カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

サマリー

このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。

要約

Caenorhabditis elegans(C. elegans) は、発生および細胞生物学的プロセスを研究するための貴重なモデルシステムであることが証明されています。これらの生物学的プロセスを理解するには、多くの場合、同じ動物の長期にわたる繰り返しのイメージングが必要です。寒天パッドで行われる従来の固定化方法に関連する長い回復時間は、動物の健康に悪影響を及ぼし、同じ動物を長期間にわたって繰り返し画像化することは不適切です。この論文では、マイクロ流体チップの設計、製造方法、オンチップ C.エレガンス 培養プロトコル、および個々の動物の発生過程を研究するための長期イメージングの3つの例について説明します。ポリジメチルシロキサンで作製し、カバーガラス上に接着したチップは、窒素ガスを用いて偏向されたエラストマー膜を用いてガラス基板上に動物を固定化する。 C.エレガンス の完全な固定化により、麻酔薬を使用しない方法で細胞および細胞内イベントの堅牢なタイムラプスイメージングが可能になります。大きな断面を有するチャネル形状は、動物が2つの部分的に密封された隔離膜内を自由に動くことを可能にし、連続的な食物供給を伴うチャネル内の成長を可能にする。このシンプルなチップを用いて、PVD感覚ニューロンにおける神経突起の成長、外陰部の発達、樹状突起の樹状突起などの発生現象を、動物がチャネル内で成長するにつれてイメージングすることができます。長期的な成長およびイメージングチップは、単一の圧力ラインで動作し、外部バルブ、安価な流体消耗品がなく、 C.エレガンスを使用する他のラボで簡単に適応できる標準的なワーム処理プロトコルを利用しています。

概要

Caenorhabditis elegansは、細胞生物学、老化、発生生物学、および神経生物学を研究するための強力なモデル生物であることが証明されています。その透明な体、短いライフサイクル、容易なメンテナンス、定義された数の細胞、いくつかのヒト遺伝子との相同性、およびよく研究された遺伝学などの利点により、C.エレガンスは基礎生物学の発見と応用研究の両方で人気のあるモデルになりました^1,2。個々の動物の繰り返しの長期観察から細胞の生物学的および発生的プロセスを理解することは有益であることがわかります。従来、C.エレガンスは寒天パッド上で麻酔をかけ、顕微鏡下で画像化されていました。動物の健康に対する麻酔薬の悪影響は、同じ動物の長期および反復断続的なイメージングのための麻酔動物の使用を制限します^3,4。近年のマイクロ流体技術の進歩と、健康被害が無視できるほどのC.エレガンスの無麻酔トラップへの適応により、同じ動物の短期間および長期間にわたる高解像度イメージングが可能になりました。

マイクロ流体チップは、C. elegans'5ハイスループットスクリーニング6,7,8、トラップおよび分注⁹、薬物スクリーニング10,11、高解像度イメージングによるニューロン刺激12、および動物の高解像度イメージング^12,13,14用に設計されています。スライドに固定化するための超薄型マイクロ流体シートも開発されている¹⁵。C.エレガンスの長期研究は、液体培養で成長する動物の低解像度画像を使用して、成長、カルシウム動態、行動に対する薬物の影響^{を観察して行われています16,17,18,19}、それらの寿命、および老化²⁰。シナプスの発達21、ニューロンの再生²²、およびミトコンドリアの付加²³を評価するために、高解像度顕微鏡を使用した長期的な研究が行われています。細胞の運命および分化の長期高解像度画像化および追跡は、マルチチャネルデバイス^24,25で行われている。いくつかの細胞および細胞内イベントは数時間の時間スケールで発生し、in vivoでの細胞動態を理解するためのプロセスのすべての中間ステップを特徴付けるために、発生中の異なる時点で同じ個体をトラップする必要があります。器官形成、神経発生、細胞移動などの生物学的プロセスを画像化するには、動物を複数の時点で同じ方向に固定化する必要があります。我々は以前、ミトコンドリアが触覚受容体ニューロン(TRN)に沿って付加される場所を決定するために、C.エレガンスを36時間以上高解像度イメージングするためのプロトコルを公開しました²³。

