マウス卵管の微小解剖と解離:個体セグメントの同定と単一細胞単離

サマリー

RNA完全性を維持しながら個々のセグメントの収集を可能にするマウス卵管の微小解剖のための方法が提示される。加えて、非酵素的卵管細胞解離手順が記載されている。この方法は、機能的に異なる卵管セグメントおよび解離した卵管細胞のその後の遺伝子およびタンパク質分析に適している。

要約

マウスモデルシステムは、その遺伝的操作性と実験的治療の低コストのために、疾患プロセスの分析には比類のないものです。しかし、その小さな体の大きさのために、直径200〜400μmの卵管のようないくつかの構造は、免疫組織化学によってを除いて研究することが比較的困難であることが証明されている。最近、免疫組織化学的研究は、以前に認識されていたよりも卵管セグメントのより複雑な違いを明らかにした。したがって、卵管は、7つの異なる上皮細胞型の異なる比率を有する4つの機能セグメントに分割される。上皮細胞型の異なる発生学的起源および比率は、4つの機能領域を疾患に対して差次的に感受性にする可能性が高い。例えば、漿液性上皮内癌の前駆体病変は、マウスモデルにおける眼底内およびヒト卵管内の対応するフィンブリア領域から生じる。ここで説明するプロトコルは、逆転写定量PCR(RT-qPCR)やRNAシーケンシング(RNAseq)などの下流分析に必要な十分な量と純度のRNAを得られるような方法で卵管を細分化するマイクロダイセクションの方法を詳述しています。また、完全に分化した卵管細胞のフローサイトメトリーまたは単一細胞RNAseq分析に適した、ほとんどが非酵素的な組織解離法も記載されている。記載された方法は、生殖、生殖能力、癌、および免疫学の分野におけるマウス卵管を利用するさらなる研究を容易にするであろう。

概要

マウスの卵管は、機能と形態が人間の卵管と似ています¹。どちらも擬似層状繊毛上皮からなり、歴史的に記述された2つの上皮常駐細胞、繊毛細胞と分泌細胞^{からなる1,2}。卵管には、古典的に認識された3つのセグメント、すなわち眼底、アンプラ、地峡があります。最近の研究では、Harwalkarらが^3は、卵管形態および遺伝子発現を調査し、常在上皮細胞の分類を7つの異なる集団に拡大させた。さらに、彼らは卵管の別個のセグメントとしてアンプラリー - 地峡接合部を確立した³。眼底内、アンプラ、および地峡に焦点を当てた本明細書に記載の方法は、アンプラ - 地峡接合部も含むように容易に拡張することができ^た2,3。眼底領域は、オスチウム、または卵管の開口部を含み、フィンブリア領域ならびに近位茎を含む。子宮に向かって移動すると、次はアンプラ、次に地峡です。繊毛化細胞は、卵巣または眼底の近位にある領域の遠位端で最も顕著であり、一方、分泌細胞は近位端または地峡セグメントで最も顕著である¹。ヒトの卵管とは異なり、マウス卵管は、広い靭帯腹膜の延長であるメソサルピンクスによって支持されたコイル構造である^1,4。さらに、マウス卵管は滑液包嚢に包まれており、卵母細胞が卵管に移入する可能性が高まります⁴。アンプラは受精の場所として同定され、発達中の胚は子宮に入る前に地峡に入る⁵。管状セグメントの直径は200〜400μmで、より長いアンプラリーおよび地峡領域の長さは約0.5〜1.0cmです⁴。卵管は発情周期の間に収縮し、アンプラと眼底は地峡よりも伸展性が高い¹。

細胞、特に分泌細胞の過剰増殖は、骨盤腔内に見出される漿液性腫瘍の前駆病変を特徴付け^る6。これらの前駆体漿液性上皮内病変は、卵管上皮においてのみ、フィンブリア領域においてのみ生じる。病変形成が、通常、優勢な細胞型が分泌型ではなく繊毛化されるこの領域に限定される理由は不明である^2,7,8。正常な生理機能に関する地域性、ならびに卵巣癌の卵管起源に対する関心の高まり9,10,11,12,13は、卵管セグメントの別個の評価の重要性を強調する。

