組換え四肢は、細胞分化の過程と胚シグナルの影響下でのパターンの生成を研究することを可能にする強力な実験モデルである。このプロトコルは、異なる生物から得られた他の細胞型に適応可能なニワトリ四肢 - 中胚葉系細胞を有する組換え四肢を生成するための詳細な方法を提示する。
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この記事について
サマリー
要約
細胞分化は、発達中の組織および器官の確立中に異なる特殊な細胞型の形成につながる細胞コミットメントの微調整されたプロセスである。このプロセスは成人期に積極的に維持されます。細胞分化は、器官の発生および恒常性維持の間の進行中のプロセスである。細胞分化の初期段階を理解することは、形態形成などの他の複雑なプロセスを知るために不可欠です。したがって、組換えニワトリ四肢は、胚パターニングシグナル下での細胞分化およびパターン生成の研究を可能にする実験モデルである。この実験モデルは 、in vivo 環境を模倣しています。それは初期の四肢の芽から得られた外胚葉性のカバーに再凝集した細胞を組み立てる。その後、外胚葉は、その発達を可能にするために、ひよこの胚受容体に移植および移植される。このアッセイは、主に中胚葉性四肢芽細胞を評価するために使用された。しかし、それは他の生物からの他の幹または前駆細胞に適用することができる。
概要
脊椎動物の四肢は、細胞分化、細胞増殖、細胞死、パターン形成、および形態形成を研究するための手ごわいモデルである1,2。発生中、四肢は側板中胚葉1に由来する細胞から膨らみとして出現する。四肢芽は、外胚葉で覆われた中胚葉系細胞の中心核からなる。この初期の構造から、丸ごと整った四肢が出現する。四肢の蕾が生じた後、(1)近位 - 遠位軸([PD]肩から指へ)、(2)背腹側軸([DV]手の甲から手のひらまで)、および(3)前後軸([AP]親指から指へ)の3つの軸が認識される。近位 - 遠位軸は、四肢芽の遠位先端に位置する特殊な外胚葉である頂端外胚葉隆起(AER)に依存する。AERは、伸長、生存維持、増殖、およびシグナル2,3を受け取る細胞の未分化状態に必要である。一方、偏光活性ゾーン(ZPA)は前後パターニング4を制御し、背側および外胚葉は背側腹部パターニング7、8を制御する。3次元パターニングの統合は、これら3つの軸5間の複雑なクロストークを意味する....
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プロトコル
この研究は、メキシコ国立オートノーマ大学(UNAM、メキシコ、メキシコ)の実験動物の世話と使用のための治験審査委員会によってレビューされ、承認されました。このプロトコルの一般的なステップの概略フローチャートを 図1Aに示す。
1. 胚の孵化と生存率の決定
- 受精した鶏の卵を38°C、相対湿度60%で約3日半孵化させ、22HH段階に達するまで(Hamilton and Hamburger, 1951による)16。
注:受精したての鶏卵は、15°Cで最大1週間保存できます。- 受精卵を孵化させるには、尖った面を下にして卵を加湿インキュベーターに入れます。発達中の胚が卵殻膜に付着するのを防ぐために必要なので、孵卵中に卵を回転させる。
注:受精鶏の卵は地元の農場から入手することができます。受精したホワイトレグホーン鶏の卵は、一般的に後期胚の羽毛の色素沈着を避けるために使用されています。(1)四肢中胚葉細胞、(2)四肢外胚葉、および(3)RLを移植するドナー胚の3つの構造を得るために、十分な卵子を別々に孵化させることを検討してください。
- 受精卵を孵化させるには、尖った面を下にして卵を加湿インキュベーターに入れます。発達中の胚が卵殻膜に付着するのを防ぐために必要なので、孵卵中に卵を回転させる。
- 3日半のインキュベーションの後、インキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールで綿棒で拭き取り、風乾させる。 ....
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結果
よくできた組換え四肢の認識
移植後、操作された胚をインキュベーターに戻し、RLが発達するようにした。インキュベーション時間は、実験の要件と相関していた。それにもかかわらず、RLは移植の12時間後に容易に区別することができる。移植が適切であったかどうかを決定するために、RLはドナー胚の中胚葉壁に確実に付着した隆起として観察された(図2A)。それどころか、細胞生存率および/または移植片のいずれかが失敗したかどうかにかかわらず、RLは中胚葉壁から剥離したか、または大まかな形態を示した(図2B)。
組換え四肢の形態学的およびパターニング検査
形態学的検査のために、RLをアルシアンブルー17 で染色し、骨格要素の形成およびそれらのパターニングを観察した。処置中にRLを逃さないようにドナー胚の体幹全体を染色することが推奨される(
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ディスカッション
一般に、RLプロトコルは、(1)胚のインキュベーション、(2)外胚葉を埋める四肢中胚葉細胞の取得、(3)外胚葉の取得、(4)外胚葉カバーの内部に中胚葉細胞を組み立てる、および(5)充填された外胚葉の宿主胚への移植の5つのステップに分けることができる。RL 手法の主な制限は、長くて詳細なプロトコルであり、適切に実行するために忍耐を必要とする多くの重要なポイントがあります。プロトコルを正常に完了するには、重要な瞬間を特定する必要があります。中胚葉系細胞の調達中、細胞の完全性および生存率は不可欠である。細胞死は適切なRL発達を妨げる。同様の静脈において、中胚葉系細胞と外胚葉系細胞との間の相互作用を保証するために、正しい外胚葉操作が必要である。外胚葉が詰め込まれるとき、中胚葉系細胞はAERの下の遠位外胚葉にできるだけ近づかなければならない。中胚葉系および外胚葉系の両方の調達にとって、ドナー胚の発生段階も重要である。中胚葉系細胞は、その発達段階に応じて差次的に応答すると考える必要があります。ただし、現像段階は実験要件に応じて自由に選択することができる。それでも、外胚葉の取得を容易にし、細胞の完全性とシグナル伝達を維持するために、22HH期を維持す.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もありません。
謝辞
図2の画像についてはエステファニア・ガライ=パチェコに、アートワークについてはマリア・ヴァレリア・キマル=モンテス・デ・オカに感謝します。この研究は、JC-Mに授与されたメキシコ国立自治大学(DGAPA)と、JC-Mに授与されたConsejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [助成金番号1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]によって支援されました。JC M-Lは、Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)からポスドクフェローシップを授与されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アルシアンブルー8GX | シグマ | A5268 | |
| 付きスリットナイフ | コン | 2.75mmDB | |
| 鈍い鉗子 | ファインサイエンスツール | 11052-10 | |
| ラゲナーゼIV型 | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | シグマ | D5796 | |
| 卵インキュベーター | Incumatic1000 | ||
| ウシ胎児血清 | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical Forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| ペトリ皿 | ネスト | 705001 | |
| ピペット | crmglobe | PF1016 | |
| 実体顕微鏡 | ツァイス | ステミ DV4 | |
| テープ | NA | NA | |
| トリプシン 豚 | メルク | 9002 07-7 | |
| タングステン針 | GoodFellow | E74-15096/01 |
参考文献
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al.
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再版と許可