この論文は、高解像度イメージングを繰り返すためのマイクロフルイディクスベースの方法論を確立するためのプロトコルを提供します。この装置は、単一の流路を有し、装置ごとに1匹の動物の繰り返しイメージングに最適です。スループットを向上させ、一度に多くの動物を画像化するために、複数のデバイスを同じ圧力ラインに接続できますが、各デバイスの1匹の動物を制御する別々の3ウェイコネクタを使用します。このデザインは、胚発生後の発生過程、細胞移動、オルガネラ輸送、遺伝子発現研究など、高解像度のタイムラプス画像を必要とする研究に役立ちます。この技術は、多くの後期動物の並行成長とイメージングを必要とする寿命や老化の研究など、一部のアプリケーションに制限される可能性があります。ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーは、その生物学的安定性²⁶、生体適合性^27,28、気体透過性^29,30、および調整可能な弾性率³¹のために、このデバイスの製造に使用されました。この2層装置は、マイクロ流体チャネルでの連続的な食物供給と、窒素ガスを使用したPDMS膜圧縮による個々のC.エレガンスの捕獲により、動物の成長を可能にします。この装置は、連続的な^{食物供給3}の下でマイクロチャネル内で同じ動物を成長および画像化できるという利点を有する以前に公開された装置の拡張である。追加の分離膜ネットワークと2mm幅のトラップ膜により、発育中の動物の効率的な固定化が可能になります。このデバイスは、感覚PVDニューロンのニューロンの発達、外陰部の発達、および樹状突起の樹木形成を観察するために使用されています。動物は、デバイス内で健康に悪影響を与えることなく成長し、その発生中に同じ動物における細胞内イベントのイメージングを容易にするために繰り返し固定化することができる。

プロトコル全体は5つの部分に分かれています。パート1では、成長およびイメージングチップのデバイス製造について説明します。パート2では、PDMS膜たわみの圧力システムを設定して、個々の C.エレガンスを固定化して分離する方法について説明します。パート3では、デバイスイメージングのために線虫増殖培地(NGM)プレート上で C.エレガンス を同期させる方法について説明します。パート4では、1匹の動物をデバイスにロードし、マイクロ流体デバイス内で数日間動物を成長させる方法について説明します。パート5では、複数の時点で個々の動物を固定し、さまざまな対物レンズを使用して高解像度の画像をキャプチャし、フィジーを使用して画像を分析したりする方法について説明します。

