方法論記事

細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語)

DOI：

10.3791/63143

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2021年12月8日

 , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、NuTRAPマウスモデルを使用して細胞型特異的翻訳リボソームmRNAを単離することを目的としています。

要約

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細胞の不均一性は、トランスクリプトームレベルで複雑な組織の機能を理解する上で課題をもたらします。細胞種特異的RNAを使用することで、組織の不均一性によって引き起こされる潜在的な落とし穴を回避し、強力なトランスクリプトーム解析を解き放ちます。ここで説明するプロトコルは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法を使用して、細胞を選別することなく、複雑な組織内の少量のEGFP発現細胞からリボソーム結合RNAを単離する方法を示しています。このプロトコルは、最近入手可能な NuTRAP マウスモデルを使用して細胞タイプ特異的RNAを単離するのに適しており、EGFP発現細胞からRNAを単離するためにも使用できます。

概要

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RNAシーケンシング(RNA-seq)やマイクロアレイなどのハイスループットアプローチにより、ゲノムワイドレベルで遺伝子発現プロファイルを調べることが可能になりました。心臓、脳、精巣などの複雑な組織の場合、細胞タイプ固有のデータは、組織全体からのRNAの使用を比較する詳細を提供します1、2、3。細胞の不均一性の影響を克服するために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法が2010年代初頭から開発されてきました4。TRAPは、組織を解離することなく、特定の細胞タイプからリボソーム結合RNAを単離することができます。この方法は、ショウジョウバエ胚5の非常にまれな筋細胞集団の標的化、モデル植物シロイヌナズナ6のさまざまな根細胞の研究、哺乳類7の内皮細胞のトランスクリプトーム解析など、さまざまな生物のトランスラトーム(翻訳のためにリボソームにリクルートされるmRNA)分析に使用されています。

TRAPは、モデル生物のリボソームにタグを付けるための遺伝子改変を必要とする。今回、Evan Rosenたちの研究グループは最近、核タグ付けと翻訳リボソーム親和性精製(NuTRAP)マウス8と呼ばれるマウスモデルを開発したが、これは2017年からジャクソン研究所で入手できる。Creマウス株と交配することにより、研究者はこの NuTRAP マウスモデルを使用して、細胞を選別することなく、Cre発現細胞からリボソーム結合RNAおよび細胞核を単離することができます。 NuTRAP 対立遺伝子も持つCre発現細胞では、EGFP/L10aタグ付きリボソームにより、アフィニティープルダウンアッセイを使用して翻訳mRNAを単離できます。同じ細胞では、ビオチンリガーゼ認識ペプチド(BLRP)タグ付き核膜(これもmCherry陽性)であり、アフィニティーまたは蛍光ベースの精製を使用して核分離を可能にします。同じ研究チームはまた、核膜がビオチン8なしでmCherryのみで標識される同様のマウス系統を生成しました。これらの2つの遺伝子改変マウス株は、関心のある特定のタイプの細胞のペアのエピゲノムおよびトランスクリプトミクスプロファイルを特徴付けるためのアクセスを提供します。

ハリネズミ(Hh)シグナル伝達経路は、組織発生において重要な役割を果たします9。GLIファミリーのメンバーであるGLI1は、転写活性化因子として作用し、Hhシグナル伝達を媒介します。Gli1+細胞は、副腎や精巣を含む多くのホルモン分泌器官に見られます。NuTRAPマウスモデルを用いてGli1+細胞から細胞型特異的DNAおよびRNAを単離するために、Gli1-CreERT2マウスをNuTRAPマウスと交配した。Shh−CreERT2マウスはまた、音波ハリネズミ(Shh)発現細胞を単離することを目的としたNuTRAPマウスと交配した。次のプロトコルは、Gli1-CreERT2を使用する方法を示しています。NuTRAPマウスは、成体マウス精巣中のGli1+細胞からリボソーム結合RNAを単離します。

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プロトコル

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実施されたすべての動物実験は、オーバーン大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従いました。

注:次のプロトコルは、 Gli1-CreERT2のP28で1つの精巣(約100 mg)を使用します。NuTRAP マウス(ムスムスクルス)。試薬の量は、サンプルの種類と組織の数に基づいて調整する必要がある場合があります。

1.組織収集

  1. CO2チャンバーを用いてマウスを安楽死させ、腹部表面を70%エタノールで消毒する。
  2. ハサミで下腹部を開き、精巣を取り除きます。液体窒素(LN2)を使用して、精巣をすぐに急速凍結します。
  3. サンプルは、使用するまでLN2 の気相に保管してください。

