ゾヌラー繊維の粘弾性特性を決定するための生物学的調製と機械的技術

サマリー

プロトコールは、細胞外マトリックス粘弾性およびタンパク質組成または環境因子への依存性の研究のための方法を記載する。標的とするマトリックスシステムは、マウスの帯状疱疹である。この方法の性能は、野生型ゾーン状繊維の粘弾性挙動をミクロフィブリル関連糖タンパク質-1を欠損したものと比較することによって実証される。

要約

弾力性は、血管、筋肉、肺などの組織の機能に不可欠です。この特性は、主に細胞外マトリックス(ECM)、細胞および組織を一緒に結合するタンパク質メッシュワークに由来する。ECMネットワークの弾性特性がその組成にどのように関連しているか、およびECMの緩和特性が生理学的役割を果たすかどうかは、まだ完全には対処されていない問題である。課題の一部は、ほとんどのECMシステムの複雑なアーキテクチャと、ECMコンポーネントの構造を損なうことなくECMコンポーネントを分離することの難しさにあります。1つの例外は、脊椎動物の目に見られるECMシステムである帯状疱疹です。帯状突起は、レンズと眼壁との間の無細胞空間にまたがる長さ数百〜数千マイクロメートルの繊維からなる。この報告では、帯状の高度に組織化された構造を利用して、その粘弾性特性を定量化し、個々のタンパク質成分の寄与を決定する機械的技術について説明する。この方法は、レンズと帯状動脈を露出させるために固定された眼の解剖を含み、張力が監視されている間に帯状線維を均等に引き伸ばすプルアップ技術を採用する。この技術は比較的安価でありながら、特定のゾーン状タンパク質を欠いているマウスまたは加齢に伴うマウスにおけるゾーン状線維の粘弾性特性の変化を検出するのに十分な感度を有する。ここで紹介する方法は、主に眼の発達と疾患を研究するために設計されていますが、弾性ECMの粘弾性特性とイオン濃度、温度、シグナル伝達分子との相互作用などの外的要因の役割に関するより広範な疑問を探求するための実験モデルとしても役立つ可能性があります。

概要

脊椎動物の目には、網膜に画像の焦点を合わせるのに役立つ生きた光学レンズが含まれています¹。レンズは、図1Aに示すように、繊細で放射状に配向したファイバーのシステムによって光軸上に吊り下げられています。一方の端では、繊維は水晶体赤道に付着し、他方の端では毛様体の表面に付着する。それらの長さは、マウスの150μmからヒトの1mmまでの距離にまたがる。集合的に、これらの繊維は、^Zinn2の帯状突、毛様体帯、または単に帯状突起として知られている。眼の外傷、疾患、および特定の遺伝性疾患は、ゾーン線維^の完全性に影響を与え3、最終的な障害およびそれに伴う視力喪失をもたらす可能性がある。マウスでは、繊維は主にフィブリリン-2タンパク質からなるコアを有し、フィブリリン-¹⁴に富むマントルに囲まれている。帯状線維は目に特有のものですが、体内の他の場所に見られるエラスチンベースのECM線維と多くの類似点があります。後者はフィブリリン-1マントル⁵で覆われており、ゾーン状繊維⁶と同様の寸法を有する。潜在形質転換成長因子β結合タンパク質(LTBP)およびミクロフィブリル関連糖タンパク質-1(MAGP-1)などの他のタンパク質は、両方のタイプの繊維と関連して見出される⁷、⁸、⁹、^10、11。ゾーン状繊維の弾性率は0.18〜1.50MPa12、¹³、^14、15、¹⁶の範囲であり^、エラスチン系繊維(0.3〜1.2MPa)¹⁷に匹敵する。これらの構造的および機械的類似性により、ゾーン関連タンパク質の役割に関する洞察は、他のECM弾性繊維におけるそれらの役割を解明するのに役立つ可能性があると私たちは信じています。

ここで説明する方法を開発する主な目的は、遺伝性眼疾患の進行における特定のゾーンタンパク質の役割についての洞察を得ることである。一般的なアプローチは、野生型マウスにおけるゾーン状線維の粘弾性特性を、ゾーン状タンパク質をコードする遺伝子に標的変異を有するマウスの粘弾性特性と比較することである。帯状繊維の弾力力学的特性を測定するためにいくつかの方法が以前に使用されてきたが、すべてはるかに大きな動物の目のために設計されていた12,13,14,15,16。そのようなモデルは遺伝的に扱いにくい。私たちは、マウスの小さくて繊細な目により適した実験方法の開発を目指しました。