プロトコル

1. 成長・イメージングデバイスの作製

1. SU8金型製作
   1. ワープロソフト(またはコンピュータ支援設計CADソフト)で矩形を使用してパターン1(フロー層)とパターン2(制御層)を設計し、ポリエステル系フィルムに最小フィーチャーサイズ8μmのレーザープロッターを使用してフォトマスクを印刷します(図1)。
   2. シリコンウェーハを2.5cm×2.5cmにカットし、20%KOHで1分間洗浄します。ウェーハを脱イオン(DI)水ですすいでください。フロー層と制御層にそれぞれ1枚のウェーハを使用します。
      注意: KOHは腐食性であるため、取り扱いには注意が必要です。
   3. 14psiの圧縮窒素ガスでピースを乾燥させた後、ホットプレートで120°Cで4時間脱水します。次のステップに進む前に、2つのピースを室温まで冷却します。
   4. シリコン片の1つを取り、スピンコーターのチャックに置き、真空をオンにしてウェーハを所定の位置に保持します。シリコン片に~20μLのヘキサメチルジシラン(HMDS)を入れ、スピンコーターで毎分500回転(rpm)で5秒間、続いて3,000rpmで30秒間コーティングします。
      注意: この手順は黄色のライトで実行する必要があります。室内で白色光を使用しないでください。
   5. ~40 μmの均一なフォトレジスト厚さを得るには(フロー層に固有で、初期の幼虫のステージ1からステージ3(L1-L3)の動物のイメージングに適しています)、スピンコーターを使用して500 rpmで5秒間、続いて2,000 rpmで30秒間、シリコンウェーハに~1.5 mLのネガフォトレジスト-1をコーティングします。
   6. 2枚目のウェーハで手順1.1.4と1.1.5を繰り返して、制御層に固有の~40μmの均一なフォトレジスト厚さを取得します。
   7. あるいは、高齢の動物のためにフロー層の厚さを~80μmに増やすには、スピンコーターを使用して500rpmで5秒間、続いて2,000rpmで30秒間、シリコンウェーハを~1.5mLのネガフォトレジスト-2でコーティングします。この厚さは、成体動物へのL3段階に適しています。
      注意: スピンコート層への損傷を防ぐため、シリコンウェーハは側面を持ってください。この手順の間、白色ライトをオフのままにします。
   8. フォトレジストでコーティングされたシリコン片(フロー層および制御層用)をホットプレート上で65°Cで1分間焼き、続いて95°Cで10分間ベークします。焼きたての部分を室温に冷却します。
      注意: 焼きたてのシリコン片は、次のステップに進む前に1日間保管できます。暗所に保管し、白色光にさらさないでください。
   9. UVイルミネーターの露光ステージにソフトベークしたシリコン片を置き、フォトレジストコーティング面をUVランプに向けます。200 Wのランプを使用して、パターン1と2のフォトマスクを通して、2つのピースを別々にUVに15秒間さらし、それぞれフローレイヤーとコントロールレイヤーを取得します。
      注意: 安全ゴーグルを着用し、紫外線に直接さらさないようにしてください。この段階では、部屋の白色光を点灯しないでください。
   10. コーティング層を上に向けて露出した2つのシリコン片を65°Cで、続いて95°Cでそれぞれ1分と10分間焼きます。次のステップに進む前に、ピースを室温まで冷却します。
   11. シリコン片をフォトレジスト現像液(現像液をイソプロパノールで1:3に希釈)に20分間浸してパターンを現像します。パターンが見えたら、純粋なイソプロピルアルコール(IPA)ですすぎ、窒素ガス(14 psi)を使用して静かにブロードライします。
       注意: 人体への暴露を避けるために、この化学処理には換気の良い環境を使用してください。白色光は、機能が開発され、IPAですすいだ後にのみ使用してください。
   12. シリコン片は、コーティングされた面を上に向けてデシケーターに入れます。50 μLの純粋なトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランを小さなプラスチックカップまたはスライドガラスに注ぎ、破片をシラン蒸気にさらします。カップ/スライドをデシケーターの中に置き、2時間インキュベートします。
