プロトコールは、細胞外マトリックス粘弾性およびタンパク質組成または環境因子への依存性の研究のための方法を記載する。標的とするマトリックスシステムは、マウスの帯状疱疹である。この方法の性能は、野生型ゾーン状繊維の粘弾性挙動をミクロフィブリル関連糖タンパク質-1を欠損したものと比較することによって実証される。
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この記事について
サマリー
要約
弾力性は、血管、筋肉、肺などの組織の機能に不可欠です。この特性は、主に細胞外マトリックス(ECM)、細胞および組織を一緒に結合するタンパク質メッシュワークに由来する。ECMネットワークの弾性特性がその組成にどのように関連しているか、およびECMの緩和特性が生理学的役割を果たすかどうかは、まだ完全には対処されていない問題である。課題の一部は、ほとんどのECMシステムの複雑なアーキテクチャと、ECMコンポーネントの構造を損なうことなくECMコンポーネントを分離することの難しさにあります。1つの例外は、脊椎動物の目に見られるECMシステムである帯状疱疹です。帯状突起は、レンズと眼壁との間の無細胞空間にまたがる長さ数百〜数千マイクロメートルの繊維からなる。この報告では、帯状の高度に組織化された構造を利用して、その粘弾性特性を定量化し、個々のタンパク質成分の寄与を決定する機械的技術について説明する。この方法は、レンズと帯状動脈を露出させるために固定された眼の解剖を含み、張力が監視されている間に帯状線維を均等に引き伸ばすプルアップ技術を採用する。この技術は比較的安価でありながら、特定のゾーン状タンパク質を欠いているマウスまたは加齢に伴うマウスにおけるゾーン状線維の粘弾性特性の変化を検出するのに十分な感度を有する。ここで紹介する方法は、主に眼の発達と疾患を研究するために設計されていますが、弾性ECMの粘弾性特性とイオン濃度、温度、シグナル伝達分子との相互作用などの外的要因の役割に関するより広範な疑問を探求するための実験モデルとしても役立つ可能性があります。
概要
脊椎動物の目には、網膜に画像の焦点を合わせるのに役立つ生きた光学レンズが含まれています1。レンズは、図1Aに示すように、繊細で放射状に配向したファイバーのシステムによって光軸上に吊り下げられています。一方の端では、繊維は水晶体赤道に付着し、他方の端では毛様体の表面に付着する。それらの長さは、マウスの150μmからヒトの1mmまでの距離にまたがる。集合的に、これらの繊維は、Zinn2の帯状突、毛様体帯、または単に帯状突起として知られている。眼の外傷、疾患、および特定の遺伝性疾患は、ゾーン線維の完全性に影響を与え3、最終的な障害およびそれに伴う視力喪失をもたらす可能性がある。マウスでは、繊維は主にフィブリリン-2タンパク質からなるコアを有し、フィブリリン-14に富むマントルに囲まれている。帯状線維は目に特有のものですが、体内の他の場所に見られるエラスチンベースのECM線維と多くの類似点があります。後者はフィブリリン-1マントル5で覆われており、ゾーン状繊維6と同様の寸法を有する。潜在形質転換成長因子β結合タンパク質(LTBP)およびミクロフィブリル関連糖タンパク質-1(MAGP-1)などの他の....
