アテローム性動脈硬化症モデル動物における粒子状物質曝露時の心筋虚血の悪化

サマリー

このプロトコルは、アテローム性動脈硬化症を伴う心筋虚血を悪化させる粒子状物質(PM)への曝露を伴う複合動物モデルについて説明しています。

要約

大気汚染(特に粒子状汚染)によって引き起こされる健康問題は、特に心血管疾患患者の間でますます注目を集めており、複雑な障害を悪化させ、予後不良を引き起こします。単純な心筋虚血(MI)または粒子状物質(PM)曝露モデルは、複数の原因を持つ疾患のそのような研究には適していません。ここでは、PM曝露、アテローム性動脈硬化症、心筋虚血を組み合わせた複合モデルを構築する方法について説明した。アテローム性動脈硬化症を発症するためにApoE^−/− マウスに高脂肪食を16週間与え、PMの肺曝露をシミュレートするためにPM標準懸濁液の気管点滴を行い、最後の曝露から1週間後に左前下行冠状動脈を結紮した。PMの気管点滴は、実験のコストを大幅に削減しながら、急性肺曝露をシミュレートできます。非侵襲的な気管挿管と新しい補助拡張装置を備えた古典的な左前下行動脈結紮術は、動物の生存率を確保し、手術の難しさを軽減することができます。この動物モデルは、大気汚染によって悪化した心筋梗塞の患者の病理学的変化を合理的にシミュレートすることができ、複数の原因を持つ疾患を含む研究に関連する動物モデルの構築のための参考となる。

概要

大気汚染は、高い全死因死亡率と関連しており、水質汚染、土壌汚染、および職業暴露の合計よりも病気の重大な負担に寄与しています¹。WHOの報告によると、屋外の大気汚染により、2016年に世界中の都市部と農村部の両方で420万人が早期死亡しました²。世界中の人々の91%が、大気質がWHOのガイドラインの制限を超える場所に住んでいます²。さらに、微小粒子状物質(PM)(直径≤2.5μm、_PM2.5)は、世界の公衆衛生³、特に低所得国および中所得国の都市に住む人々にとって、最も重大な大気汚染の脅威として認識されています。

心血管疾患に対する大気汚染の悪影響はもっと注目に値する。以前の研究では、PMが心血管疾患(CVD)のリスク増加につながることが示されています⁴。高濃度の超微粒子に数時間さらされると、心筋梗塞による死亡率が増加する可能性があります。心筋梗塞の既往歴のある人にとって、超微粒子への曝露は再発のリスクを大幅に高める可能性があります⁵。さらに、PM曝露がアテローム性動脈硬化症の進行を加速することは一般に認められています⁶。

医学研究では、適切な動物モデルを選択することが重要です。単純性アテローム性動脈硬化症動物モデル⁷、心筋虚血動物モデル⁸、およびPM曝露動物モデル⁹が既に存在する。ApoE^−/−(アポリポタンパク質Eノックアウト)マウスは、アテローム性動脈硬化症研究で使用される伝統的なマウスモデルである。ApoE-^/-マウスの血漿リポタンパク質を除去する能力は著しく損なわれています。.高脂肪食は重度のアテローム性動脈硬化症を引き起こし、ヒトで観察されるアテローム性動脈硬化症の食事依存性に似ています⁷。左前下行冠動脈(LAD)の結紮は、虚血性イベントを誘発する古典的な方法です^8、10。気管注入は多くの研究で使用されており、より優れたシミュレーションと低コストのために曝露モデル^11,12から際立っています。

しかし、単一疾患の動物モデルには、科学的研究において大きな限界があります。単にLAD結紮によって誘発される心筋虚血は、実際の状況ではシミュレートされていません。自然状態では、心筋虚血は通常、プラーク破裂および冠状動脈の閉塞によって引き起こされる¹³。虚血性心筋症の患者は通常、アテローム性動脈硬化症の基本病変を有する¹³。体内には異常な脂質代謝と炎症反応もあります¹⁴。したがって、物理的要因または自然条件下で引き起こされる虚血は、異なる病理学的症状を有する。既存の研究では、アテローム性動脈硬化症を伴う心筋虚血モデルにおける梗塞および炎症がより重症であることが示されている^15,16。PM曝露は、炎症および酸化ストレスを誘発することにより、アテローム性動脈硬化症および心筋虚血をさらに悪化させる可能性がある¹。通常、自然状態では3つの要因が共存するため、複合モデルを使用することで実際の状況をより適切にシミュレートできます。