       注意: シラン蒸気に直接さらさないでください。シラン蒸気処理には常に密閉チャンバーを使用してください。
       注意: 必要に応じて、開発されたシリコン片を1〜2日間保管してから、次のステップに進むことができます。
2. PDMSチップ製造
   1. エラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で混合することにより、プラスチックカップにPDMSを作成します。3分間絶えず攪拌して内容物をよく混ぜます。混合により、PDMSミックスに多くの気泡が発生します。
   2. PDMSミックスをデシケーターで30分間脱気して、すべての気泡を取り除きます。
      注意: 気泡は欠陥のある機能しないデバイスを引き起こす可能性があるため、機能に注ぐ前に、PDMSミックスから気泡が除去されていることを確認してください。
   3. 制御層(パターン2)のあるシリコンウェーハをペトリ皿に入れます。厚さ5mmのPDMSミックス層をシリコン片にそっと注ぎ、気泡の形成を防ぎます。
   4. PDMSミックスをデシケーターで脱気して、PDMS注入プロセス中に形成される追加の気泡を除去します。
   5. フロー層(パターン1)を備えたシリコンウェーハをスピナーチャックに置き、200〜500mTorrの真空圧を加えてウェーハを保持します。シリコンウェーハに~1 mLのPDMSを注ぎ、スピンコーターを使用して500 rpmで5秒間、続いて1,000 rpmで30秒間コーティングして、~80 μmの厚さの層を得ます。
   6. スピンコートされたPDMSで2つのシリコンウェーハを焼き、PDMS層を熱風対流式オーブンで50°Cで6時間注ぎました。焼いた後、室温で冷えるのを待ちます。
   7. 鋭利な刃を用いて制御層(パターン2)の周りのシリコン片から厚さ5mmのPDMS層を切り取り、シリコン基板から剥離します。
   8. PDMSブロックのリザーバーにハリスパンチャーを使用して直径~1mmの2つの穴を開け、固定化チャネルと隔離チャネルの入口をPDMS膜偏向用のガスラインに接続します。
   9. パターン1(フロー層)上にスピンコートされたPDMS層を備えたシリコン片を、PDMSコーティングされた表面を上に向けて、プラスチックトレイに置きます。パターン2(制御層)のパンチされたPDMSブロックを、成形面を上に向けてトレイに保管します。
   10. プラスチックトレイをプラズマクリーナー内に保ち、2つのPDMS表面を低真空(200〜600 mTorr)下で2分間18 Wエアプラズマにさらします。チャンバーが明るい紫色に変わるまで真空を適用します。暗い場所でこの手順を実行して、プラズマの色の変化を確認します。
   11. プラズマ処理された2つのブロックを取り出し、パターン1とパターン2のプラズマ処理面を一緒に押してブロックを穏やかに結合します。接着パターンを熱風対流式オーブンで50°Cで2時間焼きます。
   12. 接着されたデバイスをオーブンから取り出します。パターン1とパターン2のシリコンウェーハから接合されたデバイスを切り出し、ハリスパンチャーを使用してフロー層の入口と出口のリザーバーに穴を開けます。
   13. フロー層を上に向けて接着されたPDMSブロックをプラスチックトレイに置きます。同じトレイに清潔なカバーガラス(#1.5)を置いてください。ブロックとカバーガラスを18Wの空気プラズマに2分間さらします。真空圧を調整して、紫色のチャンバーを確認します。
       注意: この手順は、プラズマの色の変化を確認するために、暗い場所で実行する必要があります。カバーガラスを洗浄するには、IPAで洗浄し、窒素ガスを使用して14psiでブロードライします。
   14. プラズマ露出したPDMSブロックをカバーガラスの上に置き、接合した構造を50°Cのオーブンで2時間焼きます。将来の実験のために、デバイスをクリーンチャンバーに保管してください。