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プロトコル
すべての動物実験は、ワシントン大学動物研究委員会によって承認され、眼科および視力研究における動物の使用に関するARVO声明を遵守しました。
1. 特殊部品の製作及び装置の構築
- 特殊部品の製造
- プローブ製造。 図2Aの左パネルに示すように、ガラスキャピラリーを斜めに保持します。シガレットライターの炎を片端から約2cm置き、 図2Aの右側のパネルに示すように、端が90°曲がるまでそこに保管します。
- サンプルプラットフォームの製造。 図 2B に示すように、3D 描画ソフトウェアを使用して、直径 2.0、2.5、および 3.0 mm の半球状のくぼみを含む、30 x 30 x 5 mm のプラットフォームを設計します。
- プローブホルダーの製作。3D描画ソフトウェアを使用して、キャピラリープローブを保持するマウントを設計し、マイクロマニピュレータに取り付けます( 図2C参照)。
注:STL形式のプラットフォーム製造およびプローブホルダー製造用のサンプル3Dファイルは、対応する著者からの要求に応じて入手できます。
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結果
ここで説明するプルアップ技術は、マウスにおけるゾーン状線維の粘弾性特性を決定するための簡単なアプローチを提供する。簡単に言えば、マウス眼は、生理学的眼圧下で固定剤の注射によって最初に保存される。このアプローチは、眼の自然な膨張を維持し、繊維を適切にプリテンションした状態に保つ(予備実験により、繊維の弾性または強度を有意に変化させないことが実証された後、固定は許容できるとみなされた)。マウスの目の裏側を解剖して除去し、レンズとそれを吊り下げるゾーン状繊維を露出させる。目の前部はプラットフォームに貼り付けられ、デジタルスケールに置かれたペトリ皿の中に置かれます。次に、マイクロマニピュレータに取り付けられたガラスキャピラリーをレンズの後面に接合する。その後、レンズを50μm刻みで持ち上げ、スケール上の力を記録します。調製物の見かけの重量の減少は、繊維を伸ばす力に関する情報を提供する。各変位に続いて、約1分間持続する平衡化期間が続き、変位によって誘発される応力の緩和を観察する。最後に、マウスのゾーン状繊維の形状とアッセイの引き込み方向のために特別に設計された準線形粘弾性モデルを使用して、結果を解析します4
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ディスカッション
ゾーンは、ファイバーが対称に配置され、光軸に沿って眼レンズを変位させることによって同じように操作できる珍しいECMシステムです。この空間はまた、細胞を破壊せずに容易にアクセスすることができ、繊維を元の状態に近い環境で研究することを可能にする。プルアップ技術は、このECMプレゼンテーションを利用して、遺伝的に扱いやすいシステムであるマウスからの繊細な繊維を操作し、それらの機械的特性を正確に定量化する。これにより、ゾーン状線維の生体力学的特性に対する主要なECMタンパク質(フィブリリン-118、LTBP-24、およびMAGP-1)の寄与を調べることができました。フィブリリン-1欠損マウスを解析したところ、フィブリリン-1を欠損したゾーン状線維は加齢とともに弱まり、最終的には破裂し、眼内の水晶体の変位(ヒトでは、エクトピア・レンティスとして知られる状態)につながることが明らかになった。重要なことに、水晶体脱臼は、FBN1遺伝子20の変異によって引き起こされる疾患であるマルファン症候群.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、NIH R01 EY029130 (S.B.) および P30 EY002687 (S.B)、R01 HL53325 および Ines Mandl Research Foundation (R.P..M)、Marfan Foundation、および Washington University の眼科および視覚科学科 (Research to Prevent Blindness) からの無制限の助成金によって支援されました。J.R.はまた、このプロジェクトを支援するために保健薬科大学から助成金を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1/4-20六角ネジ3/4インチ長 | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20ナット | 物店 | ||
| 3D SLA | プリンターAnycubic | Photon | |
| 4-40ネジ3/8インチ長、2 | 物店 | ||
| 毛細血管、外径1.2mmと3インチ長、フィラメントなし | WPI | 1B120-3 | |
| シアノアクリレート(スーパー)接着剤 | ロックタイト | ||
| デジタルスケール 0.01 gまで正確 | バーニア | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | マイクロソフト | スプレッドシート | |
| ガスシガレットライター | |||
| 検査/解剖顕微鏡 | Amscope | SKU: SM-4NTP | 作動距離 ~ 15 cm |
| マイクロマニピュレーター、エコノミー 4軸 | WPI | Kite-L | |
| 電動マイクロメーター | Thorlabs | Z812B | |
| ネガティブシリンドリカルレンズ | Thorlabs | LK1431L1-75 mm 焦点距離 | |
| シャーレ、50 mm | |||
| ポストホルダー、3 インチ | Thorlabs | PH3 | |
| ポスト、4 インチ | Thorlabs | TR4 | |
| スケール ロギング ソフトウェア | Vernier | LoggePro | |
| サーボモーター | コントローラーThorlabsKDC101 | ||
| サーボモーターコントローラーソフトウェア | ThorlabsAPT | ||
| スロットベース、1 | Thorlabs | BA1S | |
| スロットベース、 | ThorlabsBA2 | ||
| マニピュ | ラーWPI | M-10USB | |
| カメラ | Amscope | SKU:MD500 | |
| UV活性化接着剤とUVソース | Amazon |
参考文献
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn's zonule. Progress i....
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再版と許可
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