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方法論記事

ゼブラフィッシュとメダカを用いた成体視神経筋の刺創損傷モデルによる再生能力の比較解析

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DOI:

10.3791/63166

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2022年2月10日

 , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2DBT-AIST International Laboratory for Advanced Biomedicine, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology

この記事について

サマリー

成体ゼブラフィッシュの機械的脳損傷モデルを用いて、ゼブラフィッシュの高い再生能力を調節する分子機構を調べることが記載されている。この方法は、蛍光免疫染色を用いて再生応答を評価するために、複数の種の小魚の視蓋に刺創損傷を作り出すことを説明している。

要約

ゼブラフィッシュは中枢神経系(CNS)の再生能力が優れていますが、メダカはCNSの再生能力が低いです。ゼブラフィッシュとメダカの成体視蓋で脳損傷モデルを開発し、これらの魚種全体でこの組織の高い再生能力を制御する分子メカニズムを解明するために、比較組織学的および分子学的解析を行いました。ここでは、針を使用した成人の視蓋の刺創損傷モデルと、神経幹細胞(NSC)の増殖と分化のための組織学的分析を示します。針を視蓋の中央領域に手動で挿入し、次に魚を心臓内に灌流し、そしてそれらの脳を解剖した。次に、これらの組織を凍結切片化し、適切なNSC増殖および分化マーカーに対して免疫染色を使用して評価しました。このテクタム損傷モデルは、ゼブラフィッシュとメダカの両方で堅牢で再現性のある結果を提供し、損傷後のNSC反応を比較することができます。この方法は、ゼブラフィッシュ、メダカ、アフリカメダカなどの小型硬骨魚に利用でき、それらの再生能力を比較し、独自の分子メカニズムを調べることができます。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、他の哺乳類と比較して中枢神経系(CNS)を再生する能力が向上しています1,2,3。最近、この再生能力の増加の根底にある分子メカニズムをよりよく理解するために、次世代シーケンシング技術を使用した組織再生の比較分析が行われています4,5,6。ゼブラフィッシュとテトラポッドの脳構造はかなり異なります7,8,9。これは、この再生能力の増加に寄与する基礎となる分子メカニズムの研究を容易にするために、同様の脳構造と生物学的特徴を持つ小魚を使用したいくつかの脳損傷モデルが開発されたことを意味します。

さらに、メダカ(Oryzias latipes)は、ゼブラフィッシュと比較して心臓およびニューロンの再生能力が低い人気のある実験動物です10,11,12,13。ゼブラフィッシュとメダカは、成体神経幹細胞(NSC)の脳構造とニッチが似ています14,15,16,17。ゼブラフィッシュとメダカでは、視蓋には神経上皮様幹細胞と放射状グリア細胞(RGC)の2種類のNSCが含まれています15,18。成体ゼブラフィッシュの視蓋の刺創損傷は以前に開発されており、このモデルを使用して、これらの動物の脳再生を制御する分子メカニズムを調査しました19,20,21,22,23。この若年成体のゼブラフィッシュ刺し傷損傷モデルは、RGCs19,24,25から再生神経新生を誘導した。視蓋におけるこの刺し傷損傷は、堅牢で再現性のある方法である13、19、20、21、22、23、24、25。同じ損傷モデルを成人メダカに適用したところ、損傷後のRGC増殖と分化の比較解析により、メダカ視野におけるRGCの神経原性能力が低いことが明らかになりました13。

視蓋の刺し傷損傷モデルは、ミイラモデル26でも開発されていますが、終脳損傷と比較した場合、蓋損傷の詳細は十分に文書化されていません27。ゼブラフィッシュとメダカを用いた視蓋の刺創損傷により、再生能力の異なる種間の細胞応答と遺伝子発現の違いを調べることができます。このプロトコルは、注射針を使用して視蓋の刺し傷損傷を行う方法を説明しています。この方法は、ゼブラフィッシュやメダカなどの小魚にも適用できます。ここでは、蛍光免疫組織化学および凍結切片を用いた組織学的解析および細胞増殖および分化解析のためのサンプル調製のプロセスについて説明します。

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プロトコル

すべての実験プロトコルは、国立研究開発法人産業技術総合研究所の動物管理・利用委員会で承認されました。ゼブラフィッシュとメダカは、標準的な手順28に従って維持されました。

