エクスビボ マウスの門脈を通る肝臓灌流

サマリー

このプロトコルは、門脈灌流による代謝研究のために無傷のマウス肝臓を切除する簡単な方法を記載している。

要約

糖尿病、前糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)などの代謝性疾患は、ますます一般的になりつつある。エクスビボ肝臓灌流は、厳密に制御できる栄養条件下で、核磁気共鳴(NMR)を使用して肝臓代謝の包括的な分析を可能にします。インシリコシミュレーションは、ホルモン作用および薬物介入の効果を評価するための主に理論的手段であり続けているように、灌流肝臓は、肝代謝を理解するための最も貴重な試験床の1つであり続けている。これらの研究は肝生理学への基本的な洞察を導くので、結果は正確で再現性がなければなりません。生体外肝灌流の再現性における最大の要因は、手術の質である。そこで、我々は、in situNMR実験の文脈でエクスビボマウス肝臓灌流を行うための組織的かつ合理化された方法を導入した。また、ユニークなアプリケーションについて説明し、これらの研究で遭遇する一般的な問題についても説明します。全体的な目的は、in situNMR実験の文脈で肝切除および灌流において再現性のある結果を得るためのゴールデンスタンダードと見なす、数年間にわたって洗練されてきた技術への単純なガイドを提供することです。磁石の磁場の中心までの距離と、NMR実験中の介入に対する組織のアクセス不能は、私たちの方法を新規なものにします。

概要

生体外灌流は肝代謝の研究において極めて重要であり、門脈を介した灌流はこれらの研究の標準である。単独で肝代謝を研究するためには、肝臓を体内から切除して、他の器官における代謝から生じる合併症(すなわち、全身代謝)を回避し、ホルモンの利用可能性(インスリン、グルカゴンなど)を制御する必要があります。このアプローチは、糖尿病、NAFLD、NASHなどの疾患が肝代謝に及ぼす影響や薬物作用のメカニズムを理解するために不可欠です。この記事は、肝切除と灌流のガイドとして機能します。我々は、これらの代謝肝研究を十分な厳密さと再現性で実施するための合理化された手順を開発しました。手術が正しく行われない場合、得られる代謝データに顕著な変動性がある。我々は、文献¹、²、³、⁴、⁵に記載されているように^、核磁気共鳴(NMR)分光計におけるその場での代謝研究の文脈で門脈カテーテル法および肝臓切除を行うための組織化された方法を説明する。

現在、NMR内のガラスカラムを用いた ex vivo 肝灌流を記載した文献はない。また、マウス....

プロトコル

マウスを含む実験は、フロリダ大学施設動物ケアおよび使用委員会(プロトコル番号#201909320)に準拠して処理した。使用したマウス株はC57BL/6Jであった。全てのマウスは雄であった。この方法は、一般に、他の標準的なマウス系統を用いた研究にも適用可能である。この手術は、一緒に働く2人の個人によって最適に行われます。

1. 初期設定

1. クレブス・ヘンゼライト電解質⁶(25 mM NaHCO₃、112 mM NaCl、4.7 mM KCl、MgSO4、KH 2 PO4、および0.5 mM ナトリウム-EDTA、1.25 mM CaCl₂)、6 mM乳酸ナトリウム、0.6 mM ピルビン酸ナトリウム、0.2 mM [U-13 C]プロピオン酸ナトリウム、¹⁰% (v/v)_D2O、 0.63mM混合脂肪酸(パルミチン酸(全体の22.1%)、パルミトレイン酸(5.2%)、ステアリン酸(2.7%)、オレイン酸(27%)、リノール酸(37.7%)、γ-リノレン酸(2.4%)、デコサヘキサン酸(2.8%)、および2%(w / v)ウシ血清アルブミンを含む。HCl(および必要に応じてNaOH)を使用して、....

結果

肝機能は、主に酸素消費量と流量によって評価されます。4 ~ 8 mL/分の流量と 1 μmol/min.g の酸素消費量が典型的です。これらの尺度は、特定の実験条件および生物学的差異によって異なるであろう。

使用されるイソフルランの正確な量は、使用されている麻酔システムの種類、ならびにマウスの環境および年齢/体重に依存する。手術中、イソフルランおよび送達ガスは変化しないが、手術領域の詳細(例えば、バックグラウンドノイズ)に応じていくつかの変化が必要な場合がある¹⁰。ヘパリンを皮下深く注射すると、作用の開始は最大20〜40分遅れる可能性がある。ヘパリン投与後の10分間の待機期間は、行動^{の開始を保証する16}。リドカインは、作用¹¹の2分間の発症を有する。

カテーテルを挿入するときは、ベベルを上向きに保ち、門脈から15°以下の角度で入ります。両方の縫合糸には2つの結び目があります。最初の縫合.......

ディスカッション

この外科的処置は困難であり、再現性のある結果を達成するために広範な練習を必要とする。イソフルランおよびキャリアガスは、できるだけ多くの外科的処置を通して動物の生存率を維持するために、必要に応じて調整されるべきである。環境、時刻、年齢、体重、およびその他のいくつかの要因が麻酔に影響を与えます。体重、食事、マウスの系統、年齢は、脂肪の蓄積が門脈の視覚化を妨げる可能性があるため、手術に影響を与える可能性があります。足をテープで留めるときは、窒息の原因となる可能性のある首に負担をかけないように注意する必要があります。さらに、マウスが太れば太るほど縫合糸は、脂質によって誘発されるカテーテルと静脈との間の摩擦係数の低下を打ち消すために、カテーテルの周りにある必要がある。ヘパリンの作用時間の発症は、イソフルランへの過剰な曝露が器官¹⁷に人工物を生じるので必須である。ヘパリンおよびリドカイン注射の投与は、長さ19.05mmの23G針を必要とし、注射中に内臓に外傷がないことを確実にする。縫合ループは、カテーテルのテーパーの上になければならない、またはそれは締め付けたときに静脈を閉塞します。カテーテルが挿入さ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL ルアーロック 使い捨て滅菌ディスポーザブルシリンジ	N/A	N/	A 非特定ブランド
100 cm ウォータージャケット付きガラスカラム	N/A	N/	A カスタムメイド
2-0 シルク縫合糸	Braintree Scientific	N/A
22 ゲージ キャサーター 1 インチ。安全テル	モ	SRFF2225
23 G 0.75インチ無しハイポデマー針	エクセルインターナショナル	26407
27 G 1.5 in.ハイポデマー針	エクセルインターナショナル	26426
4x4インチ外科用プラットフォーム	N/A	N/	A カスタムメイド
70% アルコールワイプ	N/A	N/A	非特定ブランド
循環水浴	MS ラウダ	N/A	モデルはもう製造されていません
コットンチップアプリケーター	N/A	N/A	非特定ブランド
繊細な操作はさみ;直;シャープシャープ;刃の長さ30mm。4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
イソフルラン	パターソン獣医	14043-0704-06
リドカインHCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
膜薄層酸素供給器	Radnoti	N/A
Metzenbaum はさみ;闉;鈍;ブレードの長さ27mm;5 "	Roboz	RS-6013
酸素計システム	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
生理食塩水 0.9% 溶液	N/A	N/	A 生理食塩水はラボで作られています
スケール	N/A	N/	A 非特異的ブランド
 可変的な速度アナログ コンソール ポンプ システム	コール パーマー	N/A	モデルは適用ごとの注文である
ボートを量る	N/A	N/A	非特定のブランド