2. PDMSメンブレンプライミング

1. 装置を取り、実体顕微鏡に置き、チューブを取り付けます。マイクロフレックスチューブ(内径~5mm、外径~8mm)を一端の圧縮窒素ガスラインに接続します。もう一方の端に三方コネクタを接続します。三方コネクタのチューブ1と2は、それぞれトラップと隔離膜に接続されます。
2. 2本のマイクロフレックスチューブ(内径~1.6mm、外径~5mm)を三方活栓の2つの出口ポートに接続します。2本のチューブのもう一方の端を長さ8mmの18G針に接続します。
3. 入口ポートを通してマイクロピペットを使用して、フロー層をM9バッファーで満たします。針に接続された端から両方のチューブにDI水を入れます。2本の針をパンチ穴に挿入し、それぞれ隔離膜と捕捉膜を接続します。
4. 窒素ガスレギュレーターを14psiで開き、チューブ1から三方弁を回して、制御層のマイクロ流体チャネル、つまりトラップ膜と隔離膜を介して水をデバイスに押し込みます。
5. 両方のチャネルに空気滴が存在せずに水がチャネルを満たすまで待ちます。チャネルが水で満たされると、チャネルはプライミングされていると見なされます。
6. チャネルが水で満たされ、プライミングされたら、三方活栓を使用して圧力を解放します。プライミングは、流動層内に気泡を生じさせることができ、流路を通して追加の媒体を流すことによって気泡を除去する。

3. C.エレガンスの メンテナンスと同期

注:C.エレガンス株:この研究では、外陰部の発達32に以下の導入遺伝子PS3239(dpy-20(e1282)syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+)+ pJB100(ZMP-1::GFP)])、タッチ受容体ニューロン(TRN)の発生とミトコンドリア輸送イメージングにjsIs609(mec7p::MLS(ミトコンドリアマトリックス局在シグナル)::GFP)³³、PVDの発達を追跡するためにwdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+))を使用しました³⁴。標準C.エレガンスの培養および維持プロトコルは³⁵に従った。

