Method Article

シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

DOI:

10.3791/63131

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zurich, 2Department of Materials, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ流体プラットフォーム内の毛細管現象支援アセンブリを用いて、細菌やコロイドなどの液体中に浮遊するマイクロサイズの物体をポリジメチルシロキサン基板上の所定のアレイにパターニングする技術を提示する。

Abstract

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定義された空間配置への微生物の制御されたパターニングは、微生物生理学および相互作用の研究を含む、広範囲の生物学的用途のためのユニークな可能性を提供する。最も単純なレベルでは、微生物の正確な空間パターニングは、多数の個々の細胞の信頼性の高い長期イメージングを可能にし、距離依存の微生物 - 微生物相互作用を定量的に研究する能力を変革する。よりユニークなことに、マイクロ流体技術によって提供される正確な空間パターニングと環境条件の完全な制御を組み合わせることで、微生物生態学における単一細胞研究のための強力で汎用性の高いプラットフォームが提供されます。

このホワイトペーパーでは、マイクロ流体チャネル内で微生物の汎用性とユーザー定義のパターンを生成し、長期的かつ高スループットのモニタリングのための完全な光アクセスを可能にするマイクロ流体プラットフォームを紹介します。この新しいマイクロ流体技術は、毛細管現象支援粒子アセンブリに基づいており、マイクロ流体チャネル内の蒸発懸濁液の制御された動きから生じる毛細管力を利用して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上に微細化されたトラップのアレイに個々のマイクロサイズの物体を堆積させる。シーケンシャルデポジションは、トラップのジオメトリと充填シーケンスによってのみ決定される、単一または複数のタイプのマイクロサイズのオブジェクトの所望の空間レイアウトを生成する。

プラットフォームは、異なる寸法および材料のコロイド粒子を使用して較正されており、多様なコロイドパターンを生成し、捕捉された粒子の表面官能化を実行するための強力なツールであることが証明されています。さらに、プラットフォームを微生物細胞上で試験し、モデル細菌として 大腸菌 細胞を使用した。何千もの個々の細胞を表面にパターン化し、その成長を経時的にモニターした。このプラットフォームでは、単一細胞堆積とマイクロ流体技術を組み合わせることで、微生物の幾何学的パターニングと環境条件の正確な制御の両方が可能になります。したがって、予備実験によって示されているように、単一の微生物の生理学と微生物と微生物の相互作用の生態学への窓が開かれます。

Introduction

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単一の微生物の空間パターニングは、特にマイクロ流体デバイスなどの環境条件を完全に制御できる実験分野では、幅広い文脈で非常に望ましい。例えば、微生物を規則的な配列に配置することで、多数の個々の細胞を正確にイメージングし、それらの増殖、生理機能、環境刺激に応答した遺伝子発現、および薬物感受性の研究を可能にする。また、細胞コミュニケーション(例えば、クォーラムセンシング)、交配(例えば、藻類 - 細菌共生)、または拮抗作用(例えば、アレロパシー)に関する研究において特に関心のある細胞間相互作用を研究することを可能にする。細胞生理・進化研究1、細胞間相互作用研究2、表現型分化スクリーニング3、環境モニタリング4、薬物スクリーニング5 は、このような定量的単一細胞解析を実現できる技術から大きな恩恵を受けることができる分野の一つです。

近年、ホログラフィック光学トラップ6および不均一な表面機能化方法7,8,9,10から単一細胞ケモスタット11および液滴マイクロ流体

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Protocol

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1. シリコンマスターの準備

注:コロイドおよび微生物パターニングのためのテンプレートを形成する微細加工トラップを有するPDMSテンプレートは、Geisslerらによって導入された方法に従って作製された。17。 シリコンマスターは、クリーンルーム内で通常のリソグラフィー法により作製した。手順については次の手順を参照し、機器 の材料表 を参照してください。

  1. コンピュータ支援設計 (CAD) ソフトウェアを使用して機能を設計します。
  2. UVダイレクトレーザーライターで設計された特徴を露光することによって、ポジ型フォトレジストの層を有するクロムガラスマスクを準備する。
    1. クロムガラスマスクを、1:4のフォトレジスト対水比で15秒間現像液を用いてスピン現像液で現像する。
    2. マスクをクロムエッチャントに50秒間浸します。
    3. 10cmのシリコンウェーハを600Wで3分間プラズマ処理する。
    4. ヘキサメチルジシリザンの層を蒸着し、110°Cでベークするとフォトレジストに対する密着性が向上した。
    5. フォトレジストの層を4,500× g で2分間堆積させる。
    6. マスクアライナーで....

