方法論記事

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

DOI：

10.3791/63162

⸱

2022年4月6日

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。

要約

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炎症性カスパーゼは、カスパーゼ−1、−4、−5、−11、および−12を含み、開始カスパーゼのサブグループに属する。カスパーゼ-1は、炎症シグナル伝達の正しい調節を確実にするために必要であり、インフラマソームへの動員に続く近接誘導二量体化によって活性化される。カスパーゼ-1は単球系細胞系譜に豊富であり、炎症誘発性サイトカインインターロイキン(IL)-1βおよびIL-18の成熟を活性分泌分子に誘導する。他の炎症性カスパーゼでは、カスパーゼ−4および−5(ならびにそれらのマウスホモログカスパーゼ−11)は、ピロトーシスを誘導することによってIL−1β放出を促進する。カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)は、カスパーゼ活性化の読み出しとして炎症性カスパーゼ誘導近接を測定するために使用されるツールです。インフラマソームに結合する領域を含むカスパーゼ-1、-4、または-5プロドメインは、黄色蛍光タンパク質Venus(Venus-N [VN]またはVenus-C [VC])の非蛍光断片に融合され、カスパーゼが誘導近接したときに蛍光金星複合体を改質する。このプロトコルは、ヌクレオフェクションを使用してこれらのレポーターを初代ヒト単球由来マクロファージ(MDM)に導入する方法、炎症性カスパーゼ活性化を誘導するために細胞を治療する方法、および蛍光および共焦点顕微鏡を用いてカスパーゼ活性化を測定する方法を記述している。このアプローチの利点は、生細胞における炎症性カスパーゼ活性化複合体の成分、要件、および局在を同定するために使用することができることである。しかし、細胞の生存率と挙動を損なわないように、慎重な制御を考慮する必要があります。この技術は、インフラマソームレベルでの動的カスパーゼ相互作用の分析、ならびにヒト血液サンプル由来の生きたMDMおよび単球における炎症シグナル伝達カスケードの尋問のための強力なツールである。

概要

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カスパーゼは、システインアスパラギン酸プロテアーゼのファミリーであり、イニシエーターカスパーゼおよび死刑執行人カスパーゼにグループ化することができる。死刑執行人カスパーゼは、カスパーゼ-3、-6および-7を含む。それらは二量体として細胞内に自然に見出され、アポトーシス1を実行するために開始カスパーゼによって切断される。開始カスパーゼには、ヒトカスパーゼ−1、−2、−4、−5、−8、−9、−10および−12が含まれる。それらは、近接誘導二量体化によって活性化され、自己タンパク質分解切断によって安定化される不活性ザイモゲン(プロカスパーゼ)として見出される2,3。炎症性カスパーゼは、開始カスパーゼ2のサブセットであり、ヒトにおけるカスパーゼ−1、−4、−5、および−12、ならびにマウス4、5におけるカスパーゼ−1、−11、および−12を包含する。アポトーシスの役割ではなく、炎症において中心的な役割を果たします。それらは、病原性侵入者8,9に応答して放出される最初のサイトカインであるプロインターロイキン(IL)−1βおよびプロIL−18 6,7のタンパク質分解的プロセシングおよび分泌を媒介する。カスパーゼ-1は、その活性化プラットフォームへの募集時に活性化される。インフラマソームと呼ばれる大きな分子量のタンパク質複合体(図1A)10。カスパーゼ−4、−5、および−11の二量体化は、非正準インフラマソーム経路11、12を介してこれらのプラットフォームとは独立して起こる。