1. 線虫増殖培地(NGM)ペトリプレート上で大腸菌OP50を食物源として22°CでC.エレガンスを増殖させる。 数匹の雌雄同体を繰り返し移すか、数匹の動物を含む少量の寒天をOP50芝生を備えた新しいNGMプレートにチャンクすることにより、C.エレガンス株を維持します。
2. 3〜5日後、NGMプレートで動物の成長と C.エレガンスの 卵を確認します。約30個の卵を集めて、プレートからOP50芝生の新鮮なNGMプレートに移します。
3. 動物をイメージング用に同期させるには、孵化していないすべての卵を2時間ごとにプレートから新しいプレートに移し、22°Cに維持します。 各プレートに約15〜20個の卵が孵化します。
4. 幼虫2(L2)と幼虫3(L3)の段階で、孵化後14〜16時間から28〜30時間の間に動物を選びます。動物をイメージングのためにマイクロ流体デバイスに移します。次のセクションで説明するように食物供給を追加して、長期的な成長とイメージング実験のためにデバイス内に動物を維持します。

4. C. エレガンス の成長とイメージングマイクロ流体デバイスの内部

1. 成長・イメージング用マイクロ流体デバイスを倒立顕微鏡上にマウントし、パターン2を見て、隔離膜と固定化膜を接続した後、低倍率(4倍または10倍)で観察する。チャネルがきれいな蒸留水で満たされていることを確認してください。
2. pH 6.0の1 Mクエン酸カリウム10 mL、微量金属溶液10 mL、1 M CaCl₂ 3 mL、1 M MgSO₄ 3 mLを使用して、S培地の新しい1 L溶液を調製します。無菌条件下で溶液を調製する。S培地をオートクレーブしないでください。
3. 実験の10分前に流路を増殖培地(S培地)で満たす。流路に気泡が入らないようにしてください。気泡を除去するために、必要に応じて追加の媒体を流します。
4. マイクロピペットを使用して、10 μLのS培地中のNGMプレートから必要な発生段階から1匹の動物を選び、その動物を入口孔を通して流路に押し込みます。
5. 低倍率対物レンズを使用して流路内の動物の位置を監視します。入口または出口に追加の培地を流して動物を押し、2つの隔離膜の間に制限された流路内に配置します。
6. 三方活栓を開いて、絶縁チャネルに14psiの圧力をかけ、膜を流路に押し下げます。
   注:メンブレンは流路を部分的に密閉し、動物の動きを2つの隔離メンブレンの間の領域に制限します。
7. ストリークプレートからの 大腸菌 OP50の単一コロニーを使用して、250 mLのLブロス(2.5 gのバクトトリプトン、1.25 gのバクト酵母、1.25 gの_H2O中のNaCl)を接種します。接種培養物を37°Cで一晩生育させる。
8. 500 μLのOP50培養液を1.5 mL滅菌遠心チューブに分注し、ストックとアリコートを4°Cで2週間保存します。
9. OP50培養液を1.3 x g で5分間遠心分離してペレットダウンします。ペレットを1 mLの新鮮なS培地(0.5倍希釈)で溶解し、室温で3〜4日間保存します。この希釈OP50を使用して、マイクロ流体デバイス内の C.エレガンスを供給します 。
10. 流路内のS媒体の蒸発を減らすために、入口と出口のリザーバーの上にS媒体を一滴残します。
11. 希釈したOP50溶液を10 μLマイクロピペットに入れます。OP50溶液で満たされたマイクロチップをピペットから取り出し、チップをインレットリザーバーに圧入します。次に、別のマイクロピペットチップに10 μLの食品溶液を置き、出口リザーバーに挿入します。
12. 指で圧力をかけながら先端ヘッドを密閉し、エアギャップのない食品溶液の連続性を確保します。マイクロピペットチップをOP50溶液で毎日交換し、3〜4日以内です。
13. 両方のチップに追加の20〜30μLの食品溶液を充填します。マイクロピペットチップに食品溶液を追加または削除して、勾配を調整して動物を流路に押し込み、イメージングのためにトラッピング膜の下で動物の位置を調整します。
14. 明視野画像を使用して、細菌の流れを監視し、流路内の部分的に閉じた隔離膜を通って連続していることを確認します。
    注:細菌の流れがない場合、動物は2つの分離膜間の流路で利用可能な細菌を食べる可能性があります。チャネルに細菌がない場合、または流れがない場合は、入口と出口の2つのマイクロピペットチップを、作りたての食品で満たされた新しいピペットチップと交換します。