マウス帯状線維の粘弾性を評価するために開発した方法は、プルアップアッセイ^4,18と呼ばれる技術であり、図1に視覚的に要約されています。プルアップ方法と結果の分析の詳細な説明を以下に示します。まず、プロジェクトで使用された3次元(3D)印刷部品を含む装置の構成について説明します。次に、実験用の眼の取得と準備に使用されるプロトコルを詳述します。最後に、ゾーン状繊維の粘弾性特性を決定するためのデータを取得する方法について、段階的な指示を提供します。代表的な結果のセクションでは、MAGP-119を欠損したマウスからのゾーン状線維の粘弾性特性に関する我々の方法で得られた以前に未発表のデータと、年齢が一致した野生型動物から得られた対照セットを共有する。最後に、この方法の利点と限界に関する一般的な発言と、環境的および生化学的要因がECM繊維の粘弾性特性にどのように影響するかを解明する可能性のある実験の提案で締めくくります。

プロトコル

すべての動物実験は、ワシントン大学動物研究委員会によって承認され、眼科および視力研究における動物の使用に関するARVO声明を遵守しました。

1. 特殊部品の製作及び装置の構築

1. 特殊部品の製造
   1. プローブ製造。 図2Aの左パネルに示すように、ガラスキャピラリーを斜めに保持します。シガレットライターの炎を片端から約2cm置き、 図2Aの右側のパネルに示すように、端が90°曲がるまでそこに保管します。
   2. サンプルプラットフォームの製造。 図 2B に示すように、3D 描画ソフトウェアを使用して、直径 2.0、2.5、および 3.0 mm の半球状のくぼみを含む、30 x 30 x 5 mm のプラットフォームを設計します。
   3. プローブホルダーの製作。3D描画ソフトウェアを使用して、キャピラリープローブを保持するマウントを設計し、マイクロマニピュレータに取り付けます( 図2C参照)。
      注:STL形式のプラットフォーム製造およびプローブホルダー製造用のサンプル3Dファイルは、対応する著者からの要求に応じて入手できます。
   4. ネガティブレンズアセンブリ。図1Cおよび図1Dに示すように負のシリンドリカルレンズ(焦点距離-75mm、高さおよび長さ約50mm)を配置して、シャーレに流体を加えることによって生じる歪みを補正する(流体を加えると、側面から撮像したときに解剖された目の視界が歪む)。
   5. 負のレンズを 2 つのスロット付きベースのいずれかに接着します (ベース上のレンズの位置については 、図 2D を参照してください)。
   6. 残りの部品を 図 2D に示すように組み立てます。
   7. レンズがスケールの上にかろうじて浮かぶようにポストの高さを調整し、ポストホルダーのネジを締めます。
2. 装置の構成
   1. スケールに付属のロギングプログラム、顕微鏡カメラソフトウェア、および電動マイクロメータコントローラアプリケーションをコンピュータにインストールします。
   2. 電動マイクロメータをサーボモータコントローラに接続し、後者をコンピュータに接続します。モーターコントローラーアプリケーションを起動し、モーター設定を編集します。
      注:以下にリストされているモータ設定は、応力が10〜20秒の時間スケールで緩和されることが明らかになった予備実験の後に選択されました。この決定に基づいて、モータが緩和時間よりも短い時間で50μmの変位を完了できる速度と加速度を選択しましたが、サンプルの揺れを避けるために短すぎません。ここでは、約5〜10秒の変位時間を選択しました。
   3. 最大速度を 0.01 mm/s、加速度を 0.005 mm/^s2 に設定します。
   4. 検査用顕微鏡にカメラをインストールし、カメラのイメージングソフトウェアをテストします。
   5. 装置専用のベンチスペースにスケールを置きます。
   6. 3Dプリントされたプラットフォーム(ステップ1.1.2から)をペトリ皿に接着し、2〜3mmのガラスビーズを井戸の1つに加えます。ビーズが鍋の中央近くに位置するように、ペトリ皿をスケールの上に置きます。
   7. マイクロマニピュレータの手動マイクロメータを電動マイクロメータに交換してください。
   8. 2本の4~40本のネジをプローブホルダーにねじ込みます。 図1Cに示すように、プローブホルダーをマニピュレータに取り付けます。
   9. 図2Aに示すようにプローブを用意し、屈曲部を下に向けてプローブホルダーの内側に置き、ネジを締めます。
   10. マイクロマニピュレータをテーブルの上に置き、プローブの先端がプラットフォーム上のビーズの上になるようにします。マイクロマニピュレータをテーブルに貼り付けて、実験中の偶発的な動きを防ぎます。
   11. ビーズが視野の中心にあり、焦点が合うように、側面顕微鏡をテーブルの上に置きます。