ここで説明する方法は、解離した細胞のセグメント特異的遺伝子発現および機能のその後の下流分析のための別個の卵管セグメントの収集を詳述する。伝統的に、多くの組織は、フェノールのいずれかに続いて全RNA抽出のために処理される:クロロホルム法またはオンカラム完全抽出法;しかし、RNAの品質は維持され、記載された併用法では十分な収率が得られていることを見出した。この方法を利用すると、卵管の非常に小さな機能セグメントを、卵管全体を調査するのではなく、下流分析のために処理することができ、異なるセグメントを表す結果をマスクすることができる¹⁴。

解離したマウス卵管細胞は、フローサイトメトリーによって調査されることはめったになく、おそらくこの組織からの細胞収量が限られているためである。この問題を克服するための1つのアプローチは、細胞を解離させ、培養中で増殖させ、次いでインビトロで再分化を刺激して、下流の細胞分析に適した細胞数を得ることであった^15,16,17,18。このアプローチの限界は、培養中の時間エクスビボおよび変化した微小環境であり、どちらも遺伝子発現を変化させる可能性が高い。形態学的再分化は、無傷の動物に存在していたのと同じ転写的およびプロテオミクス的特徴を有するという仮定もある。現在の解離法は、単一細胞分化を維持しながら、異種卵管細胞集団において最多の上皮細胞数を達成するように設計した。さらに、ほとんどが非酵素的アプローチは、細胞表面タンパク質の損失を制限する可能性が高い。

プロトコル

すべての動物の取り扱いと手順は、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、米国実験動物ケア協会、米国農務省、および国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。記載された方法は、C57BL/6成体、雌マウスを利用した。全ての動物を、組織採取前に断頭により安楽死させた。

注:青色染料を使用して卵管の効率的な解剖と巻き戻しを支援するプロトコルの概要を最初の図に示します(図1)。

図1:マイクロダイセクション法の概要。 (a)左パネルは、卵巣脂肪パッドおよび卵管を取り囲む結合組織の残骸の大部分が除去された無傷の構造を示す。この後、トルイジンブルーの添加は、卵管(中央パネル)のコイルを区別するのに役立ちます。右側のパネルは、卵巣の除去後の構造を示す。(B)各セグメントの開始位置と終了位置を決定するための内部巻線を備えたコイルなし卵管。(C)使用されたセグメンテーションの漫画(縮尺に合わせて描かれていない)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 解剖面の作製

1. 歯用ワックスをペトリ皿に接着剤で貼り付け、乾燥させます(図2A)。70%エタノールで皿を消毒する。表面は解剖の準備ができています。

2.卵巣、卵管、子宮のマクロ解剖

1. 解剖の準備ができたら、解剖顕微鏡下で、歯科用ワックスを含むシャーレを、選択したコールドプラットフォーム(例えば、使用前に-20°Cに保たれたアイスパック)上に固定する(図2A)。
2. 動物の腹側表面を70%エタノールで消毒する。滅菌解剖ハサミで腹腔と骨盤腔を開き、胃腸管を片側に移動して背側双角子宮を見つけます。各子宮角を吻側にたどって、腎臓のすぐ下にある子宮脂肪パッドに包まれた各卵管と卵巣を見つけます(図2B、C)。
3. 解剖はさみを使用して、卵巣と遠位子宮角の一部がまだ取り付けられている側方卵管の両方を切除します。コイル状の卵管と卵巣にまだ取り付けられたままの角の約1〜2cmで各側方子宮角を切断する(図2D)。組織を直ちに2mLの冷間解剖培地に沈める( 材料表を参照)。

図2:卵巣のマクロ解剖と解剖のセットアップ。 卵管は、卵巣脂肪パッド(B)内の腎臓の基部にある骨盤腔内の背側に位置する。骨盤腔内の子宮分岐部(C)を見つけ、側方子宮角に沿って子宮 - 卵管 - 卵巣連続体(B)を見つける。1つの子宮角を切断し、粗い解剖によってこれらの構造を除去する。解剖台(A)の上に置き、子宮部を針(AおよびD)でデンタルワックスに貼り付ける。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