1.成人の視蓋の刺し傷損傷

  1. 麻酔用の0.4%(w / v)トリカインストック溶液を調製します。100 mLのストック溶液の場合、400 mgのトリカインメタンスルホン酸塩( 材料の表を参照)を90 mLの蒸留水に溶解し、1 MトリスHClバッファー(pH 9.0)を使用してpHを7.0に調整します。pHが調整されたら、100 mLまでの水を加え、適切なアリコートを作り、-20°Cで保存します。
  2. 成体のゼブラフィッシュやメダカを麻酔するには、0.4%トリカイン原液を魚施設の水で希釈して、0.02%(w/v)のトリカイン溶液を調製します。
  3. 0.02%トリカイン溶液で魚を麻酔する。彼らは動かないか、タッチに反応しないとき(1〜2分)に麻酔をかけられます。
  4. 麻酔をかけた魚を発泡スチロールのトレイ( 材料の表を参照)に置き、発泡スチロールに垂直に挿入された2本の30G針の間に魚を直立させて固定します。
  5. 魚の頭が動かないように魚体を持ち、頭蓋から視蓋半球の1つの内側領域に30 Gの針を垂直に挿入します(図1A、B)。挿入深さは~0.75mmで、30Gのベベルの長さの半分にほぼ相当します。この挿入深さは、ゼブラフィッシュとメダカの体格が似ているため、これらの魚に脳損傷を誘発します。
    注:メダカは頭蓋骨に鱗があります。30 Gの針を使用して鱗を引っ掻いて取り除き、刺し傷の損傷を効率的かつ正確に誘発します(図1C)。
  6. 負傷した魚を鮮魚施設の水を入れた水槽に移し、麻酔から完全に回復したら水槽を養殖システムに移します。
    注:魚は回復し、数分以内に自由に動き始めます。
  7. 損傷後の系統分析のために、5 mMブロモデオキシウリジン(BrdU)を含む鮮魚施設の水を調製し(材料の表を参照)、次にこの5 mM BrdU溶液で魚を所定の時間インキュベートします13,19(実験計画によって決定)。次に、ステップ2に従ってこれらの魚を解剖し、BrdUの取り込みと細胞系譜の同一性を適宜評価します。
    注:このステップは、細胞系譜解析のオプションステップです。BrdUシグナルを検出するには、ステップ4.3に示すように抗原賦活化を行います。

2.脳解剖

  1. 0.02%トリカイン溶液、解剖用の発泡スチロールトレイ、および心臓内灌流用の延長チューブと30 G針( 材料の表を参照)を備えたリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を含む10 mLシリンジを準備します。
  2. 選択した時点で負傷した魚を麻酔します。
  3. 発泡スチロールのトレイにペーパータオルを置き、麻酔をかけた魚をペーパータオルの上に置きます。
  4. 臀鰭の両側に2本の30G針を垂直に挿入して、魚体を所定の位置に保持します(図2A)。
  5. 肛門から心臓まで腹側を切開し(図2B)、この臓器の両側にさらに2本の30G針を挿入して心臓を見えるようにします(図2C)。
    注:心臓は、ゼブラフィッシュとメダカの両方で皮下組織の銀色の上皮層で覆われています(図2C)。
  6. 鉗子の先端で銀の上皮層をそっと取り除きます(図2D)。
  7. 30 Gの針を心室に挿入し、斜角を上に保ち、鉗子を使用して心房を切開します(図2E)。シリンジを慎重に押し下げて1x PBSを押し、心房が血液を洗い流したことを確認します。
    注意: 針が心室を貫通するのを防ぐために、針をハーフベベルの深さまで慎重に挿入してから、挿入深さを調整します。灌流がうまくいけば、えらは白くなります(図2F、G)。
  8. 血液が排出され、えらが白くなったら灌流を止めます。
  9. 魚体を所定の位置に固定している針を取り外し、魚の腹側を下にして固定します(図2H)。脊髄を切断し、視蓋と終脳から頭蓋骨を取り除きます(図2I)。次に、視神経を切断し、脳を慎重に解剖します。
    注:神経は蓋に接続されているため、解剖中は視神経に注意してください。視神経が引っ張られると、視蓋が脳から剥離することができます。血液除去が完了していない場合、脳は淡いピンク色に見えます( 図2Jの右脳)。
  10. 脳を1x PBS中の1 mLの4%パラホルムアルデヒドを含む1.5 mLチューブに移し、4°Cで一晩固定します。