このプロトコルは、アテローム性動脈硬化症(AS)およびPM急性曝露を組み合わせた心筋虚血(MI)の動物モデルの開発を記載している。ApoE^−/− マウスに、アテローム性動脈硬化症を誘発するために高脂肪食を与えた。PMの肺曝露は、気管を通してPM懸濁液を滴下することによって模倣された。マウスにおけるLADの結紮は、心筋虚血を誘発するために使用された。これらの方法を組み合わせて最適化し、病状をよりよくシミュレートし、動物の生存率を向上させました。大きな露光ユニットやガス麻酔器が不要で、実験が簡単です。このモデルは、大気汚染におけるPM曝露がアテローム性動脈硬化症および虚血性心筋症に与える影響を研究し、そのような複雑な要因を持つ疾患を治療するために開発された新薬の研究を行うために使用できます。

プロトコル

ここに記載されているすべての動物活動は、中国中国医学科学院の中国マテリアメディカ研究所の動物倫理委員会によって承認されました。6〜8週齢の雄のApoE-/-マウス(C57BL ^/ 6バックグラウンド)を研究に使用しました。

1. 実験準備

1. トリブロモエタノール麻酔薬(15 mg / mL)を調製する:0.75 gのトリブロモエタノールを1 mLのtert-アミルアルコールに溶解します( 材料の表を参照)。完全に溶解した後、滅菌生理食塩水で50mLに希釈する。溶液を滅菌容器に4°Cで保存し、光にさらさないでください。
   注:このプロトコルでは、動物の麻酔回復時間と生存率を最適化するためにトリブロモエタノールを使用しました。麻酔レジメンを選択するときは、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。
2. PM懸濁液を調製する:10mLの遠沈管で5mgのDPM(ディーゼル粒子状物質、 材料の表を参照)を測定します。5 mLの生理食塩水を加え、チューブを逆さまにしてよく混ぜます。パラフィンフィルムを使用してチューブをシールし、超音波洗浄機に2〜3時間(40KHz、80w)入れて超音波破壊します。
   注意: 懸濁液は均質で、粒子が凝集していない必要があります。使用前によく振ってください。

2.マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の誘導

1. マウスに高脂肪食(卵黄粉末10%、ラード10%、ステロール1%、維持飼料79%、 材料表参照)を12週間与えます。
2. アテローム性動脈硬化症の進行を推定するには、2〜3匹のマウスを無作為に選択し、超音波画像または直接解剖学的観察によって大動脈弓にプラークがあるかどうかを確認します¹⁷。
   注:解剖学的観察のために、動物は無作為抽出によって選択され、麻酔後に安楽死させた。その後、胸腔が開き、血管が直接視覚化されました。超音波画像診断ではすべてのプラークが検出されない場合があるため、解剖学的観察は通常、より信頼性が高くなります。
3. アテローム性動脈硬化症が形成されたと判断したら、次のステップのためにマウスを準備します。

3.口腔気管挿管と粒子状物質の急性暴露

注:PMは、12週間の高脂肪摂食の後、週に1回、4週間曝露され、継続的に高脂肪食が与えられます。

1. 上端から1.5 cmを固定する輪ゴムで解剖板( 材料表を参照)を準備します。解剖板をテーブル平面から60°の角度で固定します。
2. 腹腔内注射によるトリブロモエタノール麻酔薬(体重10 gごとに0.1 mL)を使用してマウスを麻酔します。2〜3分後、マウスを反転させて、直進反射があるかどうかを確認します。つま先をつまんで鎮静を確認します。目に滅菌潤滑剤を落とします。
3. 解剖板をアルコールワイプで消毒します。
4. 麻酔をかけたマウスをボード上の仰臥位に置き、上顎切歯を輪ゴムに引っ掛けます。
5. フレキシブルパイプ付きの小さなLEDスポットライト( 材料表を参照)を使用します。腋窩線の中点付近にある気管に光を集中させます。
6. 小さな滅菌綿棒をマウスの口に入れ、綿棒を転がして舌を突き出します。
7. 舌を持ってゆっくりと引き上げると、口腔、咽頭、気管が同じ縦方向に作られます。気管の入り口である声門は、呼吸ごとに開閉する明るいスポットとして表示されます。
8. 舌をそっと持ち続けます。声門を狙ってカニューレ(22G)をマウスの気管に挿入し、カニューレを気管に挿入した後に針芯を引き抜きます。
9. 少量の生理食塩水を入れたピペットガンを使用して、チューブがイタチに正しく入っているかどうかをテストします。チューブが正しい位置にある場合、ピペットガンの液柱は呼吸ごとに跳ね返ります。
10. 50 μLのDPM懸濁液(ステップ1.2で調製)をピペットガンでチューブに滴下します。懸濁液は、呼吸中にマウスの肺に自然に吸入されます。
    注:スムーズな呼吸を確保するには、マウスにDPM懸濁液を2倍(1回25 μL)10秒間隔で投与することをお勧めします。
11. PM曝露後にペットの留置針を取り外します。マウスが意識を取り戻すまで(10〜20分)、マウスが加熱パッドに留まるのを待ってから、ホームケージに戻します。