注:十分な数の子宮角をそのままにしておき、解剖台に接尾できるように卵管に取り付けてください(図2D)。

4. 滅菌した25G針で子宮組織を歯科用ワックスに貼り付け、解剖用の組織を固定します(図2A、D、および図3A)。解剖顕微鏡下で作業し、卵巣脂肪パッドと結合組織をきれいにして解剖し、卵管の明確な視覚化を可能にします(図3B)。

図3:ステップバイステップの卵管マイクロダイセクション。 残存脂肪および結合組織(A,B)を除去した後、組織(C)にトルイジンブルーを加え、次いで卵巣の可視化およびその後の除去およびチューブのアンコイル化(D−H)を容易にするために洗い流す。眼底は近位地峡および子宮 - 管接合部(UTJ)のそばに見出すことができる。メソサルピンクスで切断しながら遠位端を軽く引っ張ってコイルを解き、卵管(H)の内因性ターンを明らかにして適切なセグメンテーションのために方向付けます。 図A−C スケールバー= 500μm、 D−H スケールバー= 400μm(I)様々なセグメントの漫画(スケールに描かれていない)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. 1mLシリンジを用いて、子宮に貼り付けた卵管を1〜2滴の滅菌1%トルイジンブルー色素溶液で30秒〜1分間分注し、インキュベートする。冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)ですすぎ、すべての液体を取り除きます(図3C)。
6. コイル状の卵管から卵巣を軽く引き抜き、滑液包膜と広い靭帯で切り取り、卵管組織を損なうことなく卵巣を卵管から除去する(図3D、E)。
   注:卵巣は卵管に取り付けられていませんが、卵管で滑液包膜に包まれ(図2D)、広い靭帯 を介して 子宮の側面に接続されています。

3. 卵管の微小解剖とセグメンテーション

1. 子宮 - 管接合部(UTJ)の側方に見られる卵管の遠位、フィンブリアル端を見つける。卵管はそれ自体にコイルバックします。したがって、フィンブリアル端は近位端に対して横方向に配置することができ、卵管の巻き戻しのために方向付けるのに適切な出発点である(図3F、I)。
   1. チューブを静かに引っ張りながら、バネ状のマイクロハサミでメソサルピンクス(図3I)を切り取り、卵管のコイルを外します(図3G)。
2. コイルが外れたら、チューブを切断して、眼底、アンプラリー、および地峡領域を生成します(図3H)。
   1. 眼底内(フィンブリア端および近位茎)の切除に続いて、チューブの2回目の顕著な回転の後に切断することによってアンプラリー領域を切除する(ターン2および3つの間の切断、長さ約1cm)。最後に、残りの部分を地峡領域であるUTJに切断する(図3H)。
      注:卵管は、まっすぐな構造に完全に巻き戻されません。チューブはターンを維持します(図3H)³。アンプラリー領域に続く後続のターンに基づいて、残りのチューブをさらにアンプラリー - 地峡接合部および地峡³にセグメント化することができる。アンプラ切除後、ターン5と6の間で切断してアンプラ - 地峡接合部を得る。残りのチューブ(UTJの開始点まで6ターン)は地峡³です。
3. RNA単離のために解剖した組織セグメントを液体窒素中で直ちにスナップ凍結するか、または配向包埋および免疫組織学的分析のために各セグメントを固定および処理する。
   1. RNA抽出を進める場合は、200 μLの冷RNA抽出試薬と1:1ホモジナイズビーズミックス( 材料表を参照)を組織に加えます(ステップ5.1を参照)。

4. 卵管解離

1. 上記のステップ3.1.1から続く)上皮の最適な解離のために、スリットは、可能な限り領域(すなわち、眼底内およびアンプラ)に卵管を開き、管腔上皮を露出させる(図4A)。

図4:卵管細胞解離、パート1。 最適な細胞解離のために遠位上皮を露出させる方法を示す漫画(A)と、^1mm2 メッシュを使用する最も簡単な方法を示す画像(B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 鉗子を梃子として、フィンブリアル領域から始めて、スプリング形のはさみでチューブを縦方向にスリットします。