3.凍結切片の準備

  1. 固定された脳を1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
  2. 脳を凍結保護するには、1x PBS中の1 mLの30%(w / v)スクロースを含む1.5 mLチューブに移し、4°Cで一晩インキュベートします。 30 mLのOCTと15 mLの30%スクロースを組み合わせて、包埋化合物(OCT化合物と30%スクロースの2:1混合物、 材料の表を参照)を調製します。これを4°Cで保存してください。
    注意: 混合コンパウンドから気泡を除去するには、50 mLチューブを10,000 x g で室温で2分間遠心分離するか、チューブを一晩直立させます。
  3. 解剖した脳を埋め込み化合物とともにクライオモールドに埋め込んだ直後に、アルミニウムブロックを-80°Cで一晩インキュベートして、クライオモールド( 材料の表を参照)を冷却します。
    注意: 液体窒素を使用して、アルミニウムブロックを冷却することもできます。その場合、アルミニウムブロックは、埋め込む直前にアルミニウムブロックを覆うのに十分な液体窒素で満たされた発泡スチロールの箱に入れる必要があります。液体窒素の昇華を確認したら、予冷したアルミニウムブロックの上にクライオモールドを置きます。一度にいくつのクライオモールドをアルミブロックに配置できるかを確認することをお勧めします。液体窒素または追加の予冷ブロックを使用して、すべてのサンプルをすばやく冷却するのに十分なスペースを確保することをお勧めします。
  4. 予冷したアルミブロックを発泡スチロールの箱に入れます。アルミブロックが温まるのを防ぐために、蓋付きの発泡スチロールの箱を使用してください。
  5. 冠状切片の場合は、脳をクライオモールドに埋め込み、顕微鏡下で鉗子を使用して向きを調整します(図3A)。
  6. 発泡スチロールボックス内の予冷アルミニウムブロックにクライオモールドを置き、OCTコンパウンドを凍結させます(図3B)。OCT化合物が凍結し始めると、白色になります。
  7. OCT化合物の小さな円を試料ディスクに塗布し、クライオブロックをマウントしてクライオブロックを試料ディスクに取り付けます。
  8. 検体ディスクをクライオスタットに入れ、OCTコンパウンドを完全に凍結させます。
  9. 試料ディスクをクライオスタットの試料ヘッドに置きます。
  10. クライオブロックの向きを設定し、OCT をトリミングして余分な領域を削除します。
    注意: 終脳を切断しながら、切断面の向きを調整します。ブレードにはクライオスタットが装備されています。試験片ヘッドの角度を変えることで切断面の向きを調整することができます。
  11. クライオスタットを使用して、光学蓋全体を通して厚さ14μmのシリアルセクションを切断します。スライドは-25°Cで保管してください。
    注意: 長期保管は-80°Cである必要があります。

4. 蛍光免疫染色

  1. 乾いたガラスをスライドラックに室温(RT)で30分間スライドさせます。スライドを1x PBSでRTで30分間洗浄します。抗PCNA抗体またはBrdU抗体による免疫染色を行う場合は、ステップ4.2またはステップ4.3に進みます。
  2. 500 mLビーカーに500 mLの10 mMクエン酸ナトリウムを調製し、ホットプレートマグネチックスターラーでクエン酸バッファーを85°Cに温めてから、スライド染色ラックに入れ、ラックをクエン酸バッファー中で85°Cで30分間インキュベートします。沸騰しないように、温度を約85°Cに保ちます。 抗原賦活化後、スライドを1x PBS(PBSTr)中の0.1%トリトンで3回洗浄し、各洗浄はRTで5分かかります。
    注:このステップは、増殖細胞核抗原(PCNA)検索のためのオプションのステップです。
  3. 12 N HClを蒸留水で希釈して、2 N HCl溶液を調製します。液体ブロッカー( 材料の表を参照)を使用して、疎水性バリアとして線を引き、2 N HCl溶液を切片の周りに保ちます。
    1. スライドを免疫染色トレイに置き、200〜300 μLの2N HCl溶液を塗布します。トレイを37°Cで30分間インキュベートします。抗原賦活化後、0.1%PBSTrで3回洗浄し、各洗浄はRTで5分間かかります。
      注:このステップは、BrdU抗原賦活化のためのオプションのステップです。
  4. ペーパータオルを使用して残りの溶液を吸収して除去します。次に、液体ブロッカーを使用して疎水性バリアを描画し、必要に応じて抗体溶液を切片の周りに保持します。
  5. スライドをトレイに置き、200〜300 μLのブロッキング溶液、PBSTr中の3%(v / v)ウマ血清をすべてのスライドに適用し、RTで1時間インキュベートします。
  6. 切片をPBSTrでRTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
  7. ブロッキング溶液(スライドごとに200〜300 μLの抗体溶液)を使用して一次抗体( 材料の表を参照)を調製します。ペーパータオルで残りのPBSTrを取り除き、スライドを免疫染色トレイに置きます。一次抗体溶液をすべてのスライドに適用し、トレイを4°Cで一晩インキュベートします。
  8. 切片をPBSTrでRTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
  9. ブロッキングバッファー(1:500)を使用して蛍光二次抗体溶液( 材料の表を参照)を調製します。ペーパータオルで残りのPBSTrを取り除き、スライドを免疫染色トレイに置きます。二次抗体溶液をすべてのスライドに塗布し、アルミホイルでトレイをシェードします。RTで1〜2時間インキュベートします。
  10. 切片をPBSTrでRTで5分間、光にさらさずに3回洗浄します。
  11. 核染色用のヘキスト溶液(1x PBSで1:500希釈、 材料表を参照)を調製します。ペーパータオルで残りのPBSTrを取り除き、スライドを免疫染色トレイに置きます。すべてのスライドにHoechstソリューションを適用し、トレイをアルミホイルで覆います。RTで30分間インキュベートします。
  12. 切片を光にさらさずにRTで10分間1x PBSで洗浄します。
  13. ペーパータオルを使用して残りの1x PBSを吸収して除去し、蛍光免疫染色用の水溶性封入剤( 材料の表を参照)を使用してスライドに切片をマウントします。24 x 45 mmのカバーガラスをセクションにゆっくりとセットします。スライドを光にさらさずに4°Cで保存してください。
  14. 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡下で切片を観察し、画像化します。