2.試薬とビーズの準備

  1. ホモジナイズストック溶液を調製する:50 mM トリス(pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、1% NP-40、および1 mg/mLヘパリンを加えます。使用まで溶液を4°Cで保存してください(最大1ヶ月)。
  2. 使用前に新たにストック溶液からホモジナイズ作業バッファーを調製します(ステップ2.1):DTT(最終濃度:1 mM)、シクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)、組換えリボヌクレアーゼ(最終濃度:200ユニット/mL)、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(最終濃度:1x)をホモジナイズストック溶液に加えて、必要量のホモジナイズ作業バッファーを作ります。作りたての作業バッファーは、使用するまで氷上に保管してください。
  3. 低塩および高塩洗浄バッファーを準備します。
    1. 50 mM トリス(pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、および1% NP-40の低塩洗浄バッファーミックスを調製した。使用前にDTT(最終濃度:1 mM)とシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)を加えてください。
    2. 高塩洗浄バッファーミックス50mMトリス(pH 7.4)、12mMMgCl2、300mM KCl、1%NP-40を調製した。使用前にDTT(最終濃度:2 mM)とシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)を加えてください。
  4. プロテインGビーズを準備する(材料の表):
    1. 各サンプルには50 μLのプロテインGビーズが必要です。必要量のビーズを1.5 mLの遠沈管に入れ、磁気ラックを使用してチューブをラックに30〜60秒間置いて、ビーズを溶液から分離します。
    2. ピペッティングにより上清を除去する。毎回1 mLの氷冷減塩洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。

3.組織の溶解と均質化

  1. 2 mLの氷冷ホモジナイズ作業バッファー(ステップ2.2で新たに調製)をガラスティッシュグラインダーセットに加えます。凍結したサンプルをグラインダーにすばやく入れ、緩い乳棒を使用して氷上で30ストロークで組織を均質化します。
  2. ホモジネートを2 mLの丸底チューブに移し、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  3. 上清を新しい2 mLチューブに移します。100 μLを「入力」として1.5 mLチューブに保存します。
  4. 2 mLチューブ内の上清を抗GFP抗体(5 μg/mL; 1:400)とともに、エンドオーバーエンドローテーター(24 rpm)上で4°Cで一晩インキュベートします。

4. 免疫沈降

  1. ホモジネート/抗体混合物を、ステップ2.4で洗浄したプロテインGビーズを含む新しい2 mLの丸底チューブに移します。エンドオーバーエンドローテーター(24 rpm)で4°Cで2時間インキュベートします。
  2. マグネットラックを使用して磁気ビーズを上澄みから分離します。上清を「陰性画分」として保存します。陰性画分は、(1)EGFP陰性細胞におけるRNAおよび(2)リボソームに結合していないEGFP陽性細胞におけるRNAを含有する。
  3. 1 mLの高塩分洗浄バッファーをビーズに加え、チューブを短時間ボルテックスしてビーズを洗浄します。チューブをマグネットラックに入れます。
  4. 洗浄バッファーを取り外します。洗浄手順をさらに2回繰り返します。ビーズには、EGFP陽性細胞由来のビーズ-リボソーム-RNA複合体が含まれるようになりました。

5. RNA抽出

注:次の手順は、RNA分離キット(材料表)から採用されています。各フラクション(インプット、ポジティブ、ネガティブ)を独立したサンプルとして扱い、RNAを個別に分離します。

  1. ステップ 4.4 のビーズを 50 μL の抽出バッファー (RNA 分離キットから) とともにサーモミキサー (42 °C、500 rpm) で 30 分間インキュベートし、ビーズから RNA を放出します。
  2. マグネットラックでビーズを分離し、ビーズ-リボソーム-RNA複合体を含む上清を1.5 mLチューブに移します。
  3. チューブを3000 x g で2分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブにピペットで移します。このチューブには、TRAPステップの「正の割合」が含まれています。
    注:インプットフラクションとネガティブフラクションについては、1 mLの抽出バッファーを使用して25 μLのサンプルからRNAを抽出します。サーモミキサー(42°C、500 rpm)で30分間インキュベートします。
  4. RNA精製カラムの事前コンディショニング:250 μLのコンディショニングバッファーを精製カラムにピペットで移します。室温(RT)で5分間インキュベートします。カラムを16,000 x g で1分間遠心分離します。
  5. ステップ5.3から上清に等量の70%EtOHをピペットする(陽性画分については約50μLの70%EtOH、投入画分および陰性画分については70%EtOHの1mL)。上下にピペッティングしてよく混ぜます。
  6. ステップ5.4の混合物をカラムにピペットで入れます。
  7. カラムを100 x gで2分間遠心分離して、カラム内のメンブレンにRNAが結合できるようにしてから、すぐに16,000 x gで30秒間遠心分離を続けます。フロースルーを破棄します。
    注:インプットフラクションとネガティブフラクションについては、毎回250μLの混合物をカラムに追加します。すべての混合物が使用されるまで、手順5.6と5.7を繰り返します。
  8. 洗浄バッファー1(W1)100 μLをカラムにピペットで入れ、8,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
  9. ピペット75 μLのDNase溶液を精製カラムメンブレンに直接混合します。RTで15分間インキュベートします。
  10. 40 μLのW1をカラムにピペットで入れ、8,000 x g で30秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
  11. 洗浄バッファー2(W2)100 μLをカラムにピペットで入れ、8,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
  12. 100 μLのW2をカラムにピペットで入れ、16,000 x g で2分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。同じカラムを16,000 x g で1分間再遠心分離し、溶出ステップの前に洗浄バッファーの痕跡をすべて除去します。
  13. カラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
  14. 12 μLのRNaseフリー水を精製カラムのメンブレンに直接ピペットで貼り付けます。ピペットの先端が膜に触れないようにしてください。RTで1分間インキュベートし、1000 x g で1分間遠心分離します。その後、16,000 x g で1分間遠心分離を続け、RNAを溶出します。