5. C.エレガンスの 固定化とイメージング

1. C.トラ ッピング膜下のエレガンス固定化
   1. 低倍率で成長チャネル内の単一の動物を見つけます。入口と出口のリザーバーに接続された2つのマイクロピペットチップで食品溶液の高さを調整します。流路の静水圧差を使用して、動物を必要な方向に押します。
   2. 動物を捕獲膜の中央に配置し、低倍率の対物レンズ(4倍)を使用してその水泳行動を監視します。
   3. 三方活栓を回して、トラップチャネル内の圧力をゆっくりと上げます。成長チャネル境界壁に沿ってまっすぐな姿勢でトラップ膜の下に動物を固定する。
      注意: ZまたはUの曲げ位置で流路を横切って動物を閉じ込めないでください。これにより、動物の体がより大きな圧力で圧迫され、その健康に永久的な損傷を与えます。
2. C.エレガンスの イメージングと膜からの放出
   1. 顕微鏡ステージにデバイスを運び、積み込みます。高解像度明視野、微分イメージングコントラスト(DIC)、または蛍光イメージングに必要なすべての光学部品(対物レンズ、光源、蛍光フィルター、検出器)を備えた倒立顕微鏡を目的のイメージング設定でセットアップします(補足図1)。
   2. 単一または複数のタイムラプス蛍光画像を取得して、細胞および細胞内イベントをキャプチャします。
   3. 回転ディスク顕微鏡上で、60倍、1.4個の開口数(NA)対物レンズ、7%〜10%のレーザー出力を持つ488nmの波長レーザー、CCDカメラを使用して、 C.エレガンス ニューロンの蛍光画像を発生の関数として取得します。顕微鏡に付属のソフトウェアでタイムラプス撮影を行い、毎秒4フレームの速度で画像を取得します(補足図1)。
   4. 画像を取得した後、捕集圧を解放し、4倍と10倍の低倍率で動物の移動を監視します。動物を隔離膜によって定義された領域内に制限します(実験中ずっと14psi未満に保たれます)。
   5. 2つのマイクロピペットチップの食品溶液の量を調整して、成長チャネル内のゆっくりとした重力駆動の食品の流れを継続します。この食品の流れは、入口と出口のマイクロピペット内の食品溶液のレベルを調整することによって得られます(通常、高さ差は1〜5 mm)。
   6. 成長チャネル内の細菌の流れパターンから明視野下の流れを視覚化します。
      注:流れがない場合、動物は利用可能なOP50バクテリアを食べ、チャネルは透明に見え、動物は数時間にわたって飢えます。飢餓状態の動物は通常、高い自家蛍光を発し、タイムラプス蛍光画像を取得するときに容易に観察できます。このような事象は動物生理学に有害な影響を及ぼし、実験では回避された。
   7. 所定の時間間隔の後に手順5.2.1〜5.2.3を繰り返して、複数の時点で同じ個人の蛍光/ DIC/明視野画像を取得します。
   8. 同じ個々の動物から複数の所望の時点で画像を取得した後、単離および捕捉圧力を解放する。チャネルをM9バッファーで洗い流し、動物を入口リザーバーに押し込みます。リザーバーから動物を回収し、さらなる健康モニタリングのために動物を新鮮なNGMプレートに置きます。
   9. チャネルをM9バッファーで数回洗い流して、細菌を除去します。流路を70%エチルアルコール(蒸留水で希釈)ですすいでください。注射器を使用して空気を押してチャネルを乾燥させます。将来繰り返し使用するために、乾燥したほこりのない場所にデバイスを保管してください。
3. 画像解析と統計
   1. TIFF画像解析にはFIJI ImageJソフトウェアを使用してください。フィジーImageJの wdIs51 動物からのPVDタイムラプス画像のTIFF画像を開きます。[ Z > プロジェクトのスタック]>[画像]タブを選択して、主要なプロセスを示すz平面のスタックから最適な平面を抽出します。
   2. 一連の画像全体をスクリーニングし、動物の画像フレームの重なり合うセクションを使用して、ニューロンプロセス全体を正常にカバーする特定の画像フレームを見つけます。プラグインを選択して>FIJIツールバーからセル カウンター>分析 します。これにより、さまざまなブランチに番号を付け、選択した各ニューロンの数を保持するためのウィンドウが開きます。
   3. [ Type1 > > カウンターの初期化] を選択し、セカンダリ ブランチをマークします。次に、 タイプ 2を選択して 第四紀をマークし、すべてのブランチの数を示す 結果 ウィンドウをクリックします(補足図2)。このメソッドは、すでにカウントされているブランチを表示します。
   4. 次の重なり合う画像を開き、残りのブランチを数えます。このプロセスにより、二重カウントが防止され、すべてのプロセスが確実にカウントされます。 C. elegansの初期幼虫期に存在する一次枝の総数を特定して数えます。高齢動物の二次および四次過程の画像に対して同様の分析を実行します。
      注:成人は、体壁の筋肉を神経支配する多くのプロセスを示し、数えるのが難しい場合があります。すべてのプロセスが一度だけカウントされるようにします。
   5. PVD細胞体(CB)からPVC CBへのセグメント化された線を引くことにより、 wdIs51 動物におけるPVD細胞体間の距離を計算する。幼虫4(L4)期の動物の場合、細胞体は遠く離れており、60倍の対物レンズで画像化された場合、同じフレーム内にありません。
   6. ImageJのスタック> Zプロジェクト>[画像]タブ を使用して、スタックから重なり合う画像を選択して、頭から尾までの動物の長さ全体をカバーします。PVDとPVC CBの間のニューロンプロセスに沿ってセグメント化された線を引きます。
   7. ImageJ を使用して、すべてのセグメント化された線の長さを測定し > [分析>測定] を使用します。すべてのセグメントの長さを加算して、各時点のPVDとPVC CBの合計距離を計算します。
   8. jsIs609動物のTRNのニューロン長については、フィジーで画像をロードします。細胞体から最初のミトコンドリアの重心まで、後外側微小管(PLM、可溶性GFPで見える)に沿ってセグメント化された線を引きます。最初の距離値のラインの長さを計算します。
   9. 最初のミトコンドリアの中心から2番目のミトコンドリアの中心からセグメント化された線を引きます。ニューロンのプロセスの長さの終わりまで、ミトコンドリアの各ペアについてこのプロセスを繰り返します。すべての長さを加算して、ニューロンの突起の合計長を計算します。
   10. 細胞系譜解析では、フィジーのすべての外陰部画像をロードし、複数のZ平面のタイムラプス画像から細胞のベストフォーカス画像を抽出します。
   11. データを平均の標準誤差±標準誤差(SEM)として表します。2つ以上のサンプルに対して一元配置分散分析を使用して、または2つのサンプルのペアに対して2サンプルのt検定を使用して、統計的有意性を計算します。有意性を p 値 < 0.05 (*)、p 値 < 0.005 (**)、p 値 > 0.05 (ns、有意ではない) で示します。