2. スリットオープン部分と残りの卵管をセグメント(約1〜2mmのサイズ)に細かく刻み、5mLの温かい非酵素解離緩衝液( 材料表を参照)を加え、37°Cでインキュベートする。
   1. 組織片を再懸濁し、細胞を球根ピペッターで解離させ、3分ごとに9〜10分間培養する。解離緩衝液を冷解剖培地で1:1に希釈する。
3. 遠心分離(350 x g、3分、4°C)により細胞を回収する。細胞を2mLのRBC溶解緩衝液に室温で2分間再懸濁し、次いで冷解剖培地で1:1に希釈する。
4. 遠心分離(350 x g、3分、4°C)によって細胞を収集し、5mLの冷たいプロナーゼ溶液に再懸濁する。
   1. プロナーゼ消化培地中でインキュベートし、単一の細胞懸濁液が達成されるまで(〜25〜30分)、3〜5分ごとに球根ピペッターで細胞凝集塊を再懸濁する。
      注:このステップは、プロナーゼへの不必要な過剰暴露を防止する一定の観察を可能にするために、組織培養プレートまたはフラスコ内で行うのが最善である。
5. 滅菌マクロメッシュ(ゴムバンド付きの円錐形チューブに貼り付けた1 mm x 1 mmメッシュ(図4B))に細胞を通し、解離していない残りの組織片を除去します。遠心分離(350 x g、3分、4°C)によって細胞を収集し、下流分析に適した低温培地(例えば、フローサイトメトリーのための染色に進む場合はFACS緩衝液)に再懸濁する。

5. 卵管セグメントのRNA抽出

1. ステンレスビーズミックスを使用して、レベル12のビーズブレットブレンダー組織ホモジナイザーで、4°Cで2つの間隔(それぞれ3分)の間、200μLのRNA抽出試薬中のスナップ凍結サンプルをホモジナイズします。
   注: RNA の完全性を維持するには、サンプルをスナップ凍結状態から RNA 抽出試薬に直ちに移動し、計量しないでください。
2. 室温で約5秒間卓上遠心分離機で100〜200 x g でホモジネートを短時間遠心分離し、ビーズから液体を分離した。上清を新鮮なチューブに移す。
3. ビーズにさらに200 μLのRNA抽出試薬を加えてより多くのサンプルを回収し、遠心分離(100-200 x g、5 s 、 室温)を行った。上清を組み合わせる。
   注: 上清を除去する際にビーズの持ち越しを防ぐために、小さなピペットチップ (ほとんどの p200 チップが適しています) を使用してください。
4. メーカーのガイドラインに従って、RNAを相分離して沈殿させます。代表的な試料を100%イソプロパノールで-20°Cで一晩沈殿させた(約2:1容量、イソプロパノール:水相を回収)。
5. 完全なRNA沈殿物を溶液とともにRNA結合スピンカラムに移し、9,500 x gで30秒間遠心分離 する。製造元のガイドラインに従ってカラム上で RNA を精製し、20 μL のヌクレアーゼフリー水で RNA を溶出します。マイクロボリューム分光光度計および/またはバイオアナライザーで品質/量を評価します。

結果

記載された解離プロトコールは、両方の卵管のプールを有するマウス当たり100,000〜120,000個の細胞を生じる。この方法は、多繊毛細胞の境界をそのまま残すのに十分なほど穏やかであり、多繊毛細胞と分泌細胞の区別を可能にし、消化法が脱分化を防ぐのに十分穏やかであることを確認する。図5の代表的な免疫蛍光画像は、ステップ4.2.1に続く小細胞凝集塊を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/ DPBS中で3分間固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)/トリス緩衝生理食塩水トゥイーン(BTBST)で洗浄し、懸濁液で染色した。簡単に説明すると、細胞を0.5%TritonX-100/BTBST中で室温で15分間透過処理し、BTBSTで洗浄し、20mMグリシン/ DPBS中で室温で2時間バックグラウンド蛍光を消光し、BTBSTで洗浄し、次いで5%BSA/0.1%TritonX-100/TBST中で室温で1時間ブロッキングした。次いで、細胞を一次抗体中で4°Cで一晩BTBST(マウス抗マウスオクルジン(1:2000;ウサギ抗マウスアセチル化チューブリン(1:1000))中で一晩インキュベートし、...

