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方法論記事

酵素結合免疫吸着アッセイを用いたハマダラカ蚊におけるマラリア原虫スポロゾイトの検出

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DOI:

10.3791/63158

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2021年9月30日

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1Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 2Department of Molecular Tropical Medicine & Genetics, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 3Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 4Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、蚊の唾液腺スポロゾイトを検出するためのサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイについて説明しています。この方法は、容易に入手できるモノクローナル抗体を使用して、 熱帯熱マラリア原虫 または 三日熱マラリア原虫を保有する蚊の費用対効果の高いハイスループット検出を可能にします。この方法は、ベクターサーベイを含むマラリア伝播研究に適しています。

要約

マラリア原虫 は、ヒトに感染するマラリア原虫の感染段階です。 ハマダラカ の雌の唾液腺に存在するスポロゾイトは、給血中に蚊に刺されることでヒトに感染します。したがって、蚊の唾液腺にスポロゾイトが存在することは、蚊の感染性を定義します。 ハマダラカ がスポロゾイト 原虫 を媒介しているかどうかを判断するために、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法は、スポロゾイトの主要な表面タンパク質である マラリア原虫 サーカムスポロゾイトタンパク質(CSP)を検出するための標準的なツールでした。この方法では、各蚊の胸部と共に頭部を腹部から分離し、均質化し、サンドイッチELISAにかけることで 、熱帯熱マラリア原虫 に特異的なCSPの存在と、 熱帯熱マラリア原虫の2つのサブタイプ、VK210およびVK247のそれぞれを検出します。この方法は、蚊の感染の季節的動態や研究サイトの主要なマラリア媒介生物の種など、マラリアの伝播を研究するために使用されてきました。

概要

マラリア原虫は、蚊のマラリア原虫の感染段階です。スポロゾイトは、蚊に刺されることで人間に運ばれます。蚊では、スポロゾイトは最初に中腸壁のオーシストの内側に形成されます。準備ができたら、それらはヘモコエルに放出され、蚊の唾液腺に移動します。そこで、彼らは成熟し、血液供給中に人間に感染する準備が整います。人間では、スポロゾイトは真皮に沈着します。次に、それらは血管に入り、血液循環に沿って移動して肝臓に到達し、肝細胞1,2の感染を確立します。

蚊の唾液腺のスポロゾイト感染を決定するために、3つの異なる方法が使用されています。最初の方法は、唾液腺の解剖とそれに続く光学顕微鏡下でのスポロゾイトの直接検査です。この方法は、ハマダラカの唾液腺3のスポロゾイトを検出および定量するためのゴールドスタンダードです。ただし、解剖と顕微鏡検査の両方で十分な訓練を受けた技術者が必要です。さらに、マラリア原虫の種やCSPサブタイピング(三日熱マラリア原虫用)の決定には使用できません4,5。第2の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、蚊の体の上部にあるマラリア原虫DNAを検出する方法である6。PCRの特異性を考慮すると、寄生虫の種とサブタイプの両方が可能である7,8,9,10。PCRはますます使用されるようになっていますが、比較的高価な機器と十分な訓練を受けたスタッフが必要です。最後の方法である、マラリア原虫特異的circumsporozoiteタンパク質(CSP)を検出するELISAは、30年間主力であった11,12,13。CSPは、オーシストスポロゾイトと唾液腺スポロゾイトの両方に存在します12,14。特異的抗体を用いたこの方法により、マラリア原虫種の同定と三日熱マラリア原虫のスポロゾイトのCSPサブタイピングが可能になります。このアッセイの理論的根拠は、マラリアの伝播を理解する(すなわち、スポロゾイト感染率を決定する)ために、多数の野生の蚊を調べるための単純なハイスループットアッセイが必要であることです。

ELISA法には、顕微鏡検査に比べて2つの重要な利点があります。まず、研究者はサンプル処理の準備が整うまで蚊のサンプルを保持できます。次に、ELISA法は、種特異的なモノクローナル抗体を通じてマラリア原虫種を鑑別するために使用できます。さらに、ELISAはより多くの蚊の検体を収容できるため、はるかに高いスループットが可能になります15。スポロゾイトDNAを検出するPCRと比較して、ELISAの手続きは時間がかかりますが、費用はかかりません16。ここで説明するELISAアッセイは、蚊の感染性を決定し、熱帯熱マラリア原虫のCSPと三日熱マラリア原虫の2つのCSP変異体であるVK210およびVK247のそれぞれを別々に検出するために開発されました。このELISA法は、蚊感染の季節的動態を決定し、野外の主要なマラリア媒介生物の種を特定するために多くの研究で使用されてきました12,13,17,18。このアッセイを行うには、ELISAプレートリーダーを備えた標準的なラボで十分です。