4.冠動脈結紮術

注:心筋虚血モデリング手術(冠状動脈結紮術)は16^週目に 行われます。

1. 手術器具を準備します。オートクレーブ処理後、すべての手術器具を密閉された器具箱に保管してください。手術前に75%アルコールに20〜30分間浸します。
2. 手術プラットフォームを構築します。適切なプラットフォーム傾斜を実現するには、細胞培養皿カバー(150 mm x 25 mm)を使用します。0〜0個のシルク(長さ10〜15 cm)を半分に折り、テープを使用して糸の端を傾斜したプラットフォームの上部に取り付けて、サスペンションループを作成します。
3. ステップ3.2に記載の手順に従ってマウスを麻酔する。
   注:各トリブロモエタノール投与の間に1週間の間隔を確保する必要があります。.
4. プラットフォームをアルコールワイプで消毒します。
5. マウスを挿管プラットフォームの仰臥位に置き、手順4.2で説明されているサスペンションループに上顎切歯を引っ掛けます。尾、手足、ひげをテープで留めます。
6. 手術前に左胸の毛と隣接する右胸の一部を除毛クリームで取り除きます。
7. ステップ3.4〜3.8に記載の手順に従ってマウスに口腔気管挿管を行う。
8. ペットの留置針を動物用人工呼吸器とリンクします( 資料表を参照)。人工呼吸器の設定:呼吸数-120回/分;吸入/呼吸比 - 1:1.1。一回換気量 - 1.7 mL。
9. 消毒するためにヨードフォアとアルコールで皮膚を拭いてください。
10. 心を露出します。眼科用ハサミで皮膚を0.5〜1cmカットし、筋肉(胸筋表在筋と前鋸筋)を支えて肋骨を露出させます。眼科用ピンセット(フック付き)で肋骨をクランプしてから、3番目の肋間腔に小さな切り込みを入れます( 資料表を参照)。自家製の胸を開く道具で手術窓を作ります。
    注:皮膚の切り傷は、剣状突起と腋窩線の約3分の1にあります。
11. 心膜を裂きます。次に、手順4.11〜4.14に従ってLADを結紮することができます。
    注意: 肺葉が視界を遮っている場合は、小さな滅菌綿棒を使用して心臓の後ろに押します。
12. まず、LADを見つけます。
13. 微小血管止血鉗子を使用して、滅菌6-0シルク縫合糸を針で保持します( 材料の表を参照)。冠状動脈が位置する領域の2 mm幅の心筋に絹を通します。
    注:大きな術中出血を引き起こす可能性のあるLADのみを結紮しようとしないでください。
14. 組織の破損を防ぐために、結紮糸組織と心筋組織の間に滅菌5-0シルクの短い部分を置きます。
15. LADとその周りの心筋の小さな束をしっかりと結びます。結紮は、左心室(LV)の前壁が青白くなると成功したと見なされます。心電図装置を接続すると、STセグメントの上昇を同時に観察できます。
16. 胸から空気をそっと絞り出します。肋間筋と皮膚を滅菌5-0シルクで順次縫合します。
    注意: 胸から空気を絞り出すには、肺拡張の瞬間に胸を閉じ、人差し指と中指を使用して中央の胸郭をそっと圧迫し、最後のステッチを超えて空気を逃がします。注射器は胸部ガスを抽出するためにも使用できます。
    注:マウスは目を覚ましているときに絹をかじる可能性があるため、単純な中断縫合をお勧めします。