2. サンプル調製とデータ取得

1. 目の固定と解剖
   1. 野生型マウスと Magp1-null動物を同一のC57/BL6J背景に維持する。生後1ヶ月または1歳のマウスを_CO2 吸入で安楽死させる。
   2. 細かい鉗子で目を取り除き、除核した球体を4%パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)中で一晩4°Cで固定します。記載されているように、固定プロセス中に眼内に15〜20mmHgの陽圧を維持する⁶。
      注:実験は、雄マウスで行われ、眼球の大きさにおける可能性のある性別関連の違いを制御する。正の圧力は、地球が膨張したままであることを保証し、レンズとゾーン状繊維によってスパンされる眼の壁との間のギャップを維持する。
   3. PBSで10分間目を洗う。眼科手術用はさみを使用し、実体顕微鏡下で作業し、視神経頭部近くの眼の壁に全層切開を行う。
   4. カットを赤道まで前方に伸ばし、次に目の赤道周囲に広げます。繊細な毛様体プロセスと関連するゾーン状繊維を惜しまないように注意してください。
   5. グローブの背面を取り外し、レンズの後面を露出させます。
   6. 鉗子を使用して解剖した目を緩衝液から取り除き、角膜を下に向けてドライタスクワイプの上に置きます。角膜をワイプの表面上にそっとドラッグして乾燥させます。
   7. 3μLのインスタント接着剤をペトリ皿の目を収容するプラットフォームウェルに加える。
   8. 接着剤の入った井戸が見えるように実体顕微鏡のステージプレートに皿を置きます。
   9. ワイプから接着剤を含む井戸の端に目を移します。次に、目を井戸に慎重にドラッグし、レンズの背面が一番上になるようにその向きをすばやく調整します。
   10. レンズの露出した側を、ドライワイプの角で優しく吸い取って乾かします。
   11. 50mmのペトリ皿の底にインスタント接着剤のダブを塗布し、それにプラットフォームを固めます。
2. 帯状粘弾性応答の測定
   1. スケールをオンにし、スケールロギングプログラムとカメラソフトウェアを起動します。ロギング・プログラムが 30 分間データを集録できることを確認してください (試行によってはそれだけ長く続く場合もあります)。
   2. サーボモータコントローラの電源を入れ、コンピュータ上のコントローラアプリケーションを起動します。ステップ 1.2.2 のメモで概説されているものと同様のモーション パラメータを使用して、コントローラが 50 μm 単位で移動するように設定されていることを確認します。
   3. 手順 1.1.1 で説明したように、キャピラリーロッドに 90° のベンドを作成します。
   4. 曲がったキャピラリーをキャピラリープローブホルダーに滑り込ませ、固定ネジを締めます。
      注: サンプルの脱水を最小限に抑えるために、手順 1 ~ 4 は、眼科解剖の前または解剖中に完了することをお勧めします。
   5. UV硬化接着剤の小さなビーズ(〜1mm)をキャピラリーの先端に加える。
   6. マニピュレーターの手動調整を使用して、キャピラリープローブの先端をレンズの中心の真上になるように動かします。UV接着剤の底部が、正面(目視検査)と側面(顕微鏡カメラを通して)から見たときにレンズの上部の中央に見えるかどうかを確認します。
   7. カメラを覗き込みながら、UV接着剤がレンズに接触し、上面の3分の1~2分の1を覆うまでプローブ先端を下げます。
   8. 低強度(〜1mW)、指向性、近視UV(380〜400nm)光源を使用して接着剤を硬化させます。
      注:これらの仕様は、タンパク質架橋を誘導する可能性を最小限に抑えながら、数秒で接着剤を硬化させるのに十分です。市販のUV接着剤ペンに付属のUV光源は、これらの仕様を満たしています。
   9. 目が少なくとも2mmの深さまで液体で覆われるまで、PBS溶液を皿に加える。
   10. シリンドリカルレンズを検査用顕微鏡の前に置き、シャーレに触れることなくできるだけ近くに置きます。
   11. ロギング・プログラムとタイマー・プログラムを同時に開始します。カメラを使用して目/プローブの写真を撮ります。
   12. 60秒後、さらに50μmの変位を開始し、その後、実験が完了するまで、すなわちすべての繊維が壊れるまで、60秒ごとに変位する。実験中のバッファー蒸発により、シグナルがベースラインレベルに戻らないことに注意してください。ステップ2.2.14で例示されているように、データ分析中に読み値のその後のドリフトを修正します。
   13. 実行が完了したら、スケールログデータを保存し、スプレッドシートと互換性のある形式(.csv形式など)にエクスポートします。実行中に収集されたレンズ画像を保存します。
   14. スプレッドシートにデータをインポートします。最初と最後のスケール読み取り値を使用して、蒸発によるバックグラウンド読み取り値の時間の経過に伴うドリフトを補間します( 図3参照)。各時点の読み取り値から補間された読み取り値を減算します。
       メモ: スプレッドシートを使用している場合は、最初のスケール読み取りの右側にあるセルに数式 = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B))))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 を入力してから、カーソルをセルの右下隅に移動し、最後のデータ値までドラッグすることで、補間を自動的に実行できます。この数式では、データが列に編成され、最初のデータ ポイントがセル B2 に表示されることを前提としています。必要に応じて、ステップ2.2.14で処理されたデータは、共著者の一人であるMatthew ^Riley4博士によって開発された準弾性粘弾性モデルで分析され得る。