全体的なアプローチを 図 1 にまとめます。このサンドイッチELISAでは、まず 各マラリア原虫 種/サブタイプに特異的な一次(捕捉)モノクローナル抗体(mAb)を使用してELISAプレートをコーティングします。各プレートは、単一の捕捉mAbでコーティングされています。mAbの機能は、蚊のホモジネートに対応するCSP抗原を捕捉することです。抗原捕捉およびプレート洗浄後、ペルオキシダーゼで標識された2つ目のCSP特異的抗体を使用して、捕捉mAbに結合したCSPの存在を検出します。ペルオキシダーゼによって触媒される化学反応は、CSP陽性のウェルで発色をもたらします。

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プロトコル

1. 試薬の調製

注:このプロトコルで使用される機器、試薬、およびその他の消耗品のリストについては、 材料の表 を、溶液とその組成のリストについては 、表1 を参照してください。

  1. 捕捉型およびペルオキシダーゼ標識型mAb
    1. モノクローナル抗体を再構成するには、凍結乾燥したモノクローナル抗体を蒸留水:グリセロールの1:1混合物に0.5 mg/mLで再懸濁します。凍結融解を繰り返さないように必要に応じてアリコートを作成し、-20°Cで保存します。
  2. ブロッキングバッファ(BB)
    1. 5 gのELISAグレードカゼインを100 mLの0.1 N NaOHに溶解して、ブロッキングバッファーを調製します。900 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)( 表1を参照)を加えて、最終容量を1.0 Lにします。
    2. 0.02 gのフェノールレッドを指示薬として加え、HClでpHを7.4に調整し、BBを4°Cで最大1週間保存するか、50 mLに分注して-20°Cで長期保存します。
  3. ポジティブコントロール
    1. ポジティブコントロールを再構成するには、1,000 μLのBBを添加して凍結乾燥タンパク質を再水和します。必要に応じてストックポジティブコントロール溶液のアリコートを作成し、-20°Cで保存します。
    2. 段階希釈の場合、次のように各ポジティブコントロールをさらにBBの最終使用濃度まで希釈します:Pf、2 pg/μL;Pv(VK210)、182(pg /μL);Pv(VK247)、89 pg/μL。
      注:ポジティブコントロールの正確な濃度は、ロットごとに異なる場合があります。必要な正確な濃度については、製品情報シートを参照してください。上記の使用濃度から開始するポジティブコントロール濃度は、Pfで2、1、0.5、0.25、0.13、0.06 pg /μLです。PV210 の場合は 182、91、46、23、11、5.7 pg/μL;および89、45、22、11、5.6、2.8 pg/μL PV247。
  4. ネガティブコントロール
    注:理想的なネガティブコントロールは、試験サンプルと同じように調製された雌のハマダラカの頭部胸部ホモジネートです。ただし、BBはネガティブコントロールとしても使用できます。
    1. BBをネガティブコントロールとすると、2倍吸光度閾値を使用して信頼性の高いポジティブリードアウトを実現します。

2.蚊のサンプル調製

  1. 収集した各成虫の蚊の頭と胸部を腹部から滅菌カミソリの刃で分離します。頭部と胸部を標識済みの1.5 mL遠心分離機用粉砕チューブに入れます。必要に応じて最大10匹の蚊のプールヘッドと胸部。
    注:サンプル調製のために、通常、感染した蚊の唾液腺を解剖し、CS-ELISAにかけます。しかし、採取した蚊の頭部および胸部は、(唾液腺の解剖をせずに)直接CS-ELISAを行うためにも使用できます12,13,19。
  2. 各チューブに50 μLのGrinding Buffer (GB)を加え、清潔な乳棒(石鹸で洗浄)でサンプルを均質化します。使用済みの乳棒を250μLのGBで、均質化された蚊の入ったチューブにすすぎ、最終容量が~300μLになるまで洗い流します。
  3. サンプルは使用するまで冷凍庫(-20°C)に保管するか、すぐにELISAを実行してください。