ディスカッション

卵管の3つのセグメントは、組織学的、形態学的、および機能的に異なっている^1,2,3。上皮は卵管の一方の端から他方の端まで大きく変化する。繊毛細胞はフィンブリア/眼底末端で優勢であり、分泌細胞は地峡領域で優勢です¹。この全体的な勾配はしばらく前から認識されていましたが、最近の研究では卵管セグメント間のより多くの区別が明らかになりました。したがって、繊毛細胞はチューブの近位端に向かって頻度が低くなるが、アンプラからアンプラ - 地峡接合部に移行するそれらの数の急激な減少(約60%から10%の繊毛)^がある3。さらに、近位および遠位セグメントにおける上皮細胞集団は、発生的に別個の系統に由来する^1,2,3。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 mm ステンレススチールビーズミックス	Next Advance	SSB05	1:1 と 1.4 mm SSB14B の混合、滅菌済み
1.4 mm のステンレススチールビーズミックス	Next Advance	SSB14B	1:1 と 0.5 mm SSB05、滅菌済み
1X ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 A、pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	冷たく滅菌された
25G ニードル	BD	305122
60 mm滅菌ペトリ皿	Corning	430166
70 μm細胞メッシュ	フィッシャーブランド	22-636-548
アジレント 真核生物 トータルRNA 6000 ピコチップキット	アジレント2100 バイオアナライザー	5067-1513
ビーズ ブレットブレンダー 組織ホモジナイザー	ネクストアドバンス	BBY24M
バイオアンライザー	アジレント2100 バイオアナライザー
ウシ血清アルブミン	シグマ アルドリッチ	A7906
コールドプレート/パック/選択の表面	N/A	N/A	-20 °解剖用C
:歯科用ワックス	Polysciences、Inc.	403
ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)/ハム's F12	Corning	10-090-CV	解剖媒体の準備:DMEM/ハム's F12、10% FBS、25 mM Hepes、1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
ファインポイント鉗子 N	/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	免疫細胞化学的検証画像
ヤギ 抗マウス IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	免疫細胞化学的検証画像
ギ 抗ウサギ IgGAlexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	免疫細胞化学的検証画像
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	免疫細胞化学的検証画像
倒立化合物顕微鏡	Keyence BZ-X700
マウス抗マウス Occludin	Invitrogen	33-1500	免疫細胞化学的検証画像
非酵素的解離バッファー	N/A		5 mM EDTA、1 g/L グルコース、0.4% BSA、1X DPBS
ナイロンマクロメッシュ 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
パラホルムアルデヒド	Sigma Aldrich	P-6148	免疫細胞化学検証画像
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold 退色防止試薬	細胞シグナル伝達技術	9071S	免疫細胞化学的検証画像: 褪色防止封入剤
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	プロナーゼ消化培地を調製する: 0.15% プロナーゼ DMEM/Ham's F12, 滅菌
ヨウ化プロピジウム	Roche	11 348 639 001	生存率検証画像
ウサギ抗マウスアセチル化チューブリン	Abcam	ab179484	免疫細胞化学的検証画像
RBC溶解バッファー	BD Biosciences 555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	テキストのオンカラム精製に利用
スプリングフォームマイクロダイセクションはさみ	Roboz Surgical	RS-5610
滅菌済み3mLバルブピペッター	Globe Scientific	137135
トルイジンブルー	Alfa Aesar	J66015	トルイジンブルー溶液を調製します:1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	免疫細胞化学的検証画像; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	免疫細胞化学的検証画像
Trizol RNA 抽出試薬	Invitrogen	15596026	RNA抽出試薬と呼ばれます。ヌセラーゼフリーの水、クロロホルム、イソプロポナールは、メーカーのガイドラインに従ってトリゾール抽出を実施するための補足に必要です