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Results

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毛細管現象支援アセンブリを利用して、PDMSテンプレート上に微細加工されたトラップにコロイド粒子と細菌をパターン化するマイクロ流体プラットフォームが開発されました。毛細管現象支援アセンブリによるコロイドと細菌のパターニングを最適化するために、2つの異なるチャネル形状が設計されています。最初のチャネル形状(図1B)は、長さ23mmの平行な3つのセクションで構成され、それらの間に物理的な障壁はありません。側面の2つのセクションは幅5mm、高さ1mmで、中央セクションは幅7mm、高さ500μmです。この設計は、後退する凸状のメニスカスを有する明確に定義された可動液滴を維持するのに役立つ。このプラットフォームの動作原理は、Pioliらによって詳細に説明されています。実験で横方向の流路を充填する必要がある場合、細菌培養の場合のように、通常、エアポケットが形成される。このため、チャネルを媒体でフラッシュしたときの充填プロセスを簡素化する2番目のジオメトリを設計してテストしました。この場合、プラットフォーム(

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Discussion

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ここで説明するマイクロ流体プラットフォームは、コロイドや細菌などのマイクロサイズの物体をPDMS基板上の所定の空間配置にパターニングすることを可能にする。マイクロフルイディクスが提供する環境条件を完全に制御し、sCAPA技術によって付与されたマイクロメトリック精度で細胞をパターン化する能力により、将来の生理学および生態学研究にとって非常に有望なプラットフォームとなっています。

本研究で提示した実験では、 材料表に報告されたフォトレジストを用いてシリコンマスターを実現した。しかし、PDMS成形で説明され、使用可能なサイズ範囲のフィーチャーを製造するのに適した任意のフォトレジストを使用することができる。マイクロ流路モールドの作製に用いた3D印刷用樹脂についても同様である。記載された寸法の特徴を生成し、PDMS成形と互換性のある任意の樹脂を使用することができる。

このプロトコルでは、マイクロ流体チップを70°Cで5日間保管することで、Tween 20を細菌またはコロイド懸濁液に添加したときの表面親水.......

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Disclosures

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著者らは、開示する利益相反はありません。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アルカテルAMS 200SE I-Speederアルカテルマイクロマシニングシステム深部反応性イオン交換システム
アルコノックス洗剤
AZ400K現像液MicroChemicalsAZ400K
BD 10 mLシリンジ(ルアーロック)BD300912新鮮なLysogenyブロスをマイクロ流体チャネルに流すために使用されます
ボックスインキュベーターライフチャネル内の均一で一定の温度を確保するために使用される
遠心分離エッペンドルフ5424R一晩の媒体を新鮮な最小限の媒体に置き換えるために使用されます
遠心分離機バイアルエッペンドルフ30120086 1.5 mL
CETONI Base 120CETONI GmbHシリンジポンプ
直径0.98 & マイクロの蛍光PS粒子;m (red)microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi267
直径1.08の蛍光PS粒子 &m (green)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi182
直径2.07の蛍光PS粒子 &m (green)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi183
直径2.08の蛍光PS粒子 &10cmmicroParticles GmbHPS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 MPVA TePla
H401-T-CONTROLLERガラス板のOkolab
H601-NIKON-TS2R-GLASSOkolab加熱ガラス板
ハイデルベルクDWL 2000デルベルグ機器UVダイレクトレーザーライター
スリンシリンジ、U 100、ルアーCodan Medical ApSCODA6216401 mLシリンジを使用して、パターニングプロセス中に液体懸濁液を回収するために使用
KlayoutOpensourceシリコン
マスターLBブロス、ミラー(Luria-Bertani)フィッシャーサイエンティフィック244610Lysogenyブロスをマイクロ流体チャネルMasterflexにフラッシュしました
トランスファーチューブMasterflexHV-06419-050.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)TeknovaM210110倍をミリQ水で10倍に希釈し、一晩中媒体の交換に使用
コンエクリプス Ti2ニコンインスツルメンツ顕微鏡
openSCAD金型の設計に使用
OPTIspin SB20ATMグループ51-0002-01-00現像
液 プラズマチャンバー ZeptoDiener 電子ZEPTO-1テンプレートとマイクロチャネルをプラズマ処理してそれらを結合するために使用される
ポジティブフォトレジスト AZ1505MicroChemicalsAZ1505
リン酸カリウム二塩基性Sigma AldrichP3786MOPS 1x
Prusa 硬化および洗濯機 CW1SPrusaに追加すべてのポリマーが硬化し、未硬化のポリマーが型から除去されることを確認するために使用されます
Prusa Resin - ToughPrusa Research a.s.3Dプリント用UV感光性405nm液体樹脂
Prusa SL1 3Dプリンターモールドのプリントに使用
スケールVWR-CH611-2605PDMS混合物の重量に使用
シリコンウェーハ(10cm)シリコンマテリアルズ株式会社N/フォス <100> 1-10 & オメガ;cm
Süss MA6 マスク アライナーSUSS MicroTec グループクロムガラス マスクと基板を位置合わせし、基板を露出させるために使用されます
シルガード 184ダウ コーニングシリコーン エラストマー キット; 硬化剤
テクニ エッチング Cr01テクニッククロム エッチング
トリクロロ (1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル) シランシグマ アルドリッチ4489313Dプリント金型をシリアン化するために使用されます
TWEEN 20Sigma AldrichP1379パターニング プロセス中に最適な後退接触角を確保するために使用されます
Veeco Dektak 6 MVeecoプロファイラー
VTC-100 バキューム スピン コーターMTI コーポレーションバキューム スピン コーター
、イメージングサービス 機 シリコンウェーハのプラズマ処理に使用されるm(赤)加熱ガラス板の 加熱コントローラー ハイインは、 ニスピンは、

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
  2. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R.

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