3.スポロゾイトELISA

  1. sporozoite ELISAワークシートに記入します( 補足資料1を参照)。CSP(Pf、Pv-210、またはPv-247)ごとに1枚のELISAプレートを準備します。
  2. 抗体をPBS:4 μg/mL Pfに溶解して、捕捉mAb用溶液を調製します。2 μg/mL Pv-210;2 μg/mL の Pv-247。プレートあたり 5 mL の添加に基づいて必要な容量を計算します。溶液を優しく渦巻きます。
  3. ステップ3.2の各mAb溶液50 μLをELISAプレートの各ウェルにピペットで移します。プレートをプラスチック製の蓋で覆い、室温で30分または一晩インキュベートします。
  4. ウェルの内容物を吸引し、プレートを逆さまにしてペーパータオルで少なくとも5回軽くたたいて、すべての液体を取り除きます。
    注:吸引システム(クリーンチップに接続されたマルチチャンネル真空吸引)が利用できない場合は、抗体をシンクに捨ててから、プレートをペーパータオルで軽くたたきます。
  5. 200 μLのBBを加えて、プレート内のすべてのウェルを充填します。プレートをプラスチック製の蓋で覆います。プレートを室温で1時間インキュベートします。井戸の内容物を吸引または捨てます。プレートを逆さまにしてペーパータオルで5回軽くたたいて、すべての液体を取り除きます。
  6. 次のように、蚊のホモジネートとコントロールをプレートにロードします。
    1. 50 μLのポジティブコントロールをウェルH1およびH2に加えます。
    2. 50 μL の BB を 1 列目と 2 列目の C から G までのウェルに添加します。次に、50 μLのポジティブコントロールをウェルG1およびG2に加えます。G1とG2から始まり、F1とF2とC1とC2までポジティブコントロールの段階希釈を行います。
      注:すべてのポジティブコントロールウェルには50μLが含まれている必要があります。
    3. 50 μL の BB (ネガティブコントロール) をウェル A1、A2、B1、B2 に加えます。
    4. 各ホモジネートサンプル50 μLを未知(Unk)ウェルに加えます。
    5. プレートを覆い、室温で2時間インキュベートします。
  7. 約2時間後、基板の準備を開始します。ABTS基板2成分キットでは、基板Aと基板Bを1:1の比率で混合します。
    注:フル96ウェルプレートには、5 mLの基質Aと5 mLの基質Bが必要です。
  8. ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体のPf、Pv-210、およびPv-247用のワーキング溶液を調製するには、再構成したコンジュゲートモノクローナル抗体にBBを添加して、1 μg/mLのワーキング濃度を得ます。
    1. プレートあたり 5 mL のワーキングコンジュゲート mAb 溶液を添加して、必要な容量を計算します。
    2. ステップ 3.8 で作製したペルオキシダーゼ標識 mAb 5 μL とステップ 3.7 で作製した基質 100 μL を別の 1.5 mL チューブで混合して、ペルオキシダーゼ活性をテストします。優しく渦を巻きます。
      注:透明から緑色への急速な色の変化があり、ペルオキシダーゼ酵素と基質が機能していることを示します。
  9. ウェルの内容物を吸引または捨て、プレートを逆さまにしてペーパータオルで5回軽くたたいて、すべての液体を取り除きます。
  10. 200 μL の PBS-Tween でウェルを 2 回洗浄し、ウェル内容物を吸引し、プレートを 5 回ずつ軽くたたきます。
  11. ステップ3.8で作製したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体50 μLを各ウェルに加えます。プレートを覆い、暗所で室温で1時間インキュベートします。ウェルの内容物を吸引または捨て、プレートを逆さまにしてペーパータオルで5回たたきます。
  12. 200 μLのPBS-Tweenでウェルを3回洗浄し、ウェル内容物を吸引し、プレートを各5回タップします。
  13. ステップ3.7で調製した基質溶液100μLを各ウェルに加えます。プレートを覆い、暗所で室温で30分間インキュベートします。
  14. 30分後、ELISAプレートリーダーを使用して405-414nmの吸光度を読み取ります。
    注意: 使用するELISAプレートリーダーの特定の指示に従ってください。このプロトコルに使用するソフトウェアの説明書については、 補足資料S2を参照してください。ポジティブコントロールウェルでは、クリアからグリーンへの顕著な色の変化があるはずです。

4. 分析

  1. 陽性サンプルの検出。
    1. カットオフ値を超える吸光度値 (ネガティブ・サンプルの平均吸光度の 2 倍) を持つサンプルに正のラベルを付けます。
  2. CSPの定量化
    1. 以下のように、コントロール希釈系列から構築された標準曲線を用いて、サンプル中のCSP濃度を推定します。
      1. 段階希釈したコントロールの吸光度値(y軸)をその濃度(x軸)に対してプロットすることにより、標準曲線を作成します。
      2. 線形回帰を実行して、y = A + Bx (A と B は自由パラメーター) を使用して最適な近似を決定します。
      3. 各正のサンプルのCSP濃度は、与えられた吸光度値の方程式を解いて決定します。

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結果

代表的なELISA結果を 図2に示します。この実験では、 熱帯熱マラリア原虫 ELISAがA7井戸でスポロゾイト感染を検出しました。ポジウェルは、そのかすかな緑色で視覚的に検出できました(図2A)。このウェルの吸光度値は、カットオフ閾値(4つのネガティブコントロールウェルの平均値の2倍)を超えていました(図2B)。80 個の未知のウェルすべての吸光度値の分布を 図 2C に示します。バックグラウンド(ネガティブコントロール)減算後のインプレート標準曲線によるウェルA7のCSP定量では、CSP濃度が0.35 pg/μLであることが示唆されています(図2D)。VK210およびVK247の 三日熱マラリア原虫 アッセイは、このサンプルセットに対して両方とも陰性であり(データは示さず)、A7のスポロゾイト感染が単種...

