Method Article

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

DOI:

10.3791/63136

⸱

April 11th, 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans(C. elegans) は、発生および細胞生物学的プロセスを研究するための貴重なモデルシステムであることが証明されています。これらの生物学的プロセスを理解するには、多くの場合、同じ動物の長期にわたる繰り返しのイメージングが必要です。寒天パッドで行われる従来の固定化方法に関連する長い回復時間は、動物の健康に悪影響を及ぼし、同じ動物を長期間にわたって繰り返し画像化することは不適切です。この論文では、マイクロ流体チップの設計、製造方法、オンチップ C.エレガンス 培養プロトコル、および個々の動物の発生過程を研究するための長期イメージングの3つの例について説明します。ポリジメチルシロキサンで作製し、カバーガラス上に接着したチップは、窒素ガスを用いて偏向されたエラストマー膜を用いてガラス基板上に動物を固定化する。 C.エレガンス の完全な固定化により、麻酔薬を使用しない方法で細胞および細胞内イベントの堅牢なタイムラプスイメージングが可能になります。大きな断面を有するチャネル形状は、動物が2つの部分的に密封された隔離膜内を自由に動くことを可能にし、連続的な食物供給を伴うチャネル内の成長を可能にする。このシンプルなチップを用いて、PVD感覚ニューロンにおける神経突起の成長、外陰部の発達、樹状突起の樹状突起などの発生現象を、動物がチャネル内で成長するにつれてイメージングすることができます。長期的な成長およびイメージングチップは、単一の圧力ラインで動作し、外部バルブ、安価な流体消耗品がなく、 C.エレガンスを使用する他のラボで簡単に適応できる標準的なワーム処理プロトコルを利用しています。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegansは、細胞生物学、老化、発生生物学、および神経生物学を研究するための強力なモデル生物であることが証明されています。その透明な体、短いライフサイクル、容易なメンテナンス、定義された数の細胞、いくつかのヒト遺伝子との相同性、およびよく研究された遺伝学などの利点により、C.エレガンスは基礎生物学の発見と応用研究の両方で人気のあるモデルになりました1,2。個々の動物の繰り返しの長期観察から細胞の生物学的および発生的プロセスを理解することは有益であることがわかります。従来、C.エレガンスは寒天パッド上で麻酔をかけ、顕微鏡下で画像化されていました。動物の健康に対する麻酔薬の悪影響は、同じ動物の長期および反復断続的なイメージングのための麻酔動物の使用を制限します3,4。近年のマイクロ流体技術の進歩と、健康被害が無視できるほどのC.エレガンスの無麻酔トラップへの適応により、同じ動物の短期間および長期間にわたる高解像度イメージングが可能になりました。

マイクロ流体チップは、C. elegans'5ハイスループットスクリーニング

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 成長・イメージングデバイスの作製

  1. SU8金型製作
    1. ワープロソフト(またはコンピュータ支援設計CADソフト)で矩形を使用してパターン1(フロー層)とパターン2(制御層)を設計し、ポリエステル系フィルムに最小フィーチャーサイズ8μmのレーザープロッターを使用してフォトマスクを印刷します(図1)。
    2. シリコンウェーハを2.5cm×2.5cmにカットし、20%KOHで1分間洗浄します。ウェーハを脱イオン(DI)水ですすいでください。フロー層と制御層にそれぞれ1枚のウェーハを使用します。
      注意: KOHは腐食性であるため、取り扱いには注意が必要です。
    3. 14psiの圧縮窒素ガスでピースを乾燥させた後、ホットプレートで120°Cで4時間脱水します。次のステップに進む前に、2つのピースを室温まで冷却します。
    4. シリコン片の1つを取り、スピンコーターのチャックに置き、真空をオンにしてウェーハを所定の位置に保持します。シリコン片に~20μLのヘキサメチルジシラン(HMDS)を入れ、スピンコーターで毎分500回転(rpm)で5秒間、続いて3,000rpmで30秒間コーティングします。
      注意: この手順は黄色のライトで実行する必要があります。室内で白色光を使用しないでください。
    5. ~40 μmの均一なフォトレジスト厚さを得るには(....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

デバイスの特性評価: 成長およびイメージングデバイスは、不可逆プラズマ結合を使用して結合された2つのPDMS層(図1)で構成されています。長さ10mm、高さ40μmまたは80μmの流動層(パターン1)により、液体培養で動物を成長させることができます(図1A)。捕捉層(パターン2)は、高解像度イメージングのために動物を固定化するための2mm幅の膜(図1B)を有する。捕捉層用のマスクはまた、連続する画像化時点間の流路のセクション内の動物の動きを制限するための一対の隔離膜を作成する。装置の捕集膜は、我々の以前の撮像装置3から適合されている。現在の装置(図1C、L)には、複数の時間ポイントにわたって同じ動物を効率的に固定化するために、分離膜を追加し、捕捉膜の幅を2mmに増やすことが含まれています.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文では、成長中の単一の動物の一定の食物供給と高解像度イメージングを備えた C.エレガンス を成長させるための単純なマイクロ流体デバイスの製造と使用のためのプロトコルが説明されています。この製造プロセスは簡単で、非滅菌環境で行うことができます。製造段階では、ほこりのない環境が重要です。ダスト粒子の存在は、2つの結合面間の不適切な接触につながり、 C.エレガンス が固定されている間、高圧印加中のデバイスの結合不良および漏れをもたらす。製造されたすべてのデバイスのうち、95%のデバイスが実験に適しています。製造中または使用中の不適切なボンディングが原因で、少数のデバイス(5%)が故障します。世界中のいくつかの学術機関で利用可能な無塵(>1,000グレードのクリーンルーム)内で製造プロセスを実行することで、接着の失敗を減らすことができます。流路からバクテリアフードをきれいにし、デバイスの再利用を可能にするには、実験のたびにアルコールを流してデバイスを洗い流します。

このプロトコルは、C. elegansのさまざまな発生段階やサイ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M.およびS.P.K.は、マイクロ流体成長およびイメージングデバイスに関する出願中の特許(特許出願番号640/CHE/2011)の著者である。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、CIFFイメージング施設、NCBSがDST-ナノテクノロジーセンター(No.SR / 55 / NM-36-2005)。DBT (SPK)、CSIR-UGC (JD)、DST (SM)、DBT (SM)、DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK and Gautam Menon) が支援するスピニングディスク、および HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK) からの研究資金に感謝する。HB101、 PS3239、および wdIs51 株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されている Caenorhabditis 遺伝学センター(CGC)によって提供されました。S.P.K.はマイク・ノネットの研究室で jsIs609 を製作しました。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 G 針Sigma-Aldrich、バンガロール、インドゲージ 18
3 ウェイ ストップコックCole-ParmerWW-30600-02ルアーロック付きマスターフレックスフィッティング
CCD カメラAndor TechnologyEMCCD C9100-13no
回路基板フィルムFine Line Imaging、コロラド州、米国デザインは 65,024 ドット/インチ (DPI)
で印刷されています対流式オーブンメタラボ サイエンティフィック インダストリーズ、インドMSI-5
カバースリップブルースタット 顕微鏡カバー ガラス22mm x 10Gms
エタノールハイメディア
ハリス ユニコア パンチャー 1mmキアゲンZ708801
ヘキサメチルジシラザンシグマ-アルドリッチ、バンガロール、インド440191
ホットプレート IKARCT B S 22
イソプロパノールフィッシャー サイエンティフィック26895
KOHフィッシャー サイエンティフィック
レーザー走査型顕微鏡ZEISSLSM 5 LIVE
マイクロピペット チップターソン0.5-10 & マイクロ;Lマイクロピペットチップは食品供給に使用されます
ネガフォトレジスト-1マイクロケムSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
ネガティブフォトレジスト-2マイクロケムSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
窒素ガスローカルサプライヤー商用窒素ガスシリンダー容量 7立方メートル
PDMS(硬化液)Dow Corning Corporation, MI, USA シルガード硬化液硬化剤
ペトリプレートプラビーン・サイエンティフィック・コーポレーション
プラズマクリーナーハリック・プラズマ、ニューヨーク、アメリカ PDC-32G
カミソリとブレードリスター外科用ブレード
シリコンエラストマー (ベース)ダウコーニングコーポレーション、ミシガン州、米国シルガード184ベースエラストマーベース
シリコンチューブフィッシャーサイエンティフィックプラスチックチューブ、内径1.59 mm、外径3.18 mm
ウェーハユニバーシティウェーハ、マサチューセッツ州、米国[100]向き、4インチ直径直径100mmのウェーハから小片(2mm× 2 mm)をカット
スピンコーターSPS-Europe B.V., オランダSPIN 150
スピニングディスク顕微鏡Perkin Elmer ultra-view VOXシステムCSU-X1-A3 Nシステムは4基(405/488/561/640 nm)のレーザーを搭載し、Volocityソフトウェアパッケージで制御しました。
SU8開発者Microchem、マサチューセッツ州、米国SU8開発者
トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランSigma-Aldrich、バンガロール、インド448931トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン蒸気は有毒
UVランプです Oriel Instruments、バンガロール、インド200ワットとコリメートされたUV光源
VolocityソフトウェアPerkin-ElmerImage解析
シリコンな

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nema....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansLong Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

Related Articles