6. RNAの濃度と品質

  1. バイオアナライザーを使用して、抽出されたRNA10の質と量を評価します。

7.保管とさらなる分析

  1. さらなる分析(マイクロアレイ、定量的PCR(qPCR)、RNA-seqなど)まで、RNAを-80°C(最大1年間)で保存します。
    注:cDNA合成を含むqPCR分析の詳細については、Lyuら11を参照してください。qPCR用のプライマーは材料 表に記載されています。

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結果

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Gli1-CreERT2マウス(ジャクソンラボストック番号:007913)を最初にNuTRAPレポーターマウス(ジャクソンラボストック番号:029899)と交配して、二重変異マウスを生成しました。遺伝子操作された両方の遺伝子対立遺伝子(すなわち、Gli1-CreERT2およびNuTRAP)を有するマウスに、タモキシフェンを1日1回、1日おきに3回注射した。組織サンプルは、注射の1日目の後の7日目に収集された。免疫蛍光分析により、EGFPが精巣の間質細胞で発現していることが示されました(図1)。この副腎被膜は、Gli112,13の別の細胞集団陽性であることが知られている。EGFPは、Gli1-CreERT2の副腎莢膜細胞にも見られました。NuTRAPマウス(

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ディスカッション

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全組織トランスクリプトーム解析の有用性は、特に複雑な不均一組織を研究する場合、損なわれる可能性があります。細胞種特異的RNAをいかに入手するかは、強力なRNA-seq技術を解き放つための緊急の必要性となっています。細胞種特異的RNAの単離は、通常、マイクロマニピュレーション、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を用いた特定の種類の細胞の収集に依存しています18。他の最新のハイスループット単一細胞収集方法および機器も開発されている19。これらの方法は通常、マイクロフルイディクス技術を使用して、単一細胞に続いて単一細胞RNA-seqをバーコード化します。細胞解離は、懸濁した細胞溶液を得るために必要なステップであり、その後、細胞選別機またはマイクロ流体デバイスのいずれかを通過して各細胞にバーコードを付けます。細胞解離ステップは、酵素処理が組織を破壊するだけでなく、細胞の生存率と転写プロファイルにも影響を与えるため、細胞タイプ特異的研究のためのこれらの方法に課題をもたらします

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開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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この作業は、NIH R00HD082686によって部分的にサポートされていました。内分泌学会サマーリサーチフェローシップのH.S.Zに感謝します。また、マウスのコロニーの繁殖と維持について、Yuan Kang博士にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ActbeurofinsqPCRプライマーATGGAGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (フォワードプライマー/リバースプライマー)
バイオアナライザーAgilent2100 バイオアナライザー Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMillipore11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR プライマーCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (フォワードプライマー/リバースプライマー)
dNTPサーモフィッシャーサイエンティフィックR0191
DTT、ジチオスレイトールサーモフィッシャーサイエンティフィックP2325
DynaMag-2 マグネットサーモフィッシャーサイエンティフィック12321D
ファルコンチューブ 15 mLVWR89039-666
GFP 抗体Abcamab290
ガラスグラインダー セットDWK Life Sciences357542
heparinBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
em>Hsd3beurofinsqPCR プライマーGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (フォワードプライマー/リバースプライマー)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
微量遠心チューブ 2 mLThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA 単離キットサーモフィッシャーサイエンティフィックKIT0204
プロテイン G ダイナビーズサーモフィッシャーサイエンティフィック10003D
RNase-free watergrowcellsNUPW-0500
RNaseOUT 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤サーモフィッシャーサイエンティフィック10777019
Sox9eurofinsqPCR プライマーTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (フォワードプライマー/リバースプライマー
Superscript IV reverse transcriptaseInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master Mixサーモフィッシャーサイエンティフィック4309155
Sycp3eurofinsqPCR プライマーGAATGTGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (フォワードプライマー/リバースプライマー)
トリスアルファ AesarJ62848
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参考文献

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タグ

RNA RNA EGFP NuTRAP RNA RT PCR

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