結果

ここで説明するプルアップ技術は、マウスにおけるゾーン状線維の粘弾性特性を決定するための簡単なアプローチを提供する。簡単に言えば、マウス眼は、生理学的眼圧下で固定剤の注射によって最初に保存される。このアプローチは、眼の自然な膨張を維持し、繊維を適切にプリテンションした状態に保つ(予備実験により、繊維の弾性または強度を有意に変化させないことが実証された後、固定は許容できるとみなされた)。マウスの目の裏側を解剖して除去し、レンズとそれを吊り下げるゾーン状繊維を露出させる。目の前部はプラットフォームに貼り付けられ、デジタルスケールに置かれたペトリ皿の中に置かれます。次に、マイクロマニピュレータに取り付けられたガラスキャピラリーをレンズの後面に接合する。その後、レンズを50μm刻みで持ち上げ、スケール上の力を記録します。調製物の見かけの重量の減少は、繊維を伸ばす力に関する情報を提供する。各変位に続いて、約1分間持続する平衡化期間が続き、変位によって誘発される応力の緩和を観察する。最後に、マウスのゾーン状繊維の形状とアッセイの引き込み方向のために特別に設計された準線形粘弾性モデルを使用して、結果を解析します⁴

ディスカッション

ゾーンは、ファイバーが対称に配置され、光軸に沿って眼レンズを変位させることによって同じように操作できる珍しいECMシステムです。この空間はまた、細胞を破壊せずに容易にアクセスすることができ、繊維を元の状態に近い環境で研究することを可能にする。プルアップ技術は、このECMプレゼンテーションを利用して、遺伝的に扱いやすいシステムであるマウスからの繊細な繊維を操作し、それらの機械的特性を正確に定量化する。これにより、ゾーン状線維の生体力学的特性に対する主要なECMタンパク質(フィブリリン-¹¹⁸、LTBP-24、およびMAGP-1)の寄与を調べることができました。フィブリリン-1欠損マウスを解析したところ、フィブリリン-1を欠損したゾーン状線維は加齢とともに弱まり、最終的には破裂し、眼内の水晶体の変位(ヒトでは、エクトピア・レンティスとして知られる状態)につながることが明らかになった。重要なことに、水晶体脱臼は、FBN1遺伝子²⁰の変異によって引き起こされる疾患であるマルファン症候群...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1/4-20六角ネジ3/4インチ長	Thorlabs	SH25S075
1/4-20ナット	物店
3D SLA	プリンターAnycubic	Photon
4-40ネジ3/8インチ長、2	物店
毛細血管、外径1.2mmと3インチ長、フィラメントなし	WPI	1B120-3
シアノアクリレート(スーパー)接着剤	ロックタイト
デジタルスケール 0.01 gまで正確	バーニア	OHAUS Scout 220
Excel	マイクロソフト		スプレッドシート
ガスシガレットライター
検査/解剖顕微鏡	Amscope	SKU: SM-4NTP	作動距離 ~ 15 cm
マイクロマニピュレーター、エコノミー 4軸	WPI	Kite-L
電動マイクロメーター	Thorlabs	Z812B
ネガティブシリンドリカルレンズ	Thorlabs		LK1431L1-75 mm 焦点距離
シャーレ、50 mm
ポストホルダー、3 インチ	Thorlabs	PH3
ポスト、4 インチ	Thorlabs	TR4
スケール ロギング ソフトウェア	Vernier	LoggePro
サーボモーター	コントローラーThorlabsKDC101
サーボモーターコントローラーソフトウェア	ThorlabsAPT
スロットベース、1	Thorlabs	BA1S
スロットベース、	ThorlabsBA2
マニピュ	ラーWPI	M-10USB
カメラ	Amscope	SKU:MD500
UV活性化接着剤とUVソース	Amazon