結果

デバイスの特性評価: 成長およびイメージングデバイスは、不可逆プラズマ結合を使用して結合された2つのPDMS層(図1)で構成されています。長さ10mm、高さ40μmまたは80μmの流動層(パターン1)により、液体培養で動物を成長させることができます(図1A)。捕捉層(パターン2)は、高解像度イメージングのために動物を固定化するための2mm幅の膜(図1B)を有する。捕捉層用のマスクはまた、連続する画像化時点間の流路のセクション内の動物の動きを制限するための一対の隔離膜を作成する。装置の捕集膜は、我々の以前の撮像装置³から適合されている。現在の装置(図1C、L)には、複数の時間ポイントにわたって同じ動物を効率的に固定化するために、分離膜を追加し、捕捉膜の幅を2mmに増やすことが含まれています...

ディスカッション

この論文では、成長中の単一の動物の一定の食物供給と高解像度イメージングを備えた C.エレガンス を成長させるための単純なマイクロ流体デバイスの製造と使用のためのプロトコルが説明されています。この製造プロセスは簡単で、非滅菌環境で行うことができます。製造段階では、ほこりのない環境が重要です。ダスト粒子の存在は、2つの結合面間の不適切な接触につながり、 C.エレガンス が固定されている間、高圧印加中のデバイスの結合不良および漏れをもたらす。製造されたすべてのデバイスのうち、95%のデバイスが実験に適しています。製造中または使用中の不適切なボンディングが原因で、少数のデバイス(5%)が故障します。世界中のいくつかの学術機関で利用可能な無塵(>1,000グレードのクリーンルーム)内で製造プロセスを実行することで、接着の失敗を減らすことができます。流路からバクテリアフードをきれいにし、デバイスの再利用を可能にするには、実験のたびにアルコールを流してデバイスを洗い流します。

このプロトコルは、C. elegansのさまざまな発生段階やサイ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
18 G 針	Sigma-Aldrich、バンガロール、インド	ゲージ 18
3 ウェイ ストップコック	Cole-Parmer	WW-30600-02	ルアーロック付きマスターフレックスフィッティング
CCD カメラ	Andor Technology	EMCCD C9100-13no
回路基板フィルム	Fine Line Imaging、コロラド州、米国		デザインは 65,024 ドット/インチ (DPI)
で印刷されています対流式オーブン	メタラボ サイエンティフィック インダストリーズ、インド	MSI-5
カバースリップ	ブルースタット 顕微鏡カバー ガラス		22mm x 10Gms
エタノール	ハイメディア
ハリス ユニコア パンチャー 1mm	キアゲン	Z708801
ヘキサメチルジシラザン	シグマ-アルドリッチ、バンガロール、インド	440191
ホットプレート	IKA	RCT B S 22
イソプロパノール	フィッシャー サイエンティフィック	26895
KOH	フィッシャー サイエンティフィック
レーザー走査型顕微鏡	ZEISS	LSM 5 LIVE
マイクロピペット チップ	ターソン		0.5-10 & マイクロ;Lマイクロピペットチップは食品供給に使用されます
ネガフォトレジスト-1	マイクロケム	SU8-2025	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
ネガティブフォトレジスト-2	マイクロケム	SU8-2050	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
窒素ガス	ローカルサプライヤー	商用窒素ガス	シリンダー容量 7立方メートル
PDMS(硬化液)	Dow Corning Corporation, MI, USA	シルガード硬化液	硬化剤
ペトリプレート	プラビーン・サイエンティフィック・コーポレーション
プラズマクリーナー	ハリック・プラズマ、ニューヨーク、アメリカ	PDC-32G
カミソリとブレード	リスター外科用ブレード
シリコンエラストマー (ベース)	ダウコーニングコーポレーション、ミシガン州、米国	シルガード184ベース	エラストマーベース
シリコンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック		プラスチックチューブ、内径1.59 mm、外径3.18 mm
ウェーハ	ユニバーシティウェーハ、マサチューセッツ州、米国	[100]向き、4インチ直径	直径100mmのウェーハから小片(2mm× 2 mm)をカット
スピンコーター	SPS-Europe B.V., オランダ	SPIN 150
スピニングディスク顕微鏡	Perkin Elmer ultra-view VOXシステム	CSU-X1-A3 N	システムは4基(405/488/561/640 nm)のレーザーを搭載し、Volocityソフトウェアパッケージで制御しました。
SU8開発者	Microchem、マサチューセッツ州、米国	SU8開発者
トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン	Sigma-Aldrich、バンガロール、インド	448931	トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン蒸気は有毒
UVランプ	です Oriel Instruments、バンガロール、インド		200ワットとコリメートされたUV光源
Volocityソフトウェア	Perkin-Elmer		Image解析