5.回復

1. 手術後にすべての血痕をきれいにするか、マウスは他の人に攻撃されます。
2. マウスを横横臥位の加熱パッドに置きます。麻酔から回復するまで、マウスの兆候を5〜20分間継続的に監視します。監視時間は体の状態によって異なります。
   注:マウスは横臥位で呼吸が楽になります。
3. 右反射が回復したら、マウスを食物と水のボトルを入れた加熱パッド上の回復ケージを掃除に移します。マウスの生存を確実にするために15〜30分間監視し続ける。マウスが完全に自律的に動く前に、マウスを他の人から遠ざけてください。
4. 創傷感染を防ぐために、所望の用量(1,00,000〜1,50,000 U / kg)に従ってペニシリンナトリウムを筋肉内に注射する。詳しくは、投与量換算の医薬品表示をご覧ください。
5. マウスをホームケージに戻します。サンプル収集の前に、次の24時間監視を続けてください。長期実験のために鎮痛薬を投与する。

結果

冠動脈結紮術の24時間後にマウスを安楽死させ、麻酔後に採血した。マウスをトリブロモエタノールで麻酔し(ステップ3.2に従って)、血液サンプルを眼窩後洞から採取した。心臓を採取し、虚血の程度を2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色により調べた (図1)。TTCがコハク酸デヒドロゲナーゼと反応すると正常組織は赤色に変わりますが、虚血組織はデヒドロゲナーゼ活性の低下により淡いままです¹⁸。MI + PMグループの心臓は、MIグループの心臓よりも大きな梗塞領域を持っています。

図2 は、オイルレッドO染色^17、19による大動脈内のプラークを示す。油赤色Oは、組織¹⁷中の中性脂肪等の中性脂肪を精密に着色するこ...

ディスカッション

複合動物モデルの確立は、単一のMIモデルとはわずかに異なります。高い生存率を維持することは、複合モデルの開発において困難です。ApoE-^/- マウスのアテローム性動脈硬化症の重症度は、高脂肪摂食時間⁷の延長とともにより重症化し、マウスの衰弱は死亡率の増加につながります。そのため、実験中のマウスの状態を継続的にモニタリングし、実験のニーズに合わせてアテローム性動脈硬化症を誘発する時間を調整する必要があります。

PM曝露は、マウスの生存率にほとんど影響を与えない可能性がある。しかし、気管挿管を繰り返すと、マウス²⁰に口腔内出血と浮腫を引き起こし、その後の実験の難しさが増します。したがって、挿管プロセスを熱心に練習する必要があります。できるだけ少ない試行で正しい位置を見つけるようにしてください。この実験では長い期間が必要なため、マウスの長い切歯を短くする必要があります。マウスの長い切歯の剪定は、気管内挿管を含む手術中に避ける必要があります。さもなければ、鋭い切歯はマウスの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2,2,2-トリブロモエタノール	Sigma-Aldrich	T48402
75% アルコール消毒剤
動物用人工呼吸器	上海アルコット バイオテクノロジー	ALC-V8S
綿棒
滅菌 赤ちゃん			滅菌済み 直径約 3 mm
培養皿	コーニング	430597	150 mm x 25 mm
ディーゼル粒子状物質	国立標準技術研究所	1650b
解剖ボード			約 25 x 17 cm。解剖板は、マウス
		高脂肪食	処方箋:卵黄粉末10%、ラード10%、ステロール1%、メンテナンスフィード79%
ドフォア消毒剤
LEDスポットライト			5 V、3 W、ホースとクランプ付き
医療用シルクヤーンボール	上海医療縫合針工場有限公司	-	0-0
医療用テープ	3M	1527C-0
マイクロ血管止血鉗子	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	W40350
ニードルホルダー	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JC32010
生理食塩水
眼科用ハサミ	Shanghai Medical Instruments(Group)Ltd.、Corp.外科用器具工場	Y00040
科用ピンセット、10cm、湾曲、フック付き	Shanghai Medical Instruments(Group)Ltd.、Corp.外科用器具工場	JD1080
眼科用ピンセット、10cm、湾曲、歯付き	Shanghai Medical Instruments(Group)Ltd.、Corp.外科用器具工場	JD1060
ピペットチップ	Axygen	T-200-Y-R-S	0-200 μL
ピペット	エッペンドルフ	3121000074	100 uL
安全ピン			長さ約 4.5 cm 、胸部開口ツールを作るため
小動物 I.V. Cannulas	Baayen ヘルスケア 蘇州	BAAN-322025	I.V カテーテル 22FG x 25 MM
糸付き縫合針	上海医療縫合針工場 Co., Ltd.	-	6-0、
糸付きナイロンライン縫合針	JinHuan Medical	F503	5-0
シリンジ			1 mL
Tert-アミルアルコール
ズームステレオ顕微鏡	Mshot	MZ62

用綿棒 用の同じサイズの木製ボードと交換することができますヨー眼