正準インフラマソームは、インフラマソームセンサータンパク質、アダプタータンパク質ASC(CARDを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質)、およびエフェクタータンパク質カスパーゼ-110からなる細胞質ゾル多量体タンパク質複合体である。最もよく研究された正準インフラマソームは、ピリンドメイン(NLRP)、NLRP1およびNLRP3を含むNOD様受容体ファミリー、CARD(NLRC)、NLRC4を含むNLRファミリー、および黒色腫2に存在しない(AIM2)である。それらはそれぞれ、ピリンドメイン、CARD、またはその両方のドメインを含む。CARD ドメインは、CARD を含むカスパーゼとそのアップストリーム アクティベーター間の相互作用を仲介します。したがって、N末端ピリンドメイン(PYD)とC末端CARDモチーフ13,14とからなる足場分子ASCは、NLRP110、NLRP3 15、およびAIM216インフラマソームへのカスパーゼ-1のリクルートに必要である。

各インフラマソームは、明確な炎症促進性刺激を認識する独自のセンサータンパク質にちなんで名付けられました(図1B)。この経路の活性化因子は、正準刺激と呼ばれる。インフラマソームは、微生物成分および組織ストレスのセンサとして機能し、炎症性カスパーゼ17の活性化を介して堅牢な炎症反応を誘発するように組み立てられる。インフラマソームアセンブリは、カスパーゼ−1活性化を開始し、その主要基質であるプロ−IL−1βおよびプロIL−18の成熟および分泌を媒介する。このプロセスは、2段階のメカニズムを介して行われます。第1に、プライミング刺激は、NF−κB経路の活性化を介して、ある種のインフラマソームタンパク質およびプロIL−1βの発現をアップレギュレートする。第二に、細胞内(正準)刺激は、プロカスパーゼ-1 6,7のインフラマソーム集合および動員を誘導する。

カスパーゼ−4およびカスパーゼ−5は、マウスカスパーゼ−11 11のヒトオルソログである。それらは、グラム陰性菌18、19、20の外膜に見られる分子である細胞内リポ多糖(LPS)および赤血球溶血21の産物である細胞外ヘムによって、インフラマソーム非依存的に活性化される。LPSがこれらのタンパク質のCARDモチーフに直接結合し、それらのオリゴマー化を誘導することが提案されている20。カスパーゼ-4またはカスパーゼ-5の活性化は、孔形成タンパク質ガスデルミンD(GSDMD)の切断を介してピロトーシスと呼ばれる炎症型の細胞死を誘導することによってIL-1β放出を促進する18,19。さらに、カスパーゼ−4およびGSDMD媒介性パイロプトーシス死から生じるカリウムイオンの流出は、NLRP3インフラマソームの活性化およびその後のカスパーゼ−1の活性化を誘導する22,23。したがって、カスパーゼ−4、−5、および−11は、特定の刺激に応答してパイロプトーシスおよびカスパーゼ−1活性化を誘導することができるLPSの細胞内センサと考えられる11、24。

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図1:炎症性カスパーゼおよびカスパーゼ-二分子蛍光相補(BiFC)アッセイ。(A)カスパーゼ-BiFC系を示す図では、金星の各非蛍光断片(Venus-CまたはVenus-N)に連結された2つのカスパーゼ-1プロドメイン(C1-pro)がNLRP3活性化プラットフォームにリクルートされ、金星にリフォールドと蛍光が強制されます。この複合体は、顕微鏡下で緑色の斑点として現れ、開始カスパーゼ活性化の最初のステップである炎症性カスパーゼ誘発近接の読み出しとして機能する。(b)インフラマソーム成分および炎症性カスパーゼのドメイン組織を示す模式図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

特定の開始剤カスパーゼ活性化を測定することは困難であり、イメージングアプローチによってこれを行うために利用可能な方法は多くない。カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)は、生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を直接可視化するために使用できます(図1A)25。この技術は、最近、ヒト単球由来マクロファージ(MDM)21における使用に適応されている。カスパーゼBiFCは、炎症性カスパーゼ活性化における第1ステップを測定し、二量体化を促進するために近接を誘導する。CARD含有カスパーゼプロドメインをコードするプラスミドの発現は、光線上黄色蛍光タンパク質Venusの非蛍光断片に融合(Venus−C[VC])およびVenus−N[VN])が使用される。2つのカスパーゼプロドメインが活性化プラットフォームにリクルートされるか、または誘導された近接を受けると、金星の2つの半分が近接し、リフォールドおよび蛍光を発することを余儀なくされる( 図1A、B参照)。これは、特定の炎症性カスパーゼ活性化のリアルタイム読み出しを提供する。