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結果

右半球への針挿入による視蓋の刺し傷損傷(図1、 図4A、 図5A)は、放射状グリア細胞(RGC)の増殖や新生児ニューロンの生成など、さまざまな細胞応答を誘導します。同様に、ゼブラフィッシュとメダカの高齢集団は、再生応答における老化の影響を打ち消すために使用されました。その後、凍結切片に対して蛍光免疫染色を行い、ゼブラフィッシュとメダカのテクタム損傷後のRGC増殖と分化を解析しました(図4-5)13。

ゼブラフィッシュおよびメダカで利用可能な増殖細胞マーカー、増殖細胞抗原(PCNA)、およびRGCマーカー、脳脂質結合タンパク質(BLBP)に対する抗体を用いて、これらの組織におけるRGC増殖を評価した13、

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ディスカッション

ここでは、脳損傷後のRGC増殖および分化の評価を容易にするために針を利用して視蓋に刺創損傷を誘発するために使用できる一連の方法について説明する。針介在刺創は、シンプルで効率的に実装された方法であり、標準的なツールセットを使用して多くの実験サンプルに適用できます。ゼブラフィッシュ脳のいくつかの領域についての刺し傷損傷モデルが開発されている3、19、29。視蓋は脳の最も大きな部分の1つであり、操作が簡単です。さらに、視蓋内のほとんどのRGCは、終脳と比較して生理学的条件下で静止しているため、損傷に応じてRGCの増殖と分化を観察しやすくなります3,19。

刺し傷の重要なステップと制限の1つは、手動の針挿入です。再現性のある結果を作成し、比較分析を容易にするには、一貫した損傷が必要です。挿...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

本研究は、JSPS科研費18K14824、21K15195、および産総研学内助成の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10mLシリンジテルモSS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)NIPPON GENE314-90381
30G 針デントロニクスHS-2739A
4% パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液和光163-20145
アルミブロック115×80×37mm (幅×奥行×高さ) クライオモールド
6個を凍結できるサイズAnti-BLBPMilliporeABN141:500
Anti-BrdUAbcamab18931:500
Anti-HuCInvitrogenA212711:100
Anti-PCNASanta Cruz Biotechnologysc-561:200
BrmodeoxyuridineWako023-15563
共焦点顕微鏡 C1 plusNikon
クライオモールドさくらファインテック 日本456510 x 10 x 5 mm (W x D x H)
クライオスタットライカCM1960
Danio rerio WT株 RW
延長チューブテルモSF-ET3520
蛍光色素染色組織用 蛍光マウント (TM) 水性封入剤SIGMA-ALDRICHF4680-25ML
鉗子DUMONT11252-20
ヤギ抗マウスIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723
ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 546InvitrogenA11035
Hoechst 33342溶液同人堂23491-52-3
塩酸和光080-01066
スライド10枚用インキュベーションチャンバー ダークオレンジコスモバイオ10DO
MASコートスライディングガラス松波ガラスMAS-01
マイクロカバーガラス松波ガラスC024451
顕微鏡ニコンSMZ745T
正常馬血清遮断液ベクターラブラトリーS-2000-20
O.C.Tコンパウンド桜ファインテック日本 83-1824
Oryzias latipes WT株 キャブ
PAPペン スーパーリキッドブロッカー大同産業PAP-S
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)錠 pH 7.4TaKaRaT9181
発泡スチロールトレイ100×100×10 mm (幅×奥行×高さ) 発泡スチロールシートはトレイとして入手可能
ショ糖和光196-0001530% (w/v) PBSのショ糖
トリカイン(MS-222)nacarai tesque14805-24
クエン酸三ナトリウム二水和物和光191-01785
トリトン X-100和光04605-250

参考文献

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