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ディスカッション

CSP-ELISAは、マラリア原虫CSPを検出するための非常に特異的で費用対効果の高い方法を提供します。これにより、熱帯熱マラリア原虫と三日熱マラリア原虫のスポロゾイト、および三日熱マラリア虫11,13,14,15の2つのサブタイプVK210とVK247を区別することができます。信頼性と再現性のある結果を得るためには、特定の重要なポイントを考慮する必要があります。すべての溶液は、微生物の増殖を防ぐために、冷蔵庫に1週間未満保管する必要があります。mAbは、50%グリセロールを含む希釈剤に保持し、必要に応じて分注して、複数回の凍結融解を防ぐ必要があります。ポジティブコントロールは、1回の使用のために分注する必要があります。ELISAプレートは、蒸発を防ぐために、インキュベーション期間中は蓋で覆う必要があります。ペル...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

Kirakorn Kiatibutr氏(MVRU)の研修と指導に感謝します。また、 図2の作成に技術協力してくださったMVRUのPinyapat Kongngen氏にも感謝します。この研究は、国立アレルギー感染症研究所および国立衛生研究所(U19 AI089672)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
ELISAプレートリーダーBioTekInstrument、Inc.シナジーH1吸光度はUV-VIS吸光度検出モードを使用して測定されます
グラインダーAxygenPES-15-B-SI蚊の頭/胸部の均質化
Reagents
ABTS基板 2成分KPL50-62-00ペルオキシダーゼ駆動検出用
ブロッキングバッファー(BB)注:solution
Captureおよびペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体(mAb)注:mAbsは、BEI Resources(https://www.beiresources.org)のSporozoite ELISA試薬キット(熱帯熱マラリア原虫の場合はMRA-890、三日熱マラリア原虫の場合はMRA-1028K)の一部として凍結乾燥された形態で入手できます。
カゼインシグマアルドリッチ9000-71-9ブロッキングバッファー調製用
粉砕バッファー(GB)注:溶液
イゲパルCA-630グマアルドリッチ9002-93-1研削バッファー調製
用KClシグマアルドリッチ7447-40-7リン酸塩緩衝液生理食塩水調製用
KH2PO4Sigma aldrich7778-77-0リン酸緩衝液生理食塩水調製用
Na2HPO4Sigma aldrich7558-79-4リン酸緩衝液生理食塩水調製用
NaClSigma aldrich7647-14-5リン酸緩衝生理食塩水調製用
NaOHSigma aldrich1310-73-2ブロッキング緩衝液調製用
PBS-Tween
Pf 捕捉mAb CDCPf-CAP Pfスポロゾイトタンパク質
Pf ペルオキシダーゼ mAbCDCPf-HRPPf サーカムスポロゾイトタンパク質
Pf ポジティブコントロールCDCPf-PCPf ポジティブコントロール
フェノールレッドSigma aldrich143-74-8ブロッキングバッファー調製用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)注:溶液
ポジティブコントロール注:溶液
Pv210 捕捉 mAbCDCPv210-CAPPv210 サーカムスポロゾイトタンパク質
Pv210 ペルオキシダーゼ mAbCDCPv210-HRPPv210 サーカムスポロゾイトタンパク質 Pv210
ポジティブコントロールCDCPv210-PCPv210 ポジティブコントロール
Pv247 キャプチャ mAbCDCPv247-CAPPv247 サーカムスポロゾイトタンパク質
Pv247 ペルオキシダーゼ mAbCDCPv247-HRPPv247 サーカムスポロゾイトタンパク質
Pv247 ポジティブコントロールCDCPv247-PCPv247 ポジティブコントロール
Tween20Sigma aldrich9005-64-5PBS-Tween 調製用
消耗品
使い捨てピペッティングリザーバー汎用作業試薬用
ELISAプレート:96ウェルクリアラウンドボトム PVSコーニングライフサイエンス2797ELISA
用 手袋:使い捨て手袋と冷凍庫手袋汎用個人用保護
具用 ラボ用ガウン汎用個人用保護具
マルチチャンネルピペット P30-300汎用溶液移送用
ピペットセット、P2、P20、P200、P1000汎用溶液移送
用 ピペットチップ 10 & マイクロ;L、200 µL、および1000 µLジェネリック溶液移送用
血清ピペット 5 mL、10 mLジェネリック溶液移送用
トランスファーピペットジェネリック溶液移送用
乳棒 用シ

参考文献

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , Geneva. (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224(2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195(2011).

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