ヒトMDMは、危険シグナルや病原体産物を同定するインフラマソーム遺伝子やパターン認識受容体を豊富に発現しています。これは、炎症性カスパーゼ経路の尋問に理想的な細胞型を提供する。さらに、それらは末梢血から、さらには患者サンプルから誘導して、特定の疾患状態における炎症性カスパーゼ活性化を評価することができる。このプロトコルでは、ヌクレオフェクションを使用してBiFCカスパーゼレポーターをMDMに導入する方法、エレクトロポレーションベースのトランスフェクション法、炎症性カスパーゼ活性化を誘導するために細胞を治療する方法、および顕微鏡アプローチを使用して活性カスパーゼ複合体を視覚化する方法について説明しています。さらに、この方法論は、これらの複合体の分子組成、細胞内局在化、動態、およびこれらの高度に秩序付けられた構造のサイズを決定するために適合させることができる25、26、27。

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プロトコル

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このプロトコルは、ベイラー医科大学のヒト研究倫理委員会のヒトサンプルの操作に関するガイドラインに従っています。血液サンプルは、ヒトサンプルの機関安全ガイドラインに従って取り扱われます。血液サンプルは地域の血液バンクで得られ、そこでクエン酸リン酸デキストロース(CPD)溶液で収集されます。しかしながら、ヘパリンナトリウム、リチウムヘパリン、またはEDTAのような他の抗凝固剤を用いて収集された血液も、このプロトコル28,29に使用することができる。

1. ヒト単球の単離とマクロファージへの分化

  1. 地域の血液バンクで非同定健常者から抗凝固血液を取得し、以下に示すように末梢血単核球(PBMC)を単離する。
    メモ: 組織培養層流フードですべての手順を実行します。滅菌チューブのみを使用し、手袋を着用してください。廃棄時にすべての血液関連製品に10%の漂白剤を加えてください。滅菌PBS(1x)またはDPBS(Caなし)2+ および Mg2+) は、同じ意味で使用できます。

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結果

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選択されたCD14+単球をGM-CSFと共に7日間インキュベートした後、細胞形態は分化期間の過程で変化し(図3A)、球状浮遊細胞からスピン状および完全に付着する(3日目および4日目)まで、 そして最後に、完全に分化したときに細胞をより広げる(7日目)。次いで、完全に分化した細胞をプレートから剥離し、カスパーゼBiFC対(VCおよびVN)をレポータープラスミド(例えば、ミトコンドリアを標的とする赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミド)と共にトランスフェクトし(例えば、dsRedmito)、トランスフェクトされた細胞を標識するために使用され(図3B)、24時間後のトランスフェクションの効率を評価するために使用される。 NLRP3インフラマソームの組み立てを誘発する既知の炎症促進刺激であるニゲリシン(5μM)で20時間処理したカスパーゼ−...

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ディスカッション

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このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単離された単球からマクロファージを得るワークフローと、細胞の生存率および挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼBiFCレポーターをヒトMDMに効率的に導入する方法を記述している。

