89882
352052SS05003 任意の 軽い抗ヒト CD154 (CD40L)、クローン 24-31 BioLegend 310815 および 310818 Alexa Fluor 488 および Alexa Fluor 647 コンジュゲート、、で社内で標識されています。で標識。 で社内表示 306714で社内でラベル付けされています。BD ベ牛溶液 COminimal Essential Medium Non-Essential Amino Acidsの。メル物 タンパク質、、

参考文献

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528(2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

T細胞免疫シナプスシナプス間輸送小胞フローサイトメトリータンパク質密度測定抗原提示細胞超分子攻撃粒子キメラ抗原受容体蛍光活性化細胞選別ICAM-1定量
T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。