このプロトコルは、NuTRAPマウスモデルを使用して細胞型特異的翻訳リボソームmRNAを単離することを目的としています。
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この記事について
サマリー
要約
細胞の不均一性は、トランスクリプトームレベルで複雑な組織の機能を理解する上で課題をもたらします。細胞種特異的RNAを使用することで、組織の不均一性によって引き起こされる潜在的な落とし穴を回避し、強力なトランスクリプトーム解析を解き放ちます。ここで説明するプロトコルは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法を使用して、細胞を選別することなく、複雑な組織内の少量のEGFP発現細胞からリボソーム結合RNAを単離する方法を示しています。このプロトコルは、最近入手可能な NuTRAP マウスモデルを使用して細胞タイプ特異的RNAを単離するのに適しており、EGFP発現細胞からRNAを単離するためにも使用できます。
概要
RNAシーケンシング(RNA-seq)やマイクロアレイなどのハイスループットアプローチにより、ゲノムワイドレベルで遺伝子発現プロファイルを調べることが可能になりました。心臓、脳、精巣などの複雑な組織の場合、細胞タイプ固有のデータは、組織全体からのRNAの使用を比較する詳細を提供します1、2、3。細胞の不均一性の影響を克服するために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法が2010年代初頭から開発されてきました4。TRAPは、組織を解離することなく、特定の細胞タイプからリボソーム結合RNAを単離することができます。この方法は、ショウジョウバエ胚5の非常にまれな筋細胞集団の標的化、モデル植物シロイヌナズナ6のさまざまな根細胞の研究、哺乳類7の内皮細胞のトランスクリプトーム解析など、さまざまな生物のトランスラトーム(翻訳のためにリボソームにリクルートされるmRNA)分析に使用されています。
TRAPは、モデル生物のリボソームにタグを付けるための遺伝子改変を必要とする。今回、Evan ....
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プロトコル
実施されたすべての動物実験は、オーバーン大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従いました。
注:次のプロトコルは、 Gli1-CreERT2のP28で1つの精巣(約100 mg)を使用します。NuTRAP マウス(ムスムスクルス)。試薬の量は、サンプルの種類と組織の数に基づいて調整する必要がある場合があります。
1.組織収集
- CO2チャンバーを用いてマウスを安楽死させ、腹部表面を70%エタノールで消毒する。
- ハサミで下腹部を開き、精巣を取り除きます。液体窒素(LN2)を使用して、精巣をすぐに急速凍結します。
- サンプルは、使用するまでLN2 の気相に保管してください。
2.試薬とビーズの準備
- ホモジナイズストック溶液を調製する:50 mM トリス(pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、1% NP-40、および1 mg/mLヘパリンを加えます。使用まで溶液を4°Cで保存してください(最大1ヶ月)。 ....
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結果
Gli1-CreERT2マウス(ジャクソンラボストック番号:007913)を最初にNuTRAPレポーターマウス(ジャクソンラボストック番号:029899)と交配して、二重変異マウスを生成しました。遺伝子操作された両方の遺伝子対立遺伝子(すなわち、Gli1-CreERT2およびNuTRAP)を有するマウスに、タモキシフェンを1日1回、1日おきに3回注射した。組織サンプルは、注射の1日目の後の7日目に収集された。免疫蛍光分析により、EGFPが精巣の間質細胞で発現していることが示されました(図1)。この副腎被膜は、Gli112,13の別の細胞集団陽性であることが知られている。EGFPは、Gli1-CreERT2の副腎莢膜細胞にも見られました。NuTRAPマウス(
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ディスカッション
全組織トランスクリプトーム解析の有用性は、特に複雑な不均一組織を研究する場合、損なわれる可能性があります。細胞種特異的RNAをいかに入手するかは、強力なRNA-seq技術を解き放つための緊急の必要性となっています。細胞種特異的RNAの単離は、通常、マイクロマニピュレーション、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を用いた特定の種類の細胞の収集に依存しています18。他の最新のハイスループット単一細胞収集方法および機器も開発されている19。これらの方法は通常、マイクロフルイディクス技術を使用して、単一細胞に続いて単一細胞RNA-seqをバーコード化します。細胞解離は、懸濁した細胞溶液を得るために必要なステップであり、その後、細胞選別機またはマイクロ流体デバイスのいずれかを通過して各細胞にバーコードを付けます。細胞解離ステップは、酵素処理が組織を破壊するだけでなく、細胞の生存率と転写プロファイルにも影響を与えるため、細胞タイプ特異的研究のためのこれらの方法に課題をもたらします
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
この作業は、NIH R00HD082686によって部分的にサポートされていました。内分泌学会サマーリサーチフェローシップのH.S.Zに感謝します。また、マウスのコロニーの繁殖と維持について、Yuan Kang博士にも感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Actb | eurofins | qPCRプライマー | ATGGAGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (フォワードプライマー/リバースプライマー) |
| バイオアナライザー | Agilent | 2100 バイオアナライザー Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR プライマー | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (フォワードプライマー/リバースプライマー) |
| dNTP | サーモフィッシャーサイエンティフィック | R0191 | |
| DTT、ジチオスレイトール | サーモフィッシャーサイエンティフィック | P2325 | |
| DynaMag-2 マグネット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12321D | |
| ファルコンチューブ 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP 抗体 | Abcam | ab290 | |
| ガラスグラインダー セット | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| em>Hsd3b | eurofins | qPCR プライマー | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (フォワードプライマー/リバースプライマー) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| 微量遠心チューブ 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA 単離キット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | KIT0204 | |
| プロテイン G ダイナビーズ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR プライマー | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (フォワードプライマー/リバースプライマー |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR プライマー | GAATGTGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (フォワードプライマー/リバースプライマー) |
| トリス | アルファ Aesar | J62848 |
参考文献
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al.
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再版と許可