このプロトコルは、BiFC技術35 を利用して、カスパーゼリクルートメントドメイン(CARD)における炎症性カスパーゼを、分割蛍光タンパク質Venusの非蛍光断片でタグ付けする。炎症性カスパーゼは、大きな(p20)サブユニットと小さな(p10)サブユニットからなる触媒ドメインと、それらのN末端またはプロドメイン36 でCARDと呼ばれる保存されたタンパク質間相互作用モチーフをコードする(図1B)。それらの活性化プラットフォームへの炎症性カスパーゼの募集は、無傷のCARDに依存する。このアプローチのために、2つのカスパーゼプロドメイン構築物(CARDモチーフをコードする)が生成され、それぞれが、写真化可能な黄色タンパク...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この技術の開発に貢献したLBHの過去と現在の研究室のメンバーに感謝します。このラボは、NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB)、NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB)、NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH) によってサポートされています。図2は、Biorenderソフトウェアを使用して描画されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
48ウェル組織培養2:34プレートGenesee Scientific25-108
10 cm組織培養皿VWR25382-166
2メルカプトエタノール1000xサーモフィッシャーサイエンティフィック21985023
8ウェルチャンバーカバーガラスと1.5 HPカバーグラスCellvisc8-1.5H-N
AutoMACSカラムMiltenyi(Biotec)130-021-101AutoMACS Proセパレーターのみによる自動分離の場合
AutoMACS ProセパレーターMiltenyi(バイオテック)130-092-545AutoMACS Proセパレーターのみを使用した自動分離の場合
AutoMACS Pro洗浄液ミルテニー(バイオテック)130-092-987AutoMACS Proセパレーターのみを使用した自動分離の場合
AutoMACSリンス液ミルテニー(バイオテック)130-091-222AutoMACS Proセパレーターを使用した自動分離の場合
AutoMacsのみ ランニングバッファーMiltenyi (Biotec)130-091-221QuadroMACSまたはAutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 CSU-X1A 5000回転ディスクユニットZeissを搭載した電動倒立顕微鏡を使用した手動または自動分離の場合568 nm (RFP) と 488 nm または 512 nm (GFP または YFP) の波長のレーザーラインを装着したレーザーモジュールを装備した共焦点顕微鏡を使用することができます
AxioObserver A1, Research Grade Inverted MicroscopeZeiss568 nm (RFP) と 488 nm または 512 nm (GFP または YFP) の波長を励起できる蛍光フィルターを備えた任意の落射蛍光顕微鏡を使用することができます
CD14+ MICROBEADSMiltenyi (Biotec)130-050-201QuadroMACSまたはAutoMACS pro Separator DPBSを使用した手動または自動分離の場合
塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito plasmidClontech632421蛍光レポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgene
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100にあります。mLSigmaGE17-1440-02
GlutaMAX Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC)Sigma51280-1G
HEPESサーモフィッシャーサイエンティフィック15630106
炎症性カスパーゼ BiFC プラスミドLBHラボからのリクエストにより入手可能
LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS ColumnsMiltenyi (Biotec)130-042-401QuadroMACSセパレーターのみを使用した手動分離用
MACS 15 mL チューブラックMiltenyi (Biotec)130-091-052QuadroMACSセパレーターのみを使用した手動分離用
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303QuadroMACSセパレーターのみを使用した手動分離の場合
mCherryプラスミドYungpeng Wang Labレポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgene
Neon Transfection Systemで見つけることができますサーモフィッシャーサイエンティフィックMPK5000ネオンエレクトロポレーション装置、ピペット、ピペットステーション
ネオントランスフェクションシステム 10 & マイクロ;LキットサーモフィッシャーサイエンティフィックMPK1096再懸濁緩衝液R、再懸濁緩衝液T、電解緩衝E、96 x 10 µL ネオンチップとネオンエレクトロポレーションチューブ
ニゲリシンナトリウム塩、既製溶液シグマSML1779-1ML
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィック15140122
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩シグマP7280-5mg
QuadroMACS セパレーターミルテニー (バイオテック)130-090-976手動分離用QuadroMACS セパレーターのみ
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 中サーモフィッシャーサイエンティフィック11875119
トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック25200072
UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0サーモフィッシャーサイエンティフィック15575020
Zeiss Zen 2.6 (ブルーエディション) ソフトウェアZeiss、選択した共焦点顕微鏡を操作するために使用される任意のソフトウェア
のみ 、 蛍光は

参考